陳興峰 張秀峰 石慧芳 何海武

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，?？?570311)

氣道、血管和胃腸道平滑肌細(xì)胞可以誘導(dǎo)分泌大量生物活性分子，促進炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)[1-2]。其中氣道平滑肌(airway smooth muscle,ASM)細(xì)胞合成并釋放的細(xì)胞因子參與氣道高反應(yīng)性，在支氣管哮喘發(fā)病過程中促進氣道重塑，其分泌的主要炎癥因子包括IL-1β、IL-6、IL-8和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)/趨化因子配體2(CCL2)，它們均依賴于ASM細(xì)胞中絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號通路中p38絲裂原的激活，MAPK信號通路的傳導(dǎo)參與支氣管哮喘的過敏性損傷[3-4]。MK2和MK3屬于MAPK活化蛋白激酶(MKs)，主要由p38 a/b MAPK激活[5-6]。雖然MK2和MK3具有相同的底物識別序列，在相同的細(xì)胞應(yīng)激和炎癥刺激時可被激活[7-9]，但MK2在體內(nèi)的表達(dá)和活性卻明顯強于MK3[10]。MK2中富含脯氨酸的SH3結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可調(diào)節(jié)各種類型細(xì)胞的遷移，MK3不具有此功能[11]。本研究從支氣管中分離出支氣管平滑肌細(xì)胞，通過腺病毒感染后使MK2、MK3高表達(dá)，檢測MK2、MK3過表達(dá)對細(xì)胞因子分泌的影響并進一步分析其作用機制，為支氣管哮喘的治療提供可靠的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 野生型MK2(MK2WT)、野生型MK3(MK2WT)腺病毒和腺病毒載體pAdTrack-CMV由上海中洪博元生物技術(shù)有限公司合成；M199培養(yǎng)液、胎牛血清、人表皮生長因子、人成纖維細(xì)胞生長因子和胰島素購于賽默飛公司；慶大霉素、兩性霉素B和PBS溶液購于北京鼎國技術(shù)有限公司；D-Hanks購于北京索萊寶有限公司；IL-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和干擾素-γ(IFN-γ)細(xì)胞因子購于美國Upstate Biotechnology公司；SDS-PAGE細(xì)胞裂解液購于碧云天生物技術(shù)有限公司；抗-磷酸化熱休克蛋白2(rHSP2)、抗-p38MAPK、抗-p-p38MAPK、抗-核因子κB抑制因子α(IκBα)、抗-β-actin、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購于美國Cell Signaling Technology公司；ELISA試劑盒購于上海酶聯(lián)生物公司。

1.2方法

1.2.1原代支氣管平滑肌細(xì)胞的分離培養(yǎng) 取在我院進行肺切除手術(shù)的肺癌患者癌癥旁組織中的主支氣管，分離培養(yǎng)人支氣管平滑肌細(xì)胞，患者知情同意并簽署知情同意書。采取組織塊貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)原代支氣管平滑肌細(xì)胞。具體方法如下：將分離的主支氣管放入含100 U/ml雙抗的D-Hanks液中，在超凈臺中去除血污及多余的結(jié)締組織，縱行剖開氣管，去除外膜和內(nèi)膜，用眼科剪將氣管剪成約1 mm×1 mm×1 mm的小組織塊，貼在6 cm的培養(yǎng)皿底部放置于恒溫箱中。待組織塊干涸后加入2 ml含20%胎牛血清的M199培養(yǎng)液，靜置3 d后再加入3 ml 同樣的培養(yǎng)液，以后每3 d換一次培養(yǎng)液，直至培養(yǎng)出原代支氣管平滑肌細(xì)胞。第4～7代細(xì)胞置于體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、37℃恒溫箱中孵育。M199培養(yǎng)液中含10%胎牛血清、0.5 ng/ml人表皮生長因子、2 ng/ml 人成纖維細(xì)胞生長因子、 5 μg/ml培養(yǎng)液胰島素、 50 μg/ml慶大霉素和50 ng/ml兩性霉素B。

