王申濤，葉冬雪，陳云慶，李 宏，時(shí)維平，周 璇，項(xiàng)鋒鋼,

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是多因素引起的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，病死率高[1]。近年雖對(duì)HCC的診療取得一定的進(jìn)展，但多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，預(yù)后較差，且對(duì)其癌變與侵襲的分子機(jī)制尚不清楚。因此，探索HCC侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的臨床標(biāo)志物具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。Piwil2屬于Argonaute蛋白家族PIWI亞家族成員[2]。Argonaute蛋白是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)的主要部件，在RNA沉默、干細(xì)胞的繁殖更新及轉(zhuǎn)錄調(diào)控中均發(fā)揮重要作用[3]。有研究證實(shí)Piwil2在甲狀腺癌、結(jié)腸癌、子宮頸癌、肺癌等多種癌癥和癌細(xì)胞系中表達(dá)異常，且其表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)均有關(guān)聯(lián)[4]。但是尚未見其在HCC中的表達(dá)及與患者預(yù)后的相關(guān)性報(bào)道。本文采用免疫組化PV 6000法檢測Piwil2在HCC組織及對(duì)應(yīng)癌旁非瘤組織中的表達(dá)，分析其表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系及對(duì)患者預(yù)后的影響，探討Piwil2表達(dá)在HCC發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2015年8月～2016年10月青島大學(xué)附屬醫(yī)院存檔的手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的HCC標(biāo)本163例，包括HCC組織及對(duì)應(yīng)癌旁非瘤組織(距癌組織≥5 cm，鏡下排除HCC及瘤變)。入組HCC病例臨床病理資料均完整，且術(shù)前均未實(shí)施其他方案治療。其中男性135例，女性28例；年齡32～83歲，中位年齡57.6歲；HCC依據(jù)Edmondson標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)：Ⅰ+Ⅱ級(jí)88例，Ⅲ+Ⅳ級(jí)75例；有包膜侵犯91例，無包膜侵犯72例；有脈管侵犯69例，無脈管侵犯94例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期138例，Ⅲ+Ⅳ期25例；HBsAg陽性128例，陰性35例。所有患者術(shù)后隨訪3年以上，目前持續(xù)隨訪中，以電話隨訪為主，患者復(fù)診為輔。隨訪過程中163例HCC患者有26例失訪，有完整隨訪信息者137例。本實(shí)驗(yàn)獲得青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2 試劑兔抗人多克隆抗體Piwil2購自美國Proteintech公司；通用型免疫組化PV 6000檢測試劑盒購于北京中杉金橋公司；組織芯片由上海芯超公司制作并提供技術(shù)支持。

1.3 方法

1.3.1設(shè)計(jì)與制備組織芯片 將符合入選標(biāo)準(zhǔn)的HCC組織及對(duì)應(yīng)癌旁非瘤組織蠟塊行HE染色，采用雙盲法由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師對(duì)石蠟標(biāo)本(包括HCC組織及對(duì)應(yīng)癌旁非瘤組織)中有代表性的部位進(jìn)行標(biāo)記。根據(jù)收集的標(biāo)本例數(shù)(每例患者兩個(gè)組織芯，包括HCC組織和癌旁非瘤組織)設(shè)計(jì)為5個(gè)組織陣列，用細(xì)針打孔(直徑1.5 mm)，將供體蠟塊中標(biāo)記好的組織芯取出并整齊排列到受體蠟塊上，制成組織芯片蠟塊。置于55 ℃溫箱中10 min，待陣列融合完全后取出，4 μm厚連續(xù)切片，冷水漂片，45 ℃溫水中展片2 min，撈片，拷片備用。將制備好的組織芯片進(jìn)行HE染色，復(fù)檢以確認(rèn)芯片質(zhì)量。

1.3.2免疫組化 將制備好的組織芯片行免疫組化PV 6000法染色，Piwil2抗體工作濃度為1 ∶50。先將切片脫蠟和水化，抗原修復(fù)，添加一、二抗，DAB顯色，復(fù)染，中性樹膠封固。具體操作步驟嚴(yán)格按抗體和試劑盒說明書進(jìn)行，用試劑盒附帶的已知陽性切片作為陽性對(duì)照，用PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷Piwil2蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，未著色為陰性，淡黃色為弱陽性，棕黃色為中度陽性，棕褐色為強(qiáng)陽性。顯微鏡下每個(gè)組織芯中隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(400×)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)癌細(xì)胞，取平均數(shù)。按陽性細(xì)胞百分率計(jì)分：陽性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。按細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：陰性為0分，弱陽性為1分，中度陽性為2分，強(qiáng)陽性為3分。將兩項(xiàng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)所得分值相加所得總分進(jìn)行結(jié)果判定：0～3分為低表達(dá)，4～7分為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；用Kaplan-Meier曲線評(píng)估Piwil2表達(dá)與生存期的關(guān)系，并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)。總生存期定義為手術(shù)日期與患者死亡日期之間的間隔；無瘤生存期定義為手術(shù)日期和復(fù)發(fā)日期之間的間隔。使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)估Piwil2表達(dá)和HCC各臨床病理變量的風(fēng)險(xiǎn)比和95%CI，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC及癌旁非瘤組織中Piwil2的表達(dá)163例HCC組織中Piwil2低表達(dá)85例(52.15%)，高表達(dá)78例(47.85%)；Piwil2在對(duì)應(yīng)的癌旁非瘤組織中均呈低表達(dá)，149例(91.41%)為陰性，14例(8.59%)為弱陽性(圖1～4)。Piwil2在HCC組織中的表達(dá)顯著高于癌旁非瘤組織(χ2=102.532，P<0.001，表1)。

