彭隨風(fēng) 時(shí)昭紅

(武漢市第一醫(yī)院，武漢 430022)

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種與高胰島素血癥、2型糖尿病(T2DM)、肥胖密切相關(guān)的臨床病理綜合征，是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)，與心腦血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[1]。近年來(lái)，隨著我國(guó)人民生活水平和飲食結(jié)構(gòu)不斷提高和改善，NAFLD發(fā)病率不斷增加，廣東、北京、上海等地的普查顯示，NALFD發(fā)病率達(dá)10.0%～35.8%，T2DM中的發(fā)病率高達(dá)80.0%[2-3]。NAFLD可進(jìn)展為肝硬化或肝癌，而且NAFLD常伴有高血脂、高尿酸、高血壓、冠心病等，增加患者心腦血管疾病發(fā)生率和全因死亡風(fēng)險(xiǎn)，成為威脅人群健康和生命的重要疾病[4-5]。鑒于胰島素抵抗是NAFLD和T2DM發(fā)病的共同基礎(chǔ)，增加胰島素敏感性、改善胰島素功能是治療NAFLD和T2DM的重要方式，胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是腸促胰島素作用的主要因素，GLP-1是一種腸促胰島素，具有促進(jìn)胰島素釋放、延緩胃排空、減低體重和降低食欲等生理作用。然而，單天然的GLP-1很不穩(wěn)定，可被二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-Ⅳ)降解，半衰期僅1～2 min。若采用天然GLP-1來(lái)降低血糖，需持續(xù)靜脈輸注或持續(xù)皮下注射，臨床可行性較差。利拉魯肽為GLP-1代表性類似物，通過(guò)和白蛋白結(jié)合，既保留了天然GLP-1的功效又延長(zhǎng)了作用時(shí)間，又對(duì)改善胰島β細(xì)胞功能、胰島素抵抗和糖脂代謝紊亂具有明顯作用，在NAFLD中顯示出良好的肝臟保護(hù)作用[6]。補(bǔ)體系統(tǒng)是機(jī)體固有免疫的重要組成部分，與肝臟脂質(zhì)的沉積發(fā)生密切相關(guān)，脂肪肝患者存在血清補(bǔ)體C3、C5水平升高，有學(xué)者認(rèn)為補(bǔ)體可作為脂肪肝病情評(píng)估的監(jiān)測(cè)指標(biāo)[7]。補(bǔ)體因子H(CFH)是重要的補(bǔ)體調(diào)節(jié)物質(zhì)，控制C3轉(zhuǎn)化酶的生成和穩(wěn)定性，在早期的補(bǔ)體活化中發(fā)揮重要作用[8]。雖然目前國(guó)內(nèi)外研究顯示利拉魯肽可通過(guò)改善糖脂代謝的方式保護(hù)NALFD肝功能，但其是否對(duì)NAFLD補(bǔ)體系統(tǒng)存在影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)建立T2DM合并NAFLD大鼠模型并給予GLP-1干預(yù)，觀察GLP-1對(duì)補(bǔ)體因子H相關(guān)蛋白(complement factor H-related protein，CFHR)1～5水平的影響，進(jìn)一步探討GLP-1對(duì)NAFLD的可能作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar雄性大鼠48只，6～8周齡，體重(200±20)g，購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)[SCXK(魯)2018-032]，山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心使用許可證號(hào)[SYXK(魯)2018-093]，遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則，本研究經(jīng)過(guò)山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：2018-0041)。

