張 前，茍思琪，李志文，楊路路，王勁松，黃文斌

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，隨著飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐漸增高且呈年輕化。黏液腺癌(mucinous adenocarcinoma, MA)是結(jié)直腸癌最常見的亞型，占結(jié)直腸癌的5%～20%，定義為腫瘤由惡性上皮和細(xì)胞外黏液池組成，而且黏液池成分占腫瘤區(qū)域的50%以上，黏液池內(nèi)漂浮的惡性上皮細(xì)胞可形成腺泡狀、條索狀或單個(gè)散在存在，腫瘤細(xì)胞形態(tài)多樣包括印戒樣細(xì)胞等[1]。結(jié)直腸MA的預(yù)后文獻(xiàn)報(bào)道不一，提示MA內(nèi)不同形態(tài)學(xué)特征可能具有不同的臨床病理意義[2-5]。目前結(jié)直腸MA內(nèi)漂浮的腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系報(bào)道較少，其形態(tài)學(xué)分類也不一致，導(dǎo)致研究結(jié)果也不相同。本文觀察80例結(jié)直腸MA的病理形態(tài)學(xué)特征，將結(jié)直腸MA分為分化型、漂浮型和印戒細(xì)胞型3種組織學(xué)類型，分析不同組織學(xué)類型與結(jié)直腸MA臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，旨在進(jìn)一步認(rèn)識(shí)結(jié)直腸MA的異質(zhì)性，探討結(jié)直腸MA進(jìn)一步分型的可能性，從而更加精準(zhǔn)地指導(dǎo)臨床治療。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2013年1月1日～2018年12月31日南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院(南京市第一醫(yī)院)存檔的80例結(jié)直腸MA手術(shù)切除標(biāo)本，所有病例術(shù)前均未行新輔助治療。其中男性44例，女性36例，男女比約1.2 ∶1；年齡41～96歲，平均65.53歲。腫瘤直徑≤5 cm者31例，>5 cm者49例；右半結(jié)腸癌42例，左半結(jié)腸和直腸38例；腫瘤侵及固有肌層2例，漿膜下層74例，漿膜外層4例；有脈管侵犯者15例，無脈管侵犯者65例；有神經(jīng)周圍侵犯者11例，無神經(jīng)周圍侵犯者69例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者42例；pTNM分期：Ⅰ期1例，Ⅱ期41例，Ⅲ期37例，Ⅳ期1例。

1.2 方法所有病例均為手術(shù)切除標(biāo)本，并經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚切片，分別行HE染色和免疫組化染色。免疫組化染色采用EnVision法，切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇脫水，3%H2O2內(nèi)源性生物素滅活，高溫高壓抗原修復(fù)，抗原修復(fù)液為枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0)，隨后在Dako Autostainer Link48全自動(dòng)免疫組化儀上進(jìn)行染色，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。MLH1、MSH2、MSH6、PMS2購自福州邁新公司，D2-40、CD31和S-100抗體購自北京中杉金橋公司，均為即用型，二抗及檢測試劑盒均購自Dako公司。

1.3 結(jié)果判斷

1.3.1形態(tài)學(xué)分類 所有病例均由病理科兩名高年資主治及以上職稱醫(yī)師復(fù)核。MA的形態(tài)學(xué)分型根據(jù)黏液湖內(nèi)有無腫瘤細(xì)胞以及漂浮的腫瘤細(xì)胞形態(tài)分為分化型、漂浮型和印戒細(xì)胞型。當(dāng)MA中印戒癌樣細(xì)胞≥10%為印戒細(xì)胞型MA，當(dāng)黏液湖中漂浮的腫瘤細(xì)胞(非印戒細(xì)胞癌形態(tài))≥10%為漂浮型MA，而印戒癌樣細(xì)胞和(或)漂浮的癌細(xì)胞<10%，或者無兩種結(jié)構(gòu)時(shí)為分化型MA。

