姚曉云 ，熊運華，黃永萍，吳延壽，楊 平，劉 進(jìn)，尹建華*

（1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，江西南昌 330200；2.水稻國家工程實驗室（南昌）/國家水稻改良中心南昌分中心，江西南昌 330200）

【研究意義】水稻屬喜溫作物，對低溫環(huán)境較為敏感。低溫冷害導(dǎo)致出苗率低、秧苗生長遲滯，是中高緯度地區(qū)水稻生產(chǎn)的常見問題，也是限制水稻高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)的關(guān)鍵因子[1-3]。我國北方稻區(qū)芽期、苗期遭遇低溫環(huán)境常導(dǎo)致發(fā)芽率低、幼苗生根少和葉片枯黃，南方稻區(qū)早稻育秧遭遇低溫（倒春寒）常出現(xiàn)發(fā)芽率降低和死苗爛秧，尤其是近年來隨著直播稻的盛行，芽期耐冷問題日益凸顯[3-6]。利用優(yōu)異耐冷資源和基因培育抗冷品種是解決冷害問題的最有效途徑之一，鑒定新的耐冷優(yōu)異種質(zhì)和基因資源對培育耐寒新品種具有重要的理論和現(xiàn)實意義。【前人研究進(jìn)展】近年來，研究者[7-8]利用不同遺傳群體對水稻芽期、苗期、孕穗期和灌漿期耐冷性的生理機制和遺傳機理進(jìn)行了相關(guān)研究，相關(guān)QTL 分布于12 條染色體上，少數(shù)幾個QTL 被精細(xì)鑒定或克隆?！颈狙芯壳腥朦c】諸多研究表明，耐冷性是復(fù)雜的數(shù)量性狀，不同遺傳背景下耐冷QTL 存在著較大差異，耐冷特性的遺傳及調(diào)控機理仍不甚清楚，諸多問題亟待解決，仍需對水稻耐冷特性相關(guān)基因分子調(diào)控機理進(jìn)行深入研究[4,9]。此外，研究[10-11]表明，粳稻較之秈稻有較強的耐冷性，而有關(guān)秈粳屬性量化指標(biāo)與耐冷性變異的關(guān)系研究較少。秈粳屬性與芽期、苗期耐冷性呈顯著負(fù)相關(guān)，抽穗期的耐冷指數(shù)與秈粳程度無顯著相關(guān)[4]。徐沖[12]研究表明，不同耐冷性品種秈粳屬性存在明顯差異，高抗品種秈型基因型較低，低抗品種秈型成分較多。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究利用耐冷型粳稻龍稻5 號和冷敏感的秈稻中優(yōu)早8 雜交衍生的RIL 群體為試驗材料，以低溫脅迫下的發(fā)芽率為指標(biāo)評價低溫環(huán)境下種子活力，探究秈粳屬性對芽期耐冷性的影響，以期發(fā)掘水稻芽期耐冷的主效QTL。利用耐冷優(yōu)異基因從根本上提高水稻低溫抗性，為培育新的耐冷性品種提供基礎(chǔ)種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以耐冷型粳稻龍稻5 號（Longdao5，LD5）和冷敏感秈稻中優(yōu)早8（Zhongyouzao8，ZYZ8）雜交衍生的重組自交系（recombinant inbred lines，RILs）群體和雙親作為試驗材料，RIL群體包含170個株系（F8）。大田試驗于2018年江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻所試驗基地進(jìn)行，田間管理同當(dāng)?shù)卮筇镌耘喙芾?。成熟后收?穴稻穗混合脫粒，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 耐冷性測定

參考2013—2018年氣溫記錄信息，適時進(jìn)行自然低溫脅迫處理，分別于2019年3月5—26日進(jìn)行2批低溫處理試驗，去除偏離值取2 次試驗均值統(tǒng)計分析；采用人工氣候箱進(jìn)行低溫脅迫處理（白天14 h，15 ℃；夜晚10 h，10 ℃），低溫處理10 d。發(fā)芽試驗前首先進(jìn)行破除種子休眠處理，42 ℃處理24 h，選取飽滿籽粒進(jìn)行發(fā)芽試驗；測定自然低溫和人工低溫脅迫環(huán)境下親本和各株系的發(fā)芽率，以低溫脅迫下發(fā)芽率評價低溫環(huán)境下種子活力，2次重復(fù)，取均值統(tǒng)計分析。

圖1 2019年3月江西省南昌縣溫度情況記錄及低溫處理日期Fig.1 The temperature in Nanchang County，Jiangxi Province in March 2019，and then the low temperature treatment date

1.3 QTL分析

分子遺傳圖譜包含223個分子標(biāo)記，圖譜覆蓋水稻基因組約1 514.0 cM，標(biāo)記間平均距離為6.79 cM，平均每對染色體上的標(biāo)記數(shù)為18.58[13]。采用QTL ICI Mapping v4.2的完備區(qū)間作圖（ICIM）方法[14]進(jìn)行加性效應(yīng)、上位互作效應(yīng)QTL 分析，依據(jù)閾值判定QTL 存在與否，并估算QTL 的效應(yīng)值和貢獻(xiàn)率大小。QTL的命名遵循McCouch[15]的原則。

