王 璐，李艷麗，熊 歡，袁德義，張 勖，鄒 鋒

（中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410004）

【研究意義】錐栗（Castanea henryi）屬于殼斗科（Fagaceae）栗屬（Castanea）植物，是我國南方重要的木本糧食樹種和重要的生態(tài)樹種[1]。錐栗果實(shí)富含淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)、纖維素及K、Mg、Ca、Fe、P 等營養(yǎng)物質(zhì)，還含有多種氨基酸和維生素[2]。近幾年來錐栗產(chǎn)業(yè)在湖南郴州、懷化、吉首、長沙等地發(fā)展迅速，成為山區(qū)農(nóng)民重要的經(jīng)濟(jì)來源，然而頻發(fā)的極端天氣導(dǎo)致丘陵山地錐栗幼苗的造林成活率低，影響我國丘陵山地錐栗產(chǎn)業(yè)健康、穩(wěn)定的發(fā)展。光合作用是植物基本的生命活動(dòng)，光合器官葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的主要場所[3]，而溫度是影響光合作用強(qiáng)弱的重要因子[4]。深入研究溫度脅迫下錐栗幼苗葉片結(jié)構(gòu)及光合響應(yīng)特征，可為錐栗苗木培育的生產(chǎn)實(shí)踐提供理論指導(dǎo)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】大量研究[5-7]表明，溫度會(huì)影響植物的光合作用，植物在適宜的生長溫度下，凈光合速率最大，低溫或高溫均會(huì)影響植物的光合作用，降低凈光合速率。在光的激發(fā)下，葉綠素所產(chǎn)生的熒光是深入研究植物光合作用的探針[8]，對葉綠素?zé)晒鈪?shù)的分析有利于了解過高或過低的溫度環(huán)境對光合系統(tǒng)的影響程度[9-10]。光合器官葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的主要場所，同時(shí)也是植物的敏感部位[11]。李艷艷等[12]證實(shí)高溫常常會(huì)使葉綠體膜結(jié)構(gòu)受到較大損害，淀粉粒膨大并且表面出現(xiàn)皺褶。低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致植物葉肉細(xì)胞內(nèi)葉綠體的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變[13]，長時(shí)間過低的溫度會(huì)導(dǎo)致相思樹（Acacia confusaMerr.）葉片葉綠體的解體[14]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人研究結(jié)果表明高溫或低溫脅迫影響植物的生長發(fā)育，如煙草（Nicotiana tabacum）[15]、葡萄（Vitis vinifera）[16]、番茄（Solanum lycopersicum）[17]和水曲柳（Fraxinus mandshurica）[18]等，然而關(guān)于溫度逆境對錐栗幼苗的影響尚未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究不同溫度脅迫對錐栗幼苗葉片結(jié)構(gòu)及光合的影響，為錐栗苗木的生產(chǎn)實(shí)踐和栽培管理提供重要的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇生長一致的兩年生錐栗‘華栗4號’嫁接苗于人工氣候室中進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，分別設(shè)置3種溫度梯度（8，28，38 ℃）處理，每20株錐栗幼苗為一個(gè)小區(qū)，3次重復(fù)，共180株幼苗，處理時(shí)間為一個(gè)月。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 光合參數(shù)的測定 使用便攜式光合儀Li-6400 測定錐栗葉片光合參數(shù)[19]：凈光合速率（Pn）、胞間CO2濃度（Ci）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（Tr）。每個(gè)處理隨機(jī)選取3株錐栗幼苗進(jìn)行測量，每株測定3片完全展開且無病蟲害的成熟葉片，每片葉重復(fù)測定3次。

1.2.2 熒光參數(shù)的測定 利用便攜式光合儀Li-6400測定熒光參數(shù)[20]：在對錐栗幼苗進(jìn)行一晚上的暗處理后，得到暗適應(yīng)下的最大熒光（Fm）。光活化0.5 h 以上，直接測定初始熒光（Fo）、實(shí)際光化學(xué)量子效率（ΦPSⅡ）、電子傳遞效率（ETR）、光化學(xué)猝滅系數(shù)（qP）等參數(shù)，根據(jù)相關(guān)公式Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm可以求出最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）。每個(gè)處理隨機(jī)選取3株錐栗幼苗進(jìn)行測量，每株測定3片完全展開且無病蟲害的成熟葉片，每片葉重復(fù)測定3次。

1.2.3 超微結(jié)構(gòu)的觀察 分別取經(jīng)各溫度處理一個(gè)月后的錐栗葉片，在葉中部主脈附近切下1 mm 的葉片，用2.5%戊二醛固定，經(jīng)梯度丙醇脫水，樹脂包埋后，用超薄切片機(jī)（Leica UC7）切片，醋酸雙鈾染色，用透射電鏡（日立HT7700）觀察拍照[21]。