1.3.2免疫組化 D2-40、CD31和S-100分別標(biāo)記淋巴管、血管和神經(jīng)，當(dāng)標(biāo)記的淋巴管、血管和神經(jīng)內(nèi)見有癌細(xì)胞時(shí)則分別判讀為淋巴管、血管和神經(jīng)侵犯。MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均定位于細(xì)胞核，當(dāng)上述4種錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair, MMR)蛋白均表達(dá)時(shí)判定為錯(cuò)配修復(fù)基因完整(proficient mismatch repair, pMMR)，而當(dāng)4種MMR蛋白中至少1種蛋白失表達(dá)時(shí)判定為錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)缺陷(deficient mismatch repair, dMMR)。陽性對照以腫瘤間質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。MA的3種形態(tài)學(xué)分類和臨床病理特征的關(guān)系采用χ2或Fisher確切概率法，不同形態(tài)學(xué)分類MA中微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI)狀態(tài)采用Fisher確切概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸MA 3種組織學(xué)亞型的形態(tài)學(xué)特征80例MA中，分化型MA 40例，占50%，其組織學(xué)特征表現(xiàn)為腫瘤性腺體襯覆于黏液池周邊，腺上皮分化良好，黏液池內(nèi)幾乎無腫瘤細(xì)胞，或漂浮著單個(gè)腫瘤細(xì)胞或散在的腫瘤細(xì)胞巢(圖1A)；漂浮型MA 19例，占23.8%，其組織學(xué)特征表現(xiàn)為黏液池內(nèi)漂浮著多量微乳頭或篩狀腫瘤細(xì)胞巢，胞質(zhì)明顯嗜酸性，細(xì)胞核間變較明顯(圖1B、C)；印戒細(xì)胞型MA 21例，占26.2%，其組織學(xué)特征為黏液池中漂浮的腫瘤細(xì)胞呈明顯的印戒樣，可呈彌漫或成簇分布(圖1D)。

2.2 結(jié)直腸MA 3種組織學(xué)亞型與臨床病理特征的關(guān)系結(jié)直腸MA 3種組織學(xué)亞型與患者發(fā)病年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤最大徑和浸潤深度均無關(guān)(P>0.05)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯、神經(jīng)周圍侵犯以及pTNM分期有關(guān)(P<0.05，表1)。進(jìn)一步分析顯示，漂浮型和印戒細(xì)胞型MA中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性率明顯高于分化型MA(P<0.05)，但淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率在漂浮型和印戒細(xì)胞型之間差異無顯著性(P>0.05)；pTNM分期中Ⅲ+Ⅳ期更多見于漂浮型和印戒細(xì)胞型MA，而分化型MA更多為Ⅰ+Ⅱ期，差異有顯著性(P<0.05)，但漂浮型和印戒細(xì)胞型之間差異無顯著性(P>0.05)。

表1 結(jié)直腸黏液腺癌3種組織學(xué)亞型與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 結(jié)直腸MA不同組織學(xué)亞型中MMR蛋白表達(dá)4種MMR蛋白(MLH1、MSH2、MSH6和PMS2)均定位于腫瘤細(xì)胞核(圖2)。MLH1、MHS2、MSH6和PMS2在結(jié)直腸MA 3種組織學(xué)亞型的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。根據(jù)MLH1、MHS2、MSH6和PMS2等4種基因表達(dá)情況將MMR分為dMMR和pMMR，它們在結(jié)直腸MA 3種組織學(xué)亞型的分布，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

圖1 結(jié)直腸黏液腺癌的3種組織學(xué)形態(tài)特征：A.分化型，腫瘤性腺上皮襯覆于黏液池周邊；B.飄浮型，腫瘤性腺體呈篩狀漂浮于黏液池內(nèi)；C.飄浮型，腺癌細(xì)胞呈微乳頭狀漂浮于黏液池內(nèi)；D.印戒細(xì)胞型，黏液湖內(nèi)漂浮著印戒細(xì)胞癌成分 圖2 結(jié)直腸黏液腺癌中4種MMR蛋白表達(dá)：A.癌組織中MLH1陽性，EnVision法；B.癌組織中MSH2陽性，EnVision法；C.癌組織中MSH6陽性，EnVision法；D.癌組織中PMS2陽性，EnVision法

表2 結(jié)直腸黏液腺癌3種組織學(xué)亞型中MMR蛋白的表達(dá)

3 討論

MA是結(jié)直腸腺癌常見的一種組織學(xué)類型，該類型腺癌具有獨(dú)特的臨床病理學(xué)特征，如患者發(fā)病年齡較輕，常見于近端結(jié)腸，診斷時(shí)多處于進(jìn)展期以及常伴有遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌，但其預(yù)后文獻(xiàn)報(bào)道不一[2,6]。

