陳天子 余月 凌溪鐵 張保龍

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210014)

稻田雜草嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量和品質(zhì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，稻田雜草致使我國稻谷每年的損失率達(dá)15%左右[1]?；瘜W(xué)除草是目前廣泛普及的稻田除草方式，包括除草劑對土壤封閉處理和對莖葉處理[2]?；瘜W(xué)除草有嚴(yán)格的施用范圍，使用不當(dāng)會引發(fā)藥害，造成水稻減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)[3]。因此，培育抗除草劑的水稻品種是克服稻田雜草的經(jīng)濟(jì)有效途徑。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是培育抗除草劑作物的有效途徑之一，但目前我國尚未批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因水稻的商業(yè)化種植，不能在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。因此培育非轉(zhuǎn)基因的抗除草劑水稻在生產(chǎn)上意義重大。

乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)是支鏈氨基酸(纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸)生物合成的第一個(gè)關(guān)鍵酶，是磺酰脲類(sulfonylureas，SU)、咪唑啉酮類 ( imidazolinones，IMI )、三唑嘧啶類(triazolopyrimidines，TP)、 嘧啶氧(硫) 苯甲酸類[pyrimidinylthio (oroxy)-benzoates，PTB；pyrimidinylcarboxyherbicides，PCs]和磺酰胺基羰基三唑啉酮類(sulfonylamino-carbonyltriazolinones，SCT)等ALS 抑制劑類除草劑的作用靶標(biāo)，ALS 某些氨基酸位點(diǎn)的突變可賦予突變體對ALS 抑制劑類除草劑的耐受性[4]。如水稻ALS 的第95、第96、第171、第548、第627 和第628 位氨基酸突變?yōu)槟撤N氨基酸時(shí)，可對IMI、SU、PC等除草劑產(chǎn)生抗性[5-9]。美國路易斯安納州立大學(xué)農(nóng)業(yè)中心通過甲磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate，EMS)誘變水稻種子并結(jié)合常規(guī)育種手段，先后培育了CL121、CL131、CL141、CL161 等系列抗咪唑啉酮除草劑的非轉(zhuǎn)基因水稻，并聯(lián)合巴斯夫公司于2002年以Clearfield 品牌進(jìn)行商品化種植，成功解決了美國南部水稻種植區(qū)最難治的雜草紅稻(red rice)的危害，備受當(dāng)?shù)氐巨r(nóng)的歡迎；該水稻僅2005年種植面積就超過24 萬hm2，占美國水稻種植面積的17%[10]。其中，CL121 和CL141 抗咪唑啉酮水稻是利用其親本材料93AS3510 的ALS 第628 位氨基酸由甘氨酸突變?yōu)楣劝彼釒淼目剐裕珻L161 抗咪唑啉酮水稻則是利用其親本材料PWC16 的ALS 第627 位氨基酸由絲氨酸突變?yōu)樘於０范a(chǎn)生的抗性[6，8]。