①②③④

表1 肝細(xì)胞肝癌組織和癌旁非瘤組織中Piwil2的表達(dá)[n(%)]

2.2 HCC中Piwil2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Piwil2表達(dá)與腫瘤病理分級(jí)、TNM分期、包膜侵犯、脈管侵犯有關(guān)(P均<0.05)。TNM分期Ⅲ+Ⅳ期患者的高表達(dá)率為68%，高于Ⅰ+Ⅱ期(44.2%)(P=0.028)；病理分級(jí)Ⅲ+Ⅳ級(jí)高表達(dá)率為73.33%，高于Ⅰ+Ⅱ級(jí)(26.14%)(P<0.001)。有包膜侵犯、有脈管侵犯患者的高表達(dá)率也高于無包膜和脈管侵犯者(54.95%vs38.89%，P=0.042；63.77%vs36.17%，P<0.001)；Piwil2表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤直徑、HBsAg無關(guān)(P均>0.05，表2)。

表2 肝細(xì)胞肝癌中Pwil2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 Piwil2表達(dá)與HCC患者預(yù)后的關(guān)系本組患者有26例失訪，將有完整隨訪信息的137例患者進(jìn)行Kaplan-Meier預(yù)后生存分析，結(jié)果顯示，Piwil2高表達(dá)組患者的總生存期(P<0.001，圖5A)和無瘤生存期(P<0.001，圖5B)較低表達(dá)組短。Piwil2高表達(dá)組和低表達(dá)組的總生存時(shí)間分別為(31.74±1.90)個(gè)月和(42.14±0.43)個(gè)月；無瘤生存時(shí)間分別為(26.67±2.25)個(gè)月和(40.63±0.52)個(gè)月。另外，TNM分期Ⅲ+Ⅳ期患者Piwil2高表達(dá)組總生存時(shí)間(P=0.004，圖5C)和無瘤生存時(shí)間(P=0.010，圖5D)比低表達(dá)組短；病理分級(jí)Ⅲ+Ⅳ級(jí)患者Piwil2高表達(dá)組總生存時(shí)間(P=0.018，圖5E)和無瘤生存時(shí)間(P=0.001，圖5F)比低表達(dá)組縮短。

發(fā)生包膜侵犯和脈管侵犯者Piwil2高表達(dá)組總生存時(shí)間(P=0.003，圖5G)和無瘤生存時(shí)間(P=0.001，圖5H)亦比低表達(dá)組短。

圖5 Piwil2表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌患者生存期的關(guān)系：A.總生存期；B.無瘤生存期；C.TNM Ⅲ+Ⅳ期患者總生存期；D.TNM Ⅲ+Ⅳ期患者無瘤生存期；E.病理分級(jí)Ⅲ+Ⅳ級(jí)患者總生存期；F.病理分級(jí)Ⅲ+Ⅳ級(jí)患者無瘤生存期；G.有包膜和脈管侵犯患者總生存期；H.有包膜和脈管侵犯患者無瘤生存期

2.4 HCC患者預(yù)后的Cox單因素和多因素分析將各臨床因素進(jìn)行Cox單因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，HBsAg(P=0.035)、腫瘤直徑(P=0.030)、病理分級(jí)(P=0.002)、TNM分期(P=0.001)、包膜侵犯(P=0.015)、脈管侵犯(P=0.008)、Piwil2表達(dá)(P<0.001)是影響患者術(shù)后總生存期的危險(xiǎn)因素；TNM分期(P<0.001)、脈管侵犯(P=0.020)、Piwil2表達(dá)(P<0.001)是影響患者術(shù)后無瘤生存期的危險(xiǎn)因素。Cox多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，TNM分期(P=0.007)、Piwil2表達(dá)(P<0.001)是影響HCC患者術(shù)后總生存期的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素；同時(shí)TNM分期(P=0.005)、Piwil2表達(dá)(P<0.001)也是術(shù)后無瘤生存期的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素(表3、4)。