1.1.2主要試劑與儀器 CFHR1～5酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司；GLP-1(利拉魯肽)購(gòu)自諾和諾德(中國(guó))制藥有限公司；三酰甘油及膽固醇試劑盒購(gòu)自北京中生北控；高糖高脂飼料由江蘇協(xié)同生物有限公司提供；鏈脲佐菌素購(gòu)自上海源葉生物；HE染色試劑盒購(gòu)自碧云天；微量血糖儀購(gòu)自羅氏；TS100光學(xué)顯微鏡購(gòu)自?shī)W林巴斯；油紅O購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1研究方法 隨機(jī)選擇8只大鼠作為對(duì)照組，給予普通飲食，其余40只大鼠給予高糖高脂飲食(普通飼料60.5%，蔗糖20%，豬油10%，膽固醇2%，蛋黃粉1.5%，豆油6%)，連續(xù)飼喂4周，一次性注射30 mg/kg的鏈脲佐霉素(對(duì)照組同期注射等量生理鹽水)，繼續(xù)高糖高脂飲食飼喂4周，空腹尾靜脈采血測(cè)量空腹血糖并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)，以FPG>11.1 mmol/L且ISI降低作為成模標(biāo)準(zhǔn)，共成模26只，余大鼠剔除。將26只大鼠隨機(jī)分為模型組和觀察組，觀察組給予利拉魯肽100 μg/kg皮下注射，模型組和正常對(duì)照組均給予等量生理鹽水皮下注射，干預(yù)時(shí)間4周。期間注意觀察大鼠的毛發(fā)改變、食欲、大小便、活動(dòng)、體重等變化，根據(jù)大鼠的體重調(diào)整劑量。

1.2.2觀察指標(biāo) 最后一次給藥后禁食12 h，稱取體重，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血10 ml，采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血脂、血糖和肝功能指標(biāo)，ELISA檢測(cè)CHFR1-5水平，采用免疫散射比濁法檢測(cè)補(bǔ)體C3、C4、C5和BF水平，取血后快速取出完整肝臟，取部分肝組織用10%甲醛溶液固定，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，切片1 μm，常規(guī)HE染色，先在低倍鏡下觀察肝臟大體情況，再調(diào)至高倍鏡下觀察；另取部分肝臟組織冰凍，進(jìn)行油紅O染色，采用撈片染色法，肝細(xì)胞脂肪病變范圍通過(guò)半定量進(jìn)行評(píng)估，根據(jù)肝細(xì)胞腺泡結(jié)構(gòu)測(cè)算脂肪變的肝細(xì)胞百分比：5%～33%為輕度脂肪變，34%～66%為中度脂肪變，>66%為重度脂肪變。

2 結(jié)果

2.13組補(bǔ)體水平比較 模型組和觀察組C3、C4、C5、BF水平均高于對(duì)照組，觀察組C3、C4、C5、BF水平均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.23組CHFR1～5水平比較 模型組和觀察組大鼠CHFR1、CHFR2、CHFR3、CHFR4、CHFR5水平均高于對(duì)照組，觀察組大鼠CHFR1、CHFR2、CHFR3、CHFR4、CHFR5水平均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.33組大鼠糖代謝指標(biāo)比較 模型組和觀察組大鼠FBG、HOMA-IR水平均顯著高于對(duì)照組，觀察組大鼠FBG、HOMA-IR水平均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.43組大鼠脂代謝指標(biāo)和肝功能指標(biāo)比較 模型組和觀察組大鼠TG、TC、ALT、AST水平均高于對(duì)照組，觀察組TG、TC、ALT、AST水平均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

2.53組大鼠肝臟病理改變 對(duì)照組大鼠肝小葉中央靜脈周?chē)伟褰Y(jié)構(gòu)排列規(guī)則，肝索間可見(jiàn)肝竇，肝細(xì)胞未見(jiàn)腫脹及脂肪變性，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)破壞及硬化等改變；與對(duì)照組相比較，模型組大鼠肝組織內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂肪空泡，細(xì)胞核被擠向周邊，部分可見(jiàn)散在壞死灶及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；觀察組與模型組相比較肝臟脂肪組織病變減輕，胞漿脂滴減少，肝功能結(jié)構(gòu)較完整，肝索排列較清晰。HE染色結(jié)果見(jiàn)圖1，油紅O染色結(jié)果見(jiàn)圖2。半定量結(jié)果顯示，模型組肝臟脂肪病變程度高于對(duì)照組和觀察組，觀察組肝臟脂肪病變程度低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表3 3組大鼠糖代謝指標(biāo)相比較

表1 3組補(bǔ)體水平相比較

表2 3組CHFR1～5水平相比較

表4 3組大鼠脂代謝指標(biāo)和肝功能指標(biāo)相比較

圖1 3組大鼠肝臟組織HE染色結(jié)果Fig.1 HE staining results of of liver tissue in three groupsNote:A.Control group;B.Model group;C.Observation group.