1.2.4 氣孔的觀察 每個(gè)處理隨機(jī)選取3株幼苗，每株隨機(jī)選取3個(gè)葉片，并采用指甲油法觀察氣孔[22]，并在倒置顯微鏡（Leica DMi8）下觀察拍照。每個(gè)葉片選取2個(gè)視野，每視野測2個(gè)氣孔。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Microsoft Excel 2013 和SPSS19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，并運(yùn)用Image J 對圖片進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響

由表1可知，28 ℃處理下，葉綠體長度、寬度和面積分別為4.94μm、3.15μm和13.59μm2；與28 ℃處理相比，8 ℃低溫脅迫下，錐栗葉片葉綠體長度和面積顯著增大（P＜0.05），分別為7.18μm和15.27μm2；38 ℃高溫脅迫下，葉綠體的長度、寬度和面積均顯著增大（P＜0.05），分別為5.15μm、3.94μm和16.00μm2。

表1 不同溫度下錐栗葉片葉綠體長度、寬度和面積Tab.1 Chloroplast length，width and area of Castanea henryi leaves at different temperatures

根據(jù)圖1B 和1E 可知，在28 ℃處理下，錐栗葉片葉肉細(xì)胞內(nèi)的葉綠體超微結(jié)構(gòu)正常，葉綠體緊挨細(xì)胞膜排列，膜結(jié)構(gòu)完整，被膜清晰，基粒片層排列整齊并且片層結(jié)構(gòu)發(fā)達(dá)，存在淀粉粒。與之相比，由圖1C 和1F 可見，38 ℃高溫脅迫下，葉綠體明顯膨脹變圓，雙層膜模糊，淀粉粒明顯變大且數(shù)量有所增加。在8 ℃低溫脅迫下，葉綠體少許膨脹，同時(shí)膜結(jié)構(gòu)受到較大損害，基粒片層結(jié)構(gòu)受到破壞，淀粉粒增大（圖1A和1D）。

2.2 溫度對氣孔結(jié)構(gòu)的影響

由表2 可知，與28 ℃處理相比，8 ℃低溫脅迫和38 ℃高溫脅迫下氣孔長度和氣孔寬度均減小，但差異不顯著（P＜0.05）。28 ℃處理下，氣孔的長度、寬度和開張度分別為27.98，26.51，8.34μm。38 ℃處理下，氣孔密度最大，為548.60 個(gè)/mm2，但大多數(shù)氣孔已經(jīng)閉合（圖2C）。錐栗葉片氣孔結(jié)構(gòu)在8 ℃和28 ℃下無明顯變化（圖2A，2B）。

2.3 溫度對錐栗幼苗葉片光合參數(shù)的影響

由表3可知，錐栗幼苗葉片光合參數(shù)在不同溫度下差異顯著（P＜0.05）。隨著溫度的增加，錐栗葉片的Pn、Gs、Tr均呈下降趨勢。在28 ℃條件下，Pn達(dá)到最大值為3.86μmol/（m2·s）。與28 ℃處理相比，8 ℃低溫脅迫下，Pn、Gs和Tr分別降低37.04%、22.22%和35.85%；38 ℃高溫脅迫下，Pn、Gs和Tr分別降低31.86%、18.51%和34.77%。與28 ℃處理相比，8 ℃和38 ℃條件下，Ci均呈上升趨勢，分別升高21.53%和16.14%。

圖1 不同溫度脅迫對錐栗葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effect of different temperature stress on chloroplast ultrastructure of Castanea henryi leaves

表2 不同溫度下錐栗葉片的氣孔結(jié)構(gòu)參數(shù)Tab.2 Stomatal structureof Castanea henryi leaves at different temperatures

圖2 不同溫度下錐栗葉片的氣孔結(jié)構(gòu)Fig.2 Effect of temperature on stomatal structure of Castanea henryi leaves

表3 不同溫度下錐栗光合參數(shù)Tab.3 Photosynthetic characteristics of Castanea henryiat different temperatures

2.4 溫度對錐栗幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

由表4 可知，與28 ℃處理相比，8 ℃和38 ℃處理下的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，除Fm以外，均有顯著差異（P＜0.05）。與28 ℃處理相比，8 ℃和38 ℃處理下錐栗葉片的Fo均呈上升趨勢，分別增加21.28%和15.60%；8 ℃低溫處理下，F(xiàn)v/Fm下降了4.88%，而38 ℃的高溫處理對Fv/Fm的影響并不明顯。ΦPSⅡ和qP在28 ℃的處理下出現(xiàn)最大值；與之相比，8 ℃低溫處理下，ΦPSⅡ下降了29.11%，qP下降29.41%；38 ℃高溫處理下，ΦPSⅡ下降了32.91%，qP下降35.29%。