1.2.2Western blot實驗

1.2.2.1MK2和MK3蛋白的過表達(dá) 當(dāng)細(xì)胞密度生長至80%～90%時，去除上清液，進行以下處理：對照組在培養(yǎng)皿中滴加腺病毒載體pAdTrack-CMV，實驗組在培養(yǎng)皿中滴加含MK2、MK3的腺病毒[設(shè)置不同的感染系數(shù)(MOI)：20、40、80]，用含0.1%胎牛血清的M199 200 μl孵育1 h。去除上清液，加入含0.1%胎牛血清的M199培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集實驗組細(xì)胞和對照組細(xì)胞，用SDS-PAGE細(xì)胞裂解液將其裂解，BCA蛋白定量試劑盒取30 μg蛋白。分別配制10%的分離膠和5%的濃縮膠，進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。根據(jù)Marker和目的蛋白相對分子質(zhì)量大小切取適當(dāng)大小的膜，用5%脫脂奶粉封閉，一抗(1∶1 000)過夜孵育，TBST溶液清洗，二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h，TBST溶液清洗。配置適量顯影液，均勻滴加在膜上，置于Amersham Imager600凝膠成像系統(tǒng)中拍照。MK2、MK3蛋白表達(dá)相對穩(wěn)定時所對應(yīng)的感染系數(shù)為最佳感染系數(shù)。

1.2.2.2磷酸化rHSP27及MAPK和NF-κB信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá) 收集經(jīng)促炎因子(IL-1β、TNF-α、IFN-γ，質(zhì)量濃度均為10 ng/ml)刺激24 h的感染MK2WT、MK3WT腺病毒的支氣管平滑肌細(xì)胞以及對照組細(xì)胞(分別標(biāo)記為：MK2WT-T、MK3WT-T、Control-T)和未經(jīng)促炎因子刺激的感染MK2WT、MK3WT腺病毒的支氣管平滑肌細(xì)胞以及對照組細(xì)胞(分別標(biāo)記為：MK2WT-N、MK3WT-N、Control-N)，采用Western blot檢測各組細(xì)胞中磷酸化rHSP27及MAPK和NF-κB信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，具體方法同1.2.2.1。以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白β-actin灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。以對照組中促炎因子未處理組目的蛋白相對表達(dá)量為1。

1.2.3ELISA檢測細(xì)胞因子分泌水平

1.2.3.1促炎因子處理組及促炎因子未處理組 促炎因子處理組：用含IL-1β、TNF-α和IFN-γ細(xì)胞因子(質(zhì)量濃度均為10 ng/ml)的培養(yǎng)液處理支氣管平滑肌細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液。促炎因子未處理組：在培養(yǎng)液中加入相同體積的PBS溶液作為對照，處理支氣管平滑肌細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液。根據(jù)ELISA試劑盒檢測IL-1α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-1β、TNF-α、IFN-γ、MCP-1/CCL2、RANTES/CCL5的含量。在檢測之前應(yīng)先確定每個細(xì)胞因子的稀釋濃度，以確保檢測值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測范圍之內(nèi)。

1.2.3.2腺病毒處理組和對照組 使用AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒，將MK2WT和MK3WT質(zhì)?？寺≈羛AdTrack-VMV載體上。然后轉(zhuǎn)染至含有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy的大腸桿菌宿主菌株BJ5183中，篩選出具有卡那霉素抗性的MK2WT和MK3WT質(zhì)粒。腺病毒處理組：將感染系數(shù)為40的MK2WT、MK3WT腺病毒感染支氣管平滑肌細(xì)胞；對照組：腺病毒載體pAdTrack-CMV感染支氣管平滑肌細(xì)胞。腺病毒處理組和對照組均用含IL-1β、TNF-α和IFN-γ細(xì)胞因子(質(zhì)量濃度均為10 ng/ml)的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液。采用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中RANTES/CCL5、MCP-1/CCL2和IL-6的水平。以對照組RANTES/CCL5、MCP-1/CCL2和IL-6的表達(dá)水平為1，計算其余各組相對于對照組RANTES/CCL5、MCP-1/CCL2和IL-6的表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計分析，Graphad Prism5和Photoshop軟件作圖，所有數(shù)據(jù)以χ2表示，采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1原代培養(yǎng)的支氣管平滑肌細(xì)胞 分離出的支氣管平滑肌細(xì)胞貼壁伸展，細(xì)胞形態(tài)大小不一，呈梭形、不規(guī)則形、三角形，培養(yǎng)大約2周后細(xì)胞融合，多數(shù)細(xì)胞伸展成梭形，有分支突起，細(xì)胞密度低時常交織成網(wǎng)狀(圖1)，細(xì)胞密度高時則排列成旋渦狀。