圖2 3組大鼠肝臟組織油紅O染色結(jié)果Fig.2 Oil red O staining results of liver tissue in three groups of ratsNote:A.Control group;B.Model group;C.Observation group.

表5 肝細(xì)胞脂肪病變的半定量分析結(jié)果

3 討論

臨床上將排除酒精和其他明確因素所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過(guò)度沉積疾病稱為NAFLD，包括單純脂肪變性、脂肪性肝炎、肝纖維化及肝硬化，T2DM是以胰島素抵抗為特征的糖代謝紊亂性疾病，NAFLD和T2DM發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但胰島素抵抗是二者發(fā)病的關(guān)鍵因素已經(jīng)得到共識(shí)，改善胰島素抵抗是治療T2DM和NAFLD的有效方式[9]。研究顯示，口服負(fù)荷劑量胰島素后，腸因性胰島素分泌占人體總胰島素分泌的50%～70%，T2DM患者存在腸促胰島素作用受損，基于腸促胰島素的藥物可改善胰島素功能[10]。GLP-1是人體內(nèi)腸源性激素，在胰腺β細(xì)胞中，GLP-1以葡萄糖濃度依賴性的方式作用于胰島素β細(xì)胞，促進(jìn)胰島素基因轉(zhuǎn)錄，增加胰島素合成和分泌，增加葡萄依賴性胰島素反應(yīng)性，保護(hù)β細(xì)胞，改善胰島素抵抗[11]。既往研究顯示，GLP-1除對(duì)胰腺作用外，還可通過(guò)促進(jìn)靶組織糖原合成、抑制胃排空、抑制食欲、減少胃腸吸收、降低血漿游離脂肪酸等方式改善糖脂代謝[12]。陳五一等[13]研究顯示，GLP-1類似物利拉魯肽可改善NAFLD大鼠的脂代謝紊亂和胰島素抵抗，激活MAPK途徑逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞變性。邢冬杰等[14]研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了利拉魯肽對(duì)NAFLD合并T2DM大鼠糖脂代謝和細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，利拉魯肽可降低NAFLD合并T2DM大鼠FBG、HOMA-IR、TC、TG水平，并能上調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)凋亡促進(jìn)蛋白Bax，抑制肝細(xì)胞凋亡。ZHANG等[15]報(bào)道采用利拉魯肽干預(yù)8周可明顯改善高脂誘導(dǎo)的低脂聯(lián)素水平載脂蛋白(Apo)E敲除小鼠肝臟脂肪的堆積，改善肝臟組織學(xué)形態(tài)，降低總脂質(zhì)水平。本研究結(jié)果顯示，觀察組采用利拉魯肽治療4周后，F(xiàn)BG、HOMA-IR、TC、TG、ALT、AST水平均低于模型組，肝臟形態(tài)較模型組明顯改善，結(jié)果提示利拉魯肽可改善T2DM合并NAFLD大鼠模型的糖脂代謝水平，改善肝臟形態(tài)，與上述研究一致。

