王 娜，王 越，王夢鴿，曹小九，張智輝，張國俊

肺癌是最常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率均較高[1]。肺腺癌是肺癌最常見的病理分型之一，具有起病隱匿、早期癥狀不明顯的特點，發(fā)現(xiàn)時多處于中晚期，5年生存率較低[2]。探討肺腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制對肺腺癌早期診斷和中晚期治療具有重要臨床意義。長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA, lncRNA)屬于內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，可在表觀遺傳學水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平等多個層次調(diào)控下游基因的表達，參與細胞分化、代謝、增殖、凋亡等基礎生命活動[3]。近年研究表明，lncRNA在胃癌、肝癌、腎癌等多種腫瘤中表達上升或降低，與腫瘤的發(fā)生和進展相關(guān)[4-5]。越來越多的lncRNA被證實可調(diào)控肺腺癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移，其表達水平與肺腺癌病理分期和預后相關(guān)[6-7]。本組前期研究顯示lncRNA在肺腺癌組織中低表達，提示LRRC77P可能是肺腺癌發(fā)生的相關(guān)因子。LRRC77P是由434個核苷酸組成的lncRNA，目前未見相關(guān)的文獻報道。本文檢測LRRC77P在肺腺癌組織和細胞系中的表達，觀察其對肺腺癌細胞生物學特性的影響，旨在探討LRRC77P在肺腺癌細胞中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料收集2017年3月～2019年7月鄭州大學第一附屬醫(yī)院收治的67例肺腺癌手術(shù)切除肺腺癌組織和對應癌旁組織，術(shù)后立即置于液氮中保存，所有標本均經(jīng)病理活檢證實為肺腺癌或癌旁組織。其中男性39例，女性28例，平均年齡(61.32±8.41)歲。病理分期：Ⅰb期29例、Ⅱa期23例、Ⅱb期15例、Ⅲa期10例。本實驗經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞與主要試劑正常肺泡上皮細胞(HPAEpiC)和肺腺癌細胞系(H1299、H1975、H1650、HCC827、A549)購自中國科學院上海細胞生物所。陰性對照慢病毒和載有LRRC77P序列的慢病毒購自上海吉瑪公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國HyClone公司。Transwell小室購自美國康寧公司。熒光實時定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)試劑盒購自大連寶生物公司。引物購自武漢擎科生物公司。四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazol tetrazolium, MTT)試劑盒、二甲基亞砜購自武漢華美生物公司。一抗β-tubulin、PCDH10、p-PI3K、p-AKT、NF-κB、GSK-3和二抗購自美國CST公司。增強型化學發(fā)光試劑(ECL)顯影液購自美國Thermo公司。

1.3 細胞培養(yǎng)和慢病毒感染H1299、H1975、H1650、HCC827細胞培養(yǎng)在添加10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，A549、HPAEpiC細胞培養(yǎng)在添加10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的H1299細胞接種于6孔板，細胞密度達60%，按照病毒滴度(MOI)=30，將陰性對照慢病毒和載有LRRC77P序列的慢病毒分別感染H1299細胞，分別命名為對照組和實驗組。慢病毒轉(zhuǎn)染12 h后，更換新鮮RPMI-1640培養(yǎng)基。

1.4 qRT-PCR根據(jù)TRIzol試劑盒說明書，提取肺腺癌組織和細胞系的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)qRT-PCR試劑盒說明書設置反應條件：95 ℃預變性5 min，62 ℃ 35 s、72 ℃ 35 s，合計35個循環(huán)。以U6為內(nèi)參檢測miR-182-5p的表達，以GAPDH為內(nèi)參檢測LRRC77P和PCDH10 mRNA的表達。采用2-ΔΔCt方法分析基因表達量。U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-182-5p上游引物5′-GGAAACCGTTACCATCTTG-3′，下游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；GAPDH上游引物5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；LRRC77P上游引物5′-TTCGAGTTGAAACCCTCTGG-3′，下游引物5′-AAAGCTCACTCCACCTACGC-3′；PCDH10上游引物5′-TGGATGGTGGAAGGAGTCTTT-3′，下游引物5′-TTCAGCGATATTCCCCACGAA-3′。

1.5 MTT法檢測細胞增殖能力取對數(shù)生長期的兩組H1299細胞接種于96孔板，每組設4個復孔，每個復孔調(diào)整細胞密度為每毫升2×104個細胞。MTT法檢測時，每孔加入15 μL MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL二甲基亞砜，充分振蕩20 min。在酶標儀波長450 nm處檢測每孔的光密度(optical density, OD)值；分別于接種后第1、2、3、4、5天進行MTT法檢測，并繪制細胞生長曲線。