2.2MK2、MK3蛋白在支氣管平滑肌細(xì)胞中的過表達(dá)及腺病毒最佳感染系數(shù) 結(jié)果見圖2。支氣管平滑肌細(xì)胞感染野生型腺病毒后，與未感染腺病毒組相比MK2、MK3蛋白表達(dá)均增加。當(dāng)腺病毒感染系數(shù)達(dá)到40時，MK2、MK3蛋白表達(dá)相對穩(wěn)定，故在后續(xù)的實驗中均采用感染系數(shù)40進行實驗。

2.3腺病毒感染支氣管平滑肌細(xì)胞后MK2、MK3蛋白的活性 通過檢測rHSP27的磷酸化水平反映MK2、MK3蛋白的活性。結(jié)果見圖3。促炎因子處理組感染MK2WT腺病毒的細(xì)胞中rHSP27磷酸化水平高于促炎因子未處理組感染MK2WT腺病毒的細(xì)胞，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。同時促炎因子處理組感染MK3WT腺病毒的細(xì)胞中rHSP27磷酸化水平高于促炎因子未處理組感染MK3WT腺病毒的細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MK2WT和MK3WT促炎因子處理組rHSP27磷酸化水平均高于對照組促炎因子處理組(P<0.001)。

圖1 原代培養(yǎng)的支氣管平滑肌細(xì)胞Fig.1 Primary cultured bronchial smooth muscle cells

圖2 腺病毒感染支氣管平滑肌細(xì)胞后MK2、MK3的過表達(dá)Fig.2 Overexpression of MK2 and MK3 after adenovirus infection of bronchial smooth muscle cells

2.4支氣管平滑肌細(xì)胞中MK2、MK3的過表達(dá)對細(xì)胞因子分泌的影響 結(jié)果如表1所示，促炎因子刺激后，支氣管平滑肌細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α、IFN-γ和RANTES/CCL5增加，從而促進IL-6和MCP-1/CCL2的分泌(P<0.05)，但對IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12(p70)和IL-13的分泌沒有影響。由圖4可見，MK2WT、MK3WT腺病毒感染支氣管平滑肌細(xì)胞后，用同樣的促炎因子刺激，與對照組比較，MK2WT組細(xì)胞分泌IL-6水平增加，MK3WT組細(xì)胞分泌IL-6水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，MK2WT組和MK3WT組細(xì)胞分泌RANTES/CCL5水平均降低(P<0.001)。

2.5支氣管平滑肌細(xì)胞中MK2和MK3的過表達(dá)對MAPK和NF-κB信號通路的影響 結(jié)果見圖5、圖6。對照組、MK2WT和MK3WT促炎因子處理后與未經(jīng)促炎因子處理相比p38MAPK的表達(dá)水平增加(P<0.001)，MK2WT和MK3WT促炎因子處理組與對照組促炎因子處理組相比，MK2WT促炎因子處理組磷酸化p38MAPK的表達(dá)水平高于對照組促炎因子處理組(P<0.001)，MK3WT促炎因子處理組磷酸化p38MAPK的表達(dá)水平與對照組促炎因子處理組相比無統(tǒng)計學(xué)差異，MK2WT組中磷酸化p38MAPK的表達(dá)水平高于MK3WT組(P<0.001)，說明MAPK信號通路的激活主要依賴于MK2；對照組、MK2WT和MK3WT促炎因子處理后與未經(jīng)促炎因子處理相比IκBα的表達(dá)水平降低(P<0.01)，說明NF-κB信號通路被激活，MK2WT促炎因子處理后IκBα的表達(dá)水平高于對照組促炎因子處理組(P<0.001)，MK3WT的腺病毒組IκBα的表達(dá)水平低于感染MK2WT的腺病毒組(P<0.05)，故NF-κB信號通路的激活主要依賴于MK3。

圖3 磷酸化熱休克蛋白27蛋白水平變化Fig.3 Changes in phosphorylated heat shock protein 27 protein levelsNote:1.Control-N；2.Control-T；3.MK2WT-N；4.MK2WT-T；5.MK3WT-N；6.MK3WT-T.

表1 促炎因子刺激支氣管平滑肌細(xì)胞分泌細(xì)胞因子

圖4 腺病毒感染支氣管平滑肌細(xì)胞后對MK2、MK3蛋白活性的影響Fig.4 Effect of adenovirus infection on bronchial smooth muscle cells on MK2 and MK3 protein activityNote:Gray level analysis of the phosphorylated heat shock protein 27 protein band was performed to calculate the relative expression level of the untreated histone relative to the control inflammatory factor;**.P<0.001 vs MK2WT-Non-treatde；*.P<0.05 vs MK3WT-Non-treatde.