補(bǔ)體系統(tǒng)參與肝臟脂質(zhì)沉積發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，肝脂肪變性時(shí)過(guò)多的脂肪細(xì)胞可分泌多種炎癥因子，炎癥因子激活補(bǔ)體C3、C5并介導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)，補(bǔ)體系統(tǒng)的激活又可抑制炎癥細(xì)胞凋亡，引起炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大，加重肝臟脂質(zhì)沉積和脂肪性變，形成惡性循環(huán)[16]。體外研究顯示，拮抗C3、C5補(bǔ)體激活可改善脂肪組織低水平炎癥反應(yīng)和胰島素敏感性[17]。臨床研究顯示，健康體檢者肝臟中檢測(cè)不到補(bǔ)體成分活化，而高達(dá)74%的NAFLD患者肝組織中有C3活性成分和C4d沉積，在嚴(yán)重肝臟脂肪病變患者中更為顯著[18]。SEGERS等[19]一項(xiàng)肝組織活檢的研究顯示，NAFLD患者肝組織C3活化率顯著升高，C3轉(zhuǎn)化酶穩(wěn)定因子P因子和C3a活化產(chǎn)物C3c沉積，且沉積與肝細(xì)胞炎癥水平呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠補(bǔ)體水平顯著升高，與上述臨床和基礎(chǔ)研究一致，這些結(jié)果提示，補(bǔ)體激活在NAFLD中通過(guò)不同途徑廣泛激活，并與病情程度相關(guān)，給NAFLD的預(yù)防和治療提供了新的靶點(diǎn)。

劉永安等[20]研究顯示，血清補(bǔ)體C3、C5和激素ASP與肝炎、肝纖維化、肝硬化等肝臟疾病密切相關(guān)。補(bǔ)體C3激活途徑包括旁路途徑、抗體識(shí)別和經(jīng)典途徑，三種途徑均可導(dǎo)致C3轉(zhuǎn)化酶產(chǎn)生，C3轉(zhuǎn)化酶可將C3分裂為C3b，C3b則可與CFH結(jié)合終止C3活化，抑制補(bǔ)體活化，而CFHR則可競(jìng)爭(zhēng)性抑制CFH表面配體影響CFH對(duì)補(bǔ)體活化的抑制作用[21-22]。王俊等[23]在T2DM中的研究顯示，T2DM患者血漿中檢測(cè)到CFHR1多肽質(zhì)譜強(qiáng)表達(dá)。沈麗芳等[24]對(duì)T2DM研究顯示，CFHR與TG呈正相關(guān)，與HDL-C呈負(fù)相關(guān)，該研究結(jié)果認(rèn)為CFH通過(guò)補(bǔ)體旁路途徑，改變補(bǔ)體通路成分，CHFR水平升高是導(dǎo)致胰島素抵抗和糖代謝紊亂的重要機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，模型組和觀察組CFHR1～5及補(bǔ)體系統(tǒng)水平均高于對(duì)照組，結(jié)果提示NALFD合并T2DM大鼠體內(nèi)存在CFHR1～5表達(dá)水平升高，結(jié)果與王俊、沈麗芳等結(jié)果一致，這些結(jié)果均提示，NAFLD合并T2DM動(dòng)物模型存在CFHR1～5水平升高和補(bǔ)體系統(tǒng)激活。本研究結(jié)果顯示，觀察組CFHR1～5和補(bǔ)體水平均低于模型組，結(jié)果提示，GLP-1類似物利拉魯肽對(duì)CFHR1～5和補(bǔ)體系統(tǒng)激活具有抑制作用。

綜上所述，GLP-1類似物用于NAFLD大鼠可降低CFHR1～5水平，抑制補(bǔ)體激活，改善糖脂代謝和肝功能，本研究因條件所限，僅觀察了GLP-1類似物對(duì)CFHR1～5水平和補(bǔ)體水平的影響，并未對(duì)GLP-1類似物通過(guò)何種機(jī)制影響CFHR1～5水平進(jìn)行探討。經(jīng)查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，目前亦尚未見(jiàn)GLP-1類似物對(duì)CFHR作用機(jī)制的報(bào)道，GLP-1類似物影響CFHR作用機(jī)制的深入研究對(duì)NAFLD的防治具有重要的指導(dǎo)意義，也為下一步研究指明了方向。