2018年，巴斯夫公司聯(lián)合路易斯安那州立大學(xué)農(nóng)業(yè)中心將抗除草劑Provisia 水稻推廣上市[11]，該水稻屬于抗乙酰輔酶A 羧化酶抑制劑的非轉(zhuǎn)基因水稻。生產(chǎn)實(shí)踐中，β -三酮類除草劑雙環(huán)磺草酮(benzobicyclon，BBC)用于防除水稻田一年生和多年生雜草已有多年，其作用靶標(biāo)為4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD)；但BBC 對不同水稻品種的安全性有較大差異[12]。最近，日本科學(xué)家從抗BBC 的粳稻克隆了β-三酮類除草劑抗性基因HIS1 (HPPD inhibitor sensitive1)，該基因編碼一種Fe(Ⅱ)/2-氧戊二酸依賴性加氧酶，這種加氧酶通過催化β-三酮類除草劑發(fā)生羥基化反應(yīng)而使之失去毒性，從而賦予植物對多種β-三酮類除草劑的抗性；HIS1 基因缺失28 bp 堿基發(fā)生無意突變后，水稻對BBC 敏感，HIS1 基因的表達(dá)是造成水稻品種對BBC抗、感差異的原因[13]。目前，我國尚沒有抗除草劑水稻品種獲得許可登記，但通過篩選人工誘變?nèi)后w和自然突變?nèi)后w，也獲得了一些非轉(zhuǎn)基因抗除草劑水稻材料。王俊梅等[14]對84 份經(jīng)過輻照和EMS 誘變后的再雜交水稻材料進(jìn)行耐草甘膦的篩選，獲得5 份耐草甘膦水稻遺傳資源。金粳818 是天津市水稻研究所利用津稻9618 和津稻1007 雜交經(jīng)多年系譜法選育而成的常規(guī)品種，在水稻資源進(jìn)行除草劑篩選過程中發(fā)現(xiàn)其具咪唑啉酮除草劑抗性[15]，并具有與CL161 抗咪唑啉酮水稻同樣的突變位點(diǎn)，即其ALS的基因編碼區(qū)第1 880 nt 由G 突變?yōu)锳，導(dǎo)致第627 位的絲氨酸突變?yōu)樘於０穂16-17]，推測其抗性可能是在有殘留除草劑的大豆田中自然突變所產(chǎn)生[15-16]。廣東創(chuàng)新科研團(tuán)隊(duì)最近也通過化學(xué)誘變篩選方法研發(fā)出非轉(zhuǎn)基因抗除草劑水稻材料“潔田稻”[18]。盡管如此，國內(nèi)研究者創(chuàng)制非轉(zhuǎn)基因抗除草劑水稻的努力尚未能滿足市場的巨大需求。近年來，我國水稻輕簡化栽培發(fā)展較快，免耕和直播稻田雜草的危害日益突出[19-20]。水稻抗除草劑性狀已愈來愈受到水稻育種家和種業(yè)公司的重視。

因此，本研究通過EMS 誘變水稻種子，然后用咪唑啉酮類除草劑篩選誘變處理的后代種子，獲得了與前人報(bào)道的ALS突變類型相同的抗除草劑材料，也獲得了ALS突變的非轉(zhuǎn)基因抗咪唑啉酮類除草劑的水稻新材料，并對獲得的抗除草劑材料開展抗性水平鑒定，旨在為水稻抗除草劑育種提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水稻試驗(yàn)材料為秈稻93-11(由江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺提供)。EMS 為美國Sigmaaldrich 公司產(chǎn)品(貨號M0880)；硫代硫酸鈉產(chǎn)自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；百壟通為水劑型咪唑啉酮類除草劑，由巴斯夫公司生產(chǎn)(有效成分為240 mg·mL-1甲咪唑煙酸)，苗后定向噴霧防治一年生禾本科雜草的推薦用藥量為每畝20 ～30 mL，如按每畝兌水45 L計(jì)，甲咪唑煙酸的推薦使用濃度范圍為107 ～160 mg·L-1。

1.2 水稻EMS 誘變處理和抗除草劑突變體篩選

取水稻種子20 kg，自來水浸泡2 h 后，用0.5%(w/v) EMS 室溫下浸泡14 h，加入終濃度為25 g·L-1的硫代硫酸鈉中和反應(yīng)15 min，棄去EMS 溶液，自來水翻動浸泡種子5 次，每次5 min。然后將處理后的種子播種田間，M1植株成熟后，種子混收。取M2種子播種于溫室，播后10 d 后對M2幼苗噴施0.67 mL·L-1百壟通，即相當(dāng)于160 mg·L-1甲咪唑煙酸，20 d 后選擇正常綠色且明顯長高的抗性株移栽至花盆，收取M3種子。