結(jié)直腸MA不同的預(yù)后除了其固有的分子生物學(xué)特征外，可能還與其具有不同的形態(tài)學(xué)改變有關(guān)。Kondo等[7]將33例MA分為乳頭管狀型(22例)和黏液細(xì)胞型(11例)，分析其臨床病理學(xué)特征及微衛(wèi)星改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者在淋巴管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移和Dukes分期差異有顯著性，高度MSI在乳頭管狀型明顯高于黏液細(xì)胞型，乳頭管狀型MA患者的5年生存率也高于黏液細(xì)胞型，作者認(rèn)為結(jié)直腸MA由于存在明顯的臨床病理學(xué)特征、MSI以及預(yù)后差異而應(yīng)進(jìn)一步分為上述2型。Ikeda等[8]將MA分為固定型和漂浮型，發(fā)現(xiàn)固定型和漂浮型MA在發(fā)病年齡、性別、臨床分期以及部位上無明顯差異，KRAS基因突變和β-catenin蛋白表達(dá)雖然固定型高于漂浮型，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。p53蛋白表達(dá)在飄浮型高于固定型，生存分析顯示，5年生存率漂浮型明顯低于固定型(21.4%vs68.4%)，該研究不僅提示MA不同形態(tài)學(xué)類型預(yù)示不同的預(yù)后，而且腫瘤發(fā)生機(jī)制上可能也存在不同，即固定型MA類似于非MA，而飄浮型則可能通過另外機(jī)制發(fā)生。Song等[9]根據(jù)黏液池內(nèi)腫瘤細(xì)胞形態(tài)將結(jié)直腸MA分為條帶為主型、群集為主型、混合印戒細(xì)胞型和印戒細(xì)胞為主型，結(jié)果顯示條帶或群集為主型MA主要見于老人，混合印戒細(xì)胞型或印戒細(xì)胞為主型更常見于左側(cè)結(jié)腸，條帶為主型MA有高分化非MA成分，而混合印戒細(xì)胞型或印戒細(xì)胞為主型MA顯示差分化腺癌或印戒細(xì)胞癌。淋巴血管侵犯、神經(jīng)周圍侵犯、局部淋巴結(jié)分期和TNM分期在印戒細(xì)胞為主型MA中明顯高于其他類型MA，而患者性別、T分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和MSI狀態(tài)在不同類型MA之間均無明顯差異。生存分析顯示印戒細(xì)胞為主型MA預(yù)后最差，其次為混合印戒細(xì)胞型，作者認(rèn)為MA應(yīng)根據(jù)腫瘤細(xì)胞形態(tài)進(jìn)一步分型，其中印戒細(xì)胞為主型應(yīng)歸為印戒細(xì)胞癌。國內(nèi)周良銳等[10]將結(jié)直腸MA分為無印戒細(xì)胞分化和有印戒細(xì)胞分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有印戒細(xì)胞分化的腫瘤體積較小，患者年齡較小，好發(fā)于近端結(jié)腸以及分期較高，分子生物學(xué)分析顯示KRAS/NRAS突變的頻率在不伴印戒細(xì)胞分化的病例中顯著高于伴印戒細(xì)胞分化，提示兩者具有不同的臨床特征和分子基礎(chǔ)。

MA不同的形態(tài)學(xué)分型導(dǎo)致研究結(jié)果不一致性。Kondo等[7]和Ikeda等[8]分類未能將黏液池內(nèi)非印戒細(xì)胞癌和印戒細(xì)胞癌成分區(qū)分，而周良銳等[10]根據(jù)有無印戒細(xì)胞癌分化進(jìn)行分類，但忽略了MA的黏液池內(nèi)漂浮非印戒細(xì)胞癌的病例，導(dǎo)致這部分病例未能準(zhǔn)確分類使研究結(jié)果可能出現(xiàn)偏倚。本組根據(jù)MA中腫瘤細(xì)胞生長方式和細(xì)胞形態(tài)分為分化型、漂浮型和印戒細(xì)胞型。分化型表現(xiàn)為腫瘤性腺體襯覆于黏液池周邊，腺上皮分化良好，黏液池內(nèi)幾乎無或者漂浮著少量單個(gè)腫瘤細(xì)胞或散在的腫瘤細(xì)胞巢；漂浮型類似于乳腺富于細(xì)胞型黏液癌，其組織學(xué)特征表現(xiàn)為黏液池內(nèi)漂浮著多量腫瘤細(xì)胞巢，呈篩狀或?qū)嵭猿矤罘植迹|(zhì)嗜酸性，核間變較明顯；印戒細(xì)胞型病理學(xué)特征為黏液池中彌漫或成簇漂浮著印戒細(xì)胞癌成分。