1.4 秈粳屬性判定

以親本為對照，與ZYZ8帶型一致的記為II（秈型），與LD5帶型一致的記為JJ（粳型），雜合帶型記為IJ（雜合型）。根據(jù)223個秈粳特異SSR位點的基因型數(shù)據(jù)計算確定各供試樣品的秈型基因頻率Fi。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐冷性分析

不同低溫處理下，中優(yōu)早8 與龍稻5 號的發(fā)芽率均存在顯著差異；龍稻5 號具有較強耐冷，不同低溫脅迫下種子的發(fā)芽率顯著高于冷敏感品種中優(yōu)早8（表1）。RIL群體各株系低溫脅迫下發(fā)芽率存在較大幅度變異，呈現(xiàn)雙向超親分離，近似連續(xù)的正態(tài)分布（圖1）。自然低溫和人工低溫脅迫處理下的發(fā)芽率呈極顯著正相關(guān)，這表明人工和自然低溫脅迫具有較好的重演性；RIL群體屬于典型秈粳交群體，各株系呈現(xiàn)秈粳中間類型，耐冷性與秈型成分存在不顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（圖2，表2）。

表1 親本和RILs群體低溫發(fā)芽率及秈粳基因型分析Tab.1 Distribution of germination rate under low temperature environments for parents and RIL population

圖2 親本和RIL群體低溫環(huán)境下發(fā)芽率及秈粳屬性分布情況Fig.2 Distribution of Indica-japonica differentiation，the parents and RIL population GR under low temperature environments

表2 低溫脅迫環(huán)境下發(fā)芽率與秈粳屬性相關(guān)性分析Tab.2 Correlation coefficients among germination rates under different natural and artificial environments

2.2 不同低溫處理條件下耐冷QTL鑒定

自然低溫環(huán)境下，檢測到5 個發(fā)芽率相關(guān)的QTL，分布于第2、7、8、11 和12 號染色體上，LOD值介于2.40～3.05，解釋6.41%～9.41%的表型變異，5 個QTL 表型聯(lián)合貢獻(xiàn)率為41.42%，加性效應(yīng)為-8.28%～8.81%（表3，圖3）。其中qLTGN8表型貢獻(xiàn)率和加性效應(yīng)值均較大，增效等位基因來自ZYZ8，qLTGN7、qLTGN11和qLTGN12增效等位基因來自LD5，具有提高低溫脅迫下發(fā)芽率的效應(yīng)。

表3 不同低溫環(huán)境下水稻耐冷性QTL分析Tab.3 Putative QTL for cold resistance were detected under different low temperature environments

人工低溫環(huán)境下，檢測到5 個控制發(fā)芽率相關(guān)的QTL，分別位于第3、8、11 和12 號染色體上，LOD值介于2.40～6.58，表型貢獻(xiàn)率在3.42%～64.39%。其中qLTGA3效應(yīng)明顯，表型貢獻(xiàn)率和效應(yīng)值均超過20.00%，具有明顯的調(diào)控低溫脅迫環(huán)境下的發(fā)芽率。第8、11和12 號染色體的耐冷性QTL在不同低溫脅迫環(huán)境下共性表達(dá)，即qLTG8（qLTGN8/qLTGA8）、qLTG11（qLTGN11/qLTGA11b）和qLTG12（qLTGN12/qLT?GA12）具有穩(wěn)定調(diào)控不同低溫處理環(huán)境下發(fā)芽率的效應(yīng)。

圖3 不同低溫處理條件下發(fā)芽率QTL染色體分布Fig.3 Location of QTLs under different low temperature conditions on the genetic map

表4 不同低溫環(huán)境下水稻發(fā)芽率上位性互作分析Tab.4 QTL with epistasis effects for GR under different low temperature environments

2.3 不同低溫處理條件下耐冷QTL上位性分析

ICIM-EPI 模型對低溫脅迫下發(fā)芽率進(jìn)行上位性效應(yīng)分析，共檢測到17 對上位性互作位點，分布于1～8，11和12號染色體上，LOD值和表型貢獻(xiàn)率均值分別為4.43和22.62%，上位性效應(yīng)介于-21.85～21.62（表4）。位于第1、2、6 和12 染色體上相應(yīng)的染色體區(qū)段對其它區(qū)域具有明顯的上位性作用，加性效應(yīng)QTLqLTGN2、qLTG8和qLTGA11a參與上位性互作，其中第2 染色體的加性效應(yīng)QTLqLTGN2與第4、5、6、7 和11 號染色體相關(guān)區(qū)段存在明顯的上位性效應(yīng)；位于第12 染色體的QTLqLTG12與第3、6 和8 號染色體上相應(yīng)區(qū)段間存在明顯的上位性效應(yīng)。發(fā)芽期耐冷性受多個上位性互作位點調(diào)控，互作效應(yīng)存在于加性效應(yīng)QTL 間、加性效應(yīng)QTL 與非加性效應(yīng)位點間，也可存在于非加性效應(yīng)位點間，這表明上位性互作效應(yīng)是調(diào)控水稻耐冷特性的重要遺傳組成。