表3 單因素和多因素Cox回歸分析肝細(xì)胞肝癌患者術(shù)后總生存期的影響因素

表4 單因素和多因素Cox回歸分析肝細(xì)胞肝癌患者術(shù)后無瘤生存期的影響因素

3 討論

HCC在我國的發(fā)生率較高，占原發(fā)性肝癌組織學(xué)類型的90%，且晚期患者占比較高。近年HCC的診斷與治療雖取得進(jìn)展，但由于其高惡性程度、高轉(zhuǎn)移率、高復(fù)發(fā)率，患者預(yù)后仍不能令人滿意[5]。Piwi蛋白首先在果蠅的生殖細(xì)胞中被人們發(fā)現(xiàn)。Piwil2屬于Piwi蛋白的一個(gè)亞型，有PAZ和Piwi兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，在生殖細(xì)胞的維持中發(fā)揮作用，且在癌癥干細(xì)胞中顯著表達(dá)[6]，并可通過RNA干擾和miRNA對(duì)目標(biāo)mRNA的降解作用參與染色質(zhì)修飾和抑制相關(guān)基因的表達(dá)，在腫瘤進(jìn)程中發(fā)揮癌基因的作用，還可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期和增殖，通過調(diào)節(jié)參與細(xì)胞生長、代謝、凋亡和致癌作用的眾多基因的表達(dá)來促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)化和癌癥進(jìn)展[7-8]。已有研究證明Piwil2在多種腫瘤組織中表達(dá)異常[4]，且其表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)預(yù)后密切相關(guān)。但是Piwil2在HCC中的表達(dá)情況研究較少，尚未見Piwil2表達(dá)與HCC臨床病理特征及預(yù)后之間的研究報(bào)道。

Wang等[9]發(fā)現(xiàn)Piwil2在癌旁非瘤組織、結(jié)腸腺瘤、結(jié)腸癌中的陽性率呈上升趨勢。Feng等[10]研究發(fā)現(xiàn)Piwil2在子宮頸癌組織中的陽性率明顯高于正常子宮頸上皮組織，并且證實(shí)Piwil2在誘導(dǎo)體細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)采用組織芯片技術(shù)和免疫組化法檢測163例HCC組織和對(duì)應(yīng)癌旁非瘤組織中Piwil2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Piwil2在HCC組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁非瘤組織，提示Piwil2可能參與早期HCC的惡性轉(zhuǎn)化過程。Sarvestani等[11]發(fā)現(xiàn)Piwil2在乳腺癌中高表達(dá)，且其表達(dá)與腫瘤浸潤深度、TNM分期、病理分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Yang等[12]的研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中Piwil2高表達(dá)，敲低PC-3細(xì)胞中Piwil2的表達(dá)，顯著降低了PC-3細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的Piwil2主要定位于細(xì)胞質(zhì)，在分化程度低、TNM分期晚的患者中Piwil2表達(dá)增高；有包膜侵犯和脈管侵犯的患者中Piwil2表達(dá)水平高于無侵犯者。提示Piwil2高表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與浸潤，參與HCC的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。

有研究發(fā)現(xiàn)Piwil2表達(dá)與多種腫瘤預(yù)后相關(guān)，Piwil2高表達(dá)是神經(jīng)膠質(zhì)瘤[13]和膀胱尿路上皮癌[14]患者預(yù)后不良的重要決定因素，但是Li等[15]在胰腺癌中的研究發(fā)現(xiàn)Piwil2高表達(dá)患者的總體生存期較長，其高表達(dá)反而提示患者預(yù)后良好。由此可見，Piwil2對(duì)不同類型癌癥患者預(yù)后的影響存在差異。本組Kaplan-Meier生存分析顯示，Piwil2高表達(dá)HCC患者的總生存時(shí)間和無瘤生存時(shí)間比低表達(dá)者短，提示Piwil2高表達(dá)預(yù)示患者預(yù)后不良。此外，本組還對(duì)病理分級(jí)Ⅲ+Ⅳ級(jí)、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、有包膜侵犯和脈管侵犯的患者進(jìn)行了生存分析，發(fā)現(xiàn)Piwil2高表達(dá)患者的總生存時(shí)間和無瘤生存時(shí)間均短于低表達(dá)患者。進(jìn)一步提示Piwil2表達(dá)是影響HCC患者預(yù)后的重要因素。鄧鑫[16]研究發(fā)現(xiàn)Piwil2高表達(dá)可激活PI3K/AKT通路，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖；還可激活TGF-β/Smad通路，促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，這或許導(dǎo)致了HCC患者術(shù)后的高復(fù)發(fā)與較差的預(yù)后。通過Cox回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，Piwil2表達(dá)、TNM分期是影響HCC患者術(shù)后總生存期和無瘤生存期的獨(dú)立影響因素。以上結(jié)果表明，Piwil2與HCC患者預(yù)后顯著相關(guān)，其高表達(dá)提示患者預(yù)后不良。因此檢測其表達(dá)對(duì)HCC患者的診療有重要臨床意義。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Piwil2在HCC中的表達(dá)明顯增高，表明Piwil2與HCC的發(fā)生、發(fā)展有一定關(guān)聯(lián)；其表達(dá)與臨床病理特征和患者預(yù)后之間的關(guān)系，表明其在HCC的侵襲、轉(zhuǎn)移機(jī)制中發(fā)揮作用并可能由此影響患者預(yù)后。在以后的工作中，作者將采用細(xì)胞系及荷瘤動(dòng)物繼續(xù)深入探討Piwil2在HCC發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機(jī)制，為HCC的臨床治療和預(yù)后判斷提供新指標(biāo)。