1.6 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力取對數(shù)生長期的兩組H1299細胞，采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至每毫升6×105個細胞，接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。肺腺癌細胞密度達到90%時，棄去培養(yǎng)基，采用無菌200 μL槍頭在每孔底部進行劃痕。采用PBS緩沖培養(yǎng)液洗3次，每孔加入不含胎牛血清的培養(yǎng)基。采用倒置顯微鏡測量初始劃痕寬度S1，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，拍照測量劃痕寬度S2。實驗重復4次，細胞遷移率=(S1-S2)/S1×100%。

1.7 生物信息學預測LRRC77P的下游基因采用LncBase Predicted v.2數(shù)據(jù)庫預測LRRC77P互補結(jié)合的miRNA，采用microRNA.org數(shù)據(jù)庫預測miRNA互補結(jié)合的基因。

1.8 Western blot實驗檢測PCDH10蛋白的表達收集各組H1299細胞，加入細胞裂解液，提取各組細胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度。每組蛋白取40 μg進行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。在常溫下，采用5%脫脂牛奶封閉2 h。加入一抗PCDH10(1 ∶2 000稀釋)、p-PI3K(1 ∶2 000稀釋)、p-AKT(1 ∶2 000稀釋)、NF-κB(1 ∶1 000稀釋)、β-tubulin(1 ∶1 000稀釋)及GSK-3(1 ∶2 000稀釋)，在4 ℃下孵育過夜。常溫下加入二抗孵育2 h。添加ECL發(fā)光試劑曝光、顯影，以β-tubulin作為內(nèi)參蛋白。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌組織和細胞系中LRRC77P的表達qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，LRRC77P在67例肺腺癌組織和癌旁組織中的表達量分別為1.04±0.08和3.86±0.19。與癌旁組織相比，肺腺癌組織中LRRC77P的表達顯著減少(t=49.28，P<0.01，圖1)。LRRC77P在正常肺泡上皮細胞HPAEpiC和肺腺癌細胞系H1299、H1975、H1650、HCC827、A549中的表達量分別為1.00±0.01、0.12±0.03、0.66±0.06、0.51±0.03、0.71±0.03和0.29±0.02。與正常肺泡上皮細胞相比，LRRC77P在肺腺癌細胞系中的表達顯著減少(P<0.01)，其中在H1299細胞中表達最低(P<0.01，圖2)。

2.2 感染載有LRRC77P序列慢病毒高表達H1299細胞中LRRC77P的表達qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，對照組和實驗組H1299細胞中LRRC77P的表達量分別為1.03±0.14和9.89±1.29。與對照組相比，實驗組H1299細胞中LRRC77P的表達量顯著上升(P<0.01，圖3)。

圖1 肺腺癌組織和癌旁組織中LRRC77P的表達

圖2 正常肺泡上皮細胞和肺腺癌細胞系中LRRC77P的表達

圖3 對照組和實驗組H1299細胞中LRRC77P的表達

2.3 高表達LRRC77P抑制H1299細胞的增殖能力MTT檢測顯示，第1天兩組細胞增殖能力差異無顯著性(P>0.05)，第2、3、4、5天高表達LRRC77P實驗組H1299細胞的OD值顯著少于對照組(P<0.05)，表明高表達LRRC77P可抑制H1299細胞的增殖能力(圖4)。

圖4 高表達LRRC77P對H1299細胞增殖能力的影響

2.4 高表達LRRC77P抑制H1299細胞的遷移能力細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，對照組和實驗組H1299細胞的遷移率分別為(66.34±6.50)%和(26.98±5.92)%，實驗組細胞的遷移率顯著低于對照組(P<0.01)，表明高表達LRRC77P可抑制H1299細胞的遷移能力(圖5)。

圖5 高表達LRRC77P對H1299細胞遷移能力的影響

2.5 生物信息學預測LRRC77P的下游基因采用LncBase Predicted v.2數(shù)據(jù)庫預測顯示，LRRC77P可互補結(jié)合miR-182-5p；采用microRNA.org數(shù)據(jù)庫預測顯示，miR-182-5p可互補結(jié)合PCDH10 mRNA(圖6)。

圖6 生物信息學預測LRRC77P的下游基因

2.6 高表達LRRC77P對H1299細胞中miR-182-5p和PCDH10 mRNA表達的影響qRT-PCR檢測顯示，對照組和實驗組H1299細胞中miR-182-5p表達分別為1.01±0.10和0.26±0.05，實驗組miR-182-5p的表達顯著低于對照組(P<0.01)。對照組和實驗組H1299細胞中PCDH10 mRNA表達分別為1.03±0.14和6.19±0.54，實驗組PCDH10 mRNA的表達顯著高于對照組(P<0.01，圖7)，表明高表達LRRC77P可抑制miR-182-5p的表達，促進PCDH10 mRNA的表達。