表4 不同溫度下錐栗幼苗葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)Tab.4 Chlorophyll fluorescence parameters of Castanea henryi at different temperatures

3 結(jié)論與討論

葉綠體超微結(jié)構(gòu)的變化直接反映了葉片光合能力的大小[23]。武立權(quán)等[24]證明高溫脅迫會(huì)破壞水稻（Oryza sativaL.）黃葉突變體劍葉葉綠體超微結(jié)構(gòu)，減弱葉片的光合能力。黎明等[25]在研究中發(fā)現(xiàn)低溫環(huán)境將導(dǎo)致植物葉綠體形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。本研究表明，8 ℃低溫脅迫和38 ℃高溫脅迫均會(huì)影響葉綠體的結(jié)構(gòu)，從而影響錐栗幼苗葉片的光合作用，使得Pn降低。但并未出現(xiàn)如尤揚(yáng)等[26]研究發(fā)現(xiàn)的長時(shí)間低溫使葉綠體解體現(xiàn)象，導(dǎo)致這一研究結(jié)果有差異的原因可能是本文設(shè)置的8 ℃低溫處理一個(gè)月并不足以導(dǎo)致錐栗幼苗葉綠體解體，尚需進(jìn)行更低溫度和更低時(shí)間的設(shè)置研究來驗(yàn)證。

氣孔是植物體與外界之間的氣體交換通道[27]，有研究表明，增溫可以通過改變植物葉片的氣孔結(jié)構(gòu)特征影響CO2氣體經(jīng)氣孔擴(kuò)散到光合反應(yīng)位點(diǎn)的路徑和時(shí)間，從而影響光合作用[28]。本研究結(jié)果表明，在38 ℃下，氣孔密度最大，但大多數(shù)氣孔處于關(guān)閉狀態(tài)。植物在高溫環(huán)境下，通過增加氣孔密度，以加強(qiáng)蒸騰作用來降低植物體本身的溫度，是植物的一種自我保護(hù)機(jī)制。然而，隨著高溫脅迫時(shí)間的增加，致使保衛(wèi)細(xì)胞失水過多，從而導(dǎo)致大量氣孔關(guān)閉[29]。

光合作用是植物把無機(jī)物轉(zhuǎn)化為有機(jī)物的重要途徑，Pn反映植物光合作用的強(qiáng)弱[30]。本研究表明，8 ℃低溫或38 ℃高溫脅迫均會(huì)使植物光合作用減弱，與郝向春等[31]研究結(jié)果一致。植物光合作用的減弱原因可分為兩種，包括氣孔因素和非氣孔因素，因此檢查Pn下降的主要原因是不是氣孔限制，不僅需要看氣孔導(dǎo)度，還要確定胞間CO2濃度的變化趨勢[32]。本研究中在8 ℃低溫脅迫和38 ℃高溫脅迫時(shí)，Gs與Ci的變化趨勢不一致，說明Pn降低的主要原因是非氣孔因素，這與楊利云等[33]的研究結(jié)果類似。

對葉綠素?zé)晒鈪?shù)的分析有利于了解過高或過低的溫度環(huán)境對光合系統(tǒng)的影響程度[34]。本研究表明，與28 ℃處理相比，8 ℃和38 ℃處理下qP明顯下降，F(xiàn)o顯著升高，說明了低溫或高溫脅迫的環(huán)境下電子傳遞受阻，這與在大葉黃楊（Euonymus japonzcusThunb）[35]、烤煙（Nicotiana tabacumL.）[36]和紫菜（Por?phyraspp.）[37]上的研究結(jié)果相似。8 ℃低溫脅迫導(dǎo)致Fv/Fm和ΦPSⅡ的值均顯著下降，而38 ℃的高溫脅迫對Fv/Fm值影響較小，說明錐栗更耐38 ℃高溫脅迫，這與莫億偉等[38]對柱花草（Stylosanthes guianensis）的研究結(jié)果類似。

綜上所述，28 ℃處理下，錐栗幼苗葉片的葉綠體結(jié)構(gòu)完整和氣孔結(jié)構(gòu)正常，凈光合速率最大，而38 ℃高溫和8 ℃低溫脅迫均會(huì)在一定程度上改變?nèi)~綠體和氣孔結(jié)構(gòu)，影響錐栗幼苗葉片的光合作用，降低凈光合速率。