圖5 MK2、MK3對支氣管平滑肌細(xì)胞IL-6和RANTES/CCL5分泌的影響Fig.5 Effect of MK2 and MK3 on IL-6 and RANTES/CCL5 secretion in bronchial smooth muscle cellsNote:*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001 vs Control.

圖6 MK2、MK3過表達(dá)對MAPK和NF-κB信號通路的影響Fig.6 Effect of MK2 and MK3 overexpression on MAPK and NF-κB signaling pathwaysNote:1.Control-N；2.Control-T；3.MK2WT-N；4.MK2WT-T；5.MK3WT-N；6.MK3WT-T.**.P<0.01,***.P<0.001 vs Control-Treated；###.P<0.001 vs MK2WT-Non-Treated.

3 討論

本研究主要探討p38MAPK活性調(diào)節(jié)因子MK2、MK3在支氣管炎癥中對細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)作用及具體機制，通過檢測經(jīng)野生型MK2、MK3腺病毒感染的支氣管平滑肌細(xì)胞中MK2、MK3的蛋白表達(dá)活性，MK2、MK3對細(xì)胞因子分泌及對MAPK和NF-κB信號通路的影響，以期為支氣管哮喘的治療提供可靠的理論依據(jù)。經(jīng)腺病毒感染的支氣管平滑肌細(xì)胞，促炎因子處理后，MK2WT蛋白活性最高，HSP27為磷酸化MK2/MK3的主要底物之一，HSP27的磷酸化水平可反映MK2/MK3的蛋白活性[12]。有文獻報道在氣道炎癥反應(yīng)時支氣管平滑肌細(xì)胞可分泌IL-2、IL-5、IL-12[13]。然而在本實驗中并未檢測到Th1細(xì)胞因子包括IL-2、IL-12和Th2細(xì)胞因子包括IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等的分泌。以上結(jié)果說明，促炎因子刺激支氣管平滑肌細(xì)胞后對Th1/Th2分泌細(xì)胞因子沒有影響，但可以誘導(dǎo)IL-6、IL-1β、MCP-1/CCL2和RANTES/CCL5的分泌。然而感染腺病毒的支氣管平滑肌細(xì)胞僅對IL-6和RANTES/CCL5的分泌有影響，不影響MCP-1/CCL2的分泌。MCP-1/CCL2在哮喘患者支氣管肺泡灌洗液和血清中顯著升高，為過敏性哮喘的潛在生物標(biāo)志物[7-10]。通過抑制p38MAPK可減弱MCP-1/CCL2的分泌[11]，在本研究中MK2和MK3的過表達(dá)還不足以對MCP-1/CCL2的分泌進行調(diào)節(jié)。

NF-κB信號通路是炎癥反應(yīng)中的重要信號通路，在脂多糖(LPS)、TNF-α單獨或聯(lián)合使用下可被激活[14-17]。車楠等[18]研究顯示，抑制P13K/Akt/NF-κB/MMP-9信號通路的傳導(dǎo)可發(fā)揮對支氣管哮喘小鼠氣道重構(gòu)的抑制作用。在本研究中，MK2的過表達(dá)抑制NF-κB信號通路的激活，且不受其他細(xì)胞因子刺激的影響，然而MK3WT的過表達(dá)在促炎因子處理組中可激活NF-κB信號通路。在MAPK信號通路中，經(jīng)促炎因子刺激后MK2WT組p38MAPK磷酸化水平明顯提高，且顯著高于MK3WT組，說明MK2WT在MAPK信號通路激活中占主導(dǎo)地位。在MK2缺陷小鼠中，TNF-α、IL-6和IFN-γ分泌減少，而MK3缺陷小鼠中細(xì)胞因子的分泌卻沒有明顯的改變[19-20]，因此說明MK2和MK3對細(xì)胞因子分泌的影響不同。結(jié)合本研究可得知，MK2WT對MAPK信號通路具有調(diào)節(jié)作用，MK3WT對NF-κB信號通路具有調(diào)節(jié)作用，可通過靶向MK2WT和MK3WT調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌。綜上所述，MK2和MK3在支氣管平滑肌細(xì)胞中通過不同的信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌，通過靶向MKs可調(diào)節(jié)支氣管氣道炎癥反應(yīng)，有可能成為治療支氣管氣道炎癥反應(yīng)的一種有效方法。