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MA的組織學(xué)分類與淋巴血管侵犯、神經(jīng)周圍侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和pTNM分期均有關(guān)，而與患者發(fā)病年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤最大徑和浸潤深度均無關(guān)。進(jìn)一步分析顯示，淋巴血管侵犯、神經(jīng)周圍侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和pTNM分期在漂浮型和印戒細(xì)胞型MA中明顯高于分化型，但所有臨床病理特征在漂浮型和印戒細(xì)胞型之間差異無顯著性。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，結(jié)直腸MA具有高度異質(zhì)性，其中漂浮型和印戒細(xì)胞型具有侵襲性臨床生物學(xué)行為，建議注明在病理報(bào)告中。另外，本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持Kondo等[7]和Ikeda等[8]的分類，但與周良銳等[10]的分子研究結(jié)果不符，具體的分型還需要從形態(tài)學(xué)和分子遺傳學(xué)上進(jìn)一步研究。

MMR蛋白和MSI檢測對于結(jié)直腸癌患者是否獲益于5-FU治療、預(yù)后評估以及Lynch綜合征篩查具有重要價(jià)值，近年研究發(fā)現(xiàn)高度MSI可以預(yù)測免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療效[11-13]。MMR蛋白免疫組化檢測與MSI檢測具有高度的一致性[14-15]。因此，國內(nèi)外一些指南均推薦結(jié)直腸癌進(jìn)行MMR蛋白免疫組化檢測。有研究發(fā)現(xiàn)MMR缺陷型結(jié)直腸癌組織學(xué)多為MA[16-17]。然而，在MA的亞型分型中研究相對較少。Kondo等[7]研究發(fā)現(xiàn)黏液細(xì)胞型MA中，高度MSI 2例，低度MSI 7例，微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellite stability, MSS)2例，而乳頭管狀型MA中，高度MSI 12例，低度MSI 3例，MSS 7例，黏液細(xì)胞型中高度MSI明顯低于管狀乳頭狀型。Leopoldo等[18]根據(jù)MSI狀態(tài)將結(jié)直腸MA分為MSS型和MSI型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSI型MA常位于近端結(jié)腸和分化差，腫瘤復(fù)發(fā)率和患者生存期明顯高于MSS型MA。Song等[9]采用單因素和多因素生存分析顯示，缺乏MSI的MA患者預(yù)后差。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸MA中MMR蛋白表達(dá)缺失主要以MLH1/PMS2為主，缺失率占23.8%，而MSH2/MSH6僅有1例缺失，MLH1/PMS2缺失病例中，MLH1和PMS2共同缺失7例，PMS2單獨(dú)缺失2例，MSH2和MSH6共同缺失。4種MMR蛋白缺失和dMMR在結(jié)直腸MA 3種組織學(xué)分型的分布中未見明顯差異，與Kondo等[7]報(bào)道不一致，可能是由于本組病例未能進(jìn)行MSI檢測，以及病例數(shù)量較少有關(guān)，尚待以后進(jìn)一步積累病例進(jìn)行深入研究。

總之，MA雖是結(jié)直腸癌的一種組織學(xué)亞型，但其組織學(xué)形態(tài)具有高度異質(zhì)性，不同形態(tài)學(xué)特征的MA具有不同的臨床病理學(xué)特征和生物學(xué)行為。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，MA可以進(jìn)一步行組織學(xué)分類和分子分型，但具體組織學(xué)分類和分子分型目前文獻(xiàn)尚未統(tǒng)一，還需積累更多病例并結(jié)合分子病理學(xué)進(jìn)行深入研究。作者認(rèn)為在結(jié)直腸MA的病理報(bào)告中，應(yīng)注明黏液湖中腫瘤細(xì)胞類型及比例，以利于更好地指導(dǎo)臨床治療和預(yù)后判斷。