3 討論與結(jié)論

近年來，隨著水稻輕簡化、節(jié)本增收栽培方式的推廣，直播水稻生產(chǎn)技術(shù)變得越來越普遍[16-17]。芽期和苗期低溫脅迫是制約直播稻發(fā)展的重要非生物逆境因子之一，篩選、利用強耐冷型優(yōu)異種質(zhì)和基因資源是解決這一問題的最有效途徑[18-19]。不同類型水稻品種的耐寒性存在明顯差異，秈稻和粳稻最低的生長適宜溫度分別為10 ℃和15 ℃，秈粳形態(tài)指數(shù)和耐寒性存在明顯關(guān)系，一般粳稻比秈稻更耐寒[12]。諸多研究者采用不同環(huán)境鑒定水稻芽期的耐冷性，利用自然條件鑒定水稻苗期耐冷性可靠性高、實用性強[16,20]。本研究中3月5—27日自然低溫處理中日最低溫度和平均氣溫分別在10 ℃和15 ℃左右，形成了較嚴(yán)重的芽期低溫冷害，可以準(zhǔn)確鑒定水稻芽期耐冷性的強弱，表型性狀可反映不同株系自然低溫條件下種子活力和發(fā)芽能力。研究表明，自然和人工低溫脅迫環(huán)境下，雙親發(fā)芽率均存在極顯著差異，龍稻5號的耐冷性均顯著強于中優(yōu)早8；不同株系發(fā)芽率存在較大幅度變異，自然與人工低溫脅迫下發(fā)芽率關(guān)系緊密。此外，秈粳屬性對不同株系芽期耐冷性強弱存在影響，但相關(guān)性未達(dá)到顯著水平，秈型和粳型株系中均存在強耐冷株系。

水稻芽期耐冷性是一個復(fù)雜的數(shù)量性狀，受品種自身遺傳基因、種子大小、處理時期和環(huán)境等因素的共同影響[21-23]。目前，研究者利用不同群體和環(huán)境已開展了諸多水稻耐冷性相關(guān)遺傳研究，相關(guān)QTL分布于水稻12條染色體上，定位到的QTL相對較多，而精細(xì)定位或克隆的QTL較少[8,24]。姜樹坤等[9]利用BIL群體在自然低溫下對苗期耐冷性進(jìn)行QTL分析，相關(guān)QTL分布于1、3和8號染色體，相關(guān)QTL表型貢獻(xiàn)率分別為30.8%、22.7%和10.3%；滕勝等[25]對低溫發(fā)芽率進(jìn)行QTL分析，檢測到2個主效位點qLTG4和qLTG9，其中qLTG4主要作用于發(fā)芽后期，qLTG9主要作用于發(fā)芽前期；朱金燕等[1]利用CSSL 群體為試驗材料，檢測到8 個相關(guān)位點，其中qCTP9-2表型貢獻(xiàn)率超過40%，在不同環(huán)境下共性表達(dá)，具有明顯的遺傳效應(yīng)；周勇等[26]利用CSSL 群體鑒定出23 個芽期耐冷和苗期耐冷性位點，相關(guān)QTL 分布于12 條染色體上，位于第9、11和12染色體的QTL 具有較大加性效應(yīng)，對應(yīng)代換系耐冷性較強；紀(jì)素蘭等[27]對水稻種子萌發(fā)10 d后低溫發(fā)芽力進(jìn)行QTL分析，檢測到11個QTL，其中qLTG-7和qLTG-11可在3個環(huán)境中穩(wěn)定表達(dá)，最大貢獻(xiàn)率均超過25%。本研究檢測到10 個控制芽期耐冷性相關(guān)的QTL，自然和人工低溫脅迫環(huán)境下各檢測到5 個相關(guān)的QTL，分別位于第2、3、7、8、11 和12 號染色體上，主效QTLqLTG8、qLTG11和qLTG12可調(diào)控不同低溫脅迫環(huán)境的發(fā)芽率，具有明顯遺傳效應(yīng)。本研究還檢測到17對上位性互作效應(yīng)位點，其表型貢獻(xiàn)率相對較大，具有明顯的遺傳效應(yīng)，因此芽期耐冷性受加性效應(yīng)QTL 和上位性互作效應(yīng)共同調(diào)控，具有受多基因影響的復(fù)雜分子調(diào)控機制。與前人研究結(jié)果比較表明，表型效應(yīng)最大的qLT?GA3與控制耐低溫的qLTG3[28-29]染色體位置相同，穩(wěn)定表達(dá)的qLTG11和qLTG12與qLVG11[10]、qSCT-11[24]，qCTS12[30]、qCT-12[31]所在染色體區(qū)域相近，不同遺傳群體和環(huán)境共性較好；qLTG8是一個新的穩(wěn)定表達(dá)的主效位點。本研究結(jié)果為耐冷相關(guān)主效位點的精細(xì)定位提供依據(jù)，也可為水稻芽期耐冷分子育種提供新的基因資源。