圖7 高表達LRRC77P對H1299細胞中miR-182-5p表達的影響

2.7 高表達LRRC77P對PCDH10蛋白和PI3K/AKT信號通路蛋白的影響Western blot檢測顯示，高表達LRRC77P后，PCDH10蛋白表達水平增加，PI3K/AKT信號通路如p-PI3K、p-AKT、NF-κB、GSK-3等蛋白的表達顯著降低，表明PCDH10蛋白可抑制PI3K/AKT信號通路(圖8)。

圖8 高表達LRRC77P對H1299細胞中PCDH10和PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

3 討論

肺腺癌約占非小細胞肺癌的30%，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，探討肺腺癌發(fā)生、發(fā)展的機制，對肺腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、治療及預后至關(guān)重要[8-9]。lncRNA屬于非編碼RNA，長度超過200個核苷酸，通過調(diào)控下游基因的表達，影響腫瘤細胞生物學特性，在腫瘤的發(fā)病機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[10]。研究表明，lncRNA在肺腺癌組織中存在明顯異常表達，可能成為肺腺癌早期診斷和中晚期治療的重要靶點[11]。Zhao等[12]研究表明，lncRNA GMDS-AS1在肺腺癌組織和細胞系中表達明顯降低，上調(diào)GMDS-AS1可通過抑制miR-96-5p表達，顯著抑制肺腺癌細胞增殖和促進細胞凋亡。Xu等[9]研究顯示，lncRNA SNHG14在肺腺癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，過表達SNHG14可促進肺腺癌細胞增殖和侵襲，miR-613是SNHG14的下游靶基因。Xiao等[7]研究顯示，lncRNA MALAT1在肺腺癌組織和細胞系中高表達，其表達水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)，MALAT1主要通過抑制miR-429的表達，促進肺腺癌細胞的增殖和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。LRRC77P是一個尚未被報道的lncRNA，其在肺腺癌組織中的表達和作用機制有待分析。

本組結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，肺腺癌組織中LRRC77P的表達顯著降低；與正常肺泡上皮細胞相比，肺腺癌細胞系中LRRC77P的表達顯著降低，提示LRRC77P可能在肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。MTT法和細胞劃痕實驗顯示，高表達LRRC77P可顯著抑制肺腺癌細胞的增殖和遷移能力，LRRC77P具有“抑癌基因”的功能。文獻報道lncRNA的作用機制是通過競爭性互補結(jié)合miRNA，抑制miRNA的表達，從而間接抑制miRNA與其下游靶基因結(jié)合，促進下游靶基因的表達，即“競爭性內(nèi)源RNA”作用[13]。本實驗通過生物信息學預測顯示，LRRC77P與miR-182-5p存在互補結(jié)合位點，miR-182-5p與PCDH10 mRNA之間存在互補結(jié)合位點。許多研究表明，miR-182-5p在肺腺癌、前列腺癌、肝癌等多種腫瘤中的表達明顯增加，可顯著促進腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移，miR-182-5p在肺腺癌中具有明顯的“癌基因”作用[14-16]。本組結(jié)果表明，LRRC77P高表達后，miR-182-5p的表達明顯降低。PCDH10基因位于人類染色體4q28.2，屬于原鈣黏蛋白家族，參與多種信號傳導，對正常細胞的生長具有重要調(diào)控作用[17]。近年研究表明，PCDH10在肺腺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌等腫瘤組織和細胞系中表達缺失，其與腫瘤細胞的過度增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，PCDH10低表達與腫瘤患者的不良預后相關(guān)，PCDH10在肺腺癌中發(fā)揮“抑癌基因”的作用[18-19]。qRT-PCR實驗和Western blot實驗結(jié)果顯示，LRRC77P抑制miR-182-5p表達后，miR-182-5p下游基因PCDH10的表達明顯增加。本組通過Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，H1299細胞中PCDH10蛋白表達上升后，PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白如p-PI3K、p-AKT、NF-κB、GSK-3的表達顯著降低，表明PI3K/AKT信號通路被抑制。PI3K/AKT信號通路在腫瘤細胞中被激活，可促進腫瘤細胞的過度增殖、遷移和侵襲[20-21]。上述實驗結(jié)果提示，PCDH10蛋白可能通過抑制PI3K/AKT信號通路發(fā)揮“抑癌基因”作用。

綜上所述，本實驗結(jié)果證明LRRC77P在肺腺癌組織和細胞系中呈低表達，高表達LRRC77P可抑制肺腺癌細胞的增殖和遷移能力，其作用機制是LRRC77P通過“競爭性內(nèi)源RNA作用”抑制miR-182-5p表達，間接促進PCDH10基因表達，阻滯PI3K/AKT信號通路。LRRC77P可能為肺腺癌的診斷和治療新的候選靶基因。