1.3 抗除草劑突變體ALS 基因克隆與序列分析

根據(jù)NCBI 水稻ALS基因保守序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增ALS基因全長的特異引物OsALS-F 5′-TCGCCCAAACCCAG AAACCC-3′和OsALS-R 5′-CTCTTTATGGGTCATTCAG GTC-3′。以M3抗除草劑單株基因組DNA 為模板，采用TaKaRa PrimerSTAR Max DNA Polymerase 聚合酶擴(kuò)增ALS基因。PCR 反應(yīng)體系包括:2×PrimerSTAR Max Premix 10.0 μL、10 μmol·L-1引物各1.0 μL、30 ng·μL-1水稻基因組DNA 1.0 μL，補(bǔ)加無菌水至總體積20 μL。PCR 擴(kuò)增程序:98℃預(yù)變性3 min；98℃變性10 s，58℃退火15 s，72℃延伸2 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。取5 μL PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)有預(yù)期2 051 bp 片段后，剩余PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR 清潔試劑盒(美國Axygen 公司)清潔回收后，克隆至pMD19-T 載體(日本TaKaRa 公司)，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。每個(gè)轉(zhuǎn)化隨機(jī)挑取12 個(gè)大腸桿菌單克隆進(jìn)行PCR 檢測，取PCR 結(jié)果呈陽性的3 個(gè)單克隆，送南京一道生物科技有限公司測序。測序結(jié)果采用BioEdit 和SnapGene 軟件分析野生型和突變體ALS基因的DNA 序列差異，確定抗除草劑突變體的ALS突變位點(diǎn)。

1.4 抗除草劑突變體的抗性水平和遺傳穩(wěn)定性鑒定

取3 個(gè)抗性株系(編號M133、M135 和M142)M3種子和野生型(WT)水稻93-11 種子，播種紙杯中，每杯12～15 粒種子。在3～4 葉幼苗期時(shí)，以不同濃度甲咪唑煙酸(0、12、24、48、72、96、120、240、600、1 200、2 400、 4 800、 7 200、9 600、12 000 mg·L-1)水溶液進(jìn)行莖葉噴霧處理，每個(gè)濃度重復(fù)3 次；噴藥后21 d 測量株高，并以對照(0 mg·L-1甲咪唑煙酸處理)為基準(zhǔn)計(jì)算株高抑制率。株高抑制率=(對照組株高-處理組株高)/對照組株高×100%，然后按單向分組組內(nèi)觀察值數(shù)目不等資料對每個(gè)濃度下的株高抑制率進(jìn)行方差分析。

1.5 ALS 活性測定

取M142 抗性株系M3和野生型93-11 水稻葉片2～5 g，液氮研磨成粉末，按1 ∶1(w/v)加入提取液[100 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH 值7.5)，1 mmol·L-1丙酮酸鈉、5 mmol·L-1MgCl2、0.5 mmol·L-1焦磷酸硫胺素、1 mmol·L-1二硫代蘇糖醇]，待解凍后繼續(xù)研磨勻漿。用移液器將溶解物轉(zhuǎn)移置冰預(yù)冷離心管，12 000 r·min-1、 4℃離心30 min，吸取上清液至新的冰預(yù)冷離心管中，獲得粗酶液，并置于冰上，立即用于酶活測定。ALS 活性的測定參照陳以峰等[21]的方法。在2 mL 離心管中依次加入700 ～800 μL 反應(yīng)緩沖液[50 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH 值7.0)，200 mmol·L-1丙酮酸鈉、1 mmol·L-1MgCl2、1 mmol·L-1焦磷酸硫胺素]、1～100 μL 不同濃度的甲咪唑煙酸水溶液、100 μL 粗酶液；樣品管總體積為900 μL，混勻。對照管先加50 μL 3 mol·L-1H2SO4，再加入粗酶液。37℃水浴1 h，樣品管加50 μL 3 mol·L-1H2SO4，混勻，60℃孵育15 min，依次加入500 μL 0.83 g·L-1肌酸、500 μL 8.3 g·L-11-萘酚，混勻后60℃水浴15 min，37℃水浴15 min。短暫離心后取上清在ScanDrop 250 分光光度計(jì)(德國Analytik Jena 公司)上讀取400～640 nm 范圍的吸光值，取其最大值計(jì)算甲咪唑煙酸各濃度下的ALS相對酶活力及ALS 酶活抑制率。ALS 相對酶活力=甲咪唑煙酸加入組的ALS 吸光值/無甲咪唑煙酸加入組的ALS 吸光值×100%，ALS 酶活抑制率=(無甲咪唑煙酸加入組的ALS 吸光值-甲咪唑煙酸加入組的ALS 吸光值)/無甲咪唑煙酸加入組的ALS 吸光值×100%。按農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1155.8-2007[22]和趙斌等[23]方法，以SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算甲咪唑煙酸抑制水稻ALS酶活力至50%時(shí)的IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗除草劑突變體篩選

甲咪唑煙酸藥效慢，噴施百壟通4 d 后，水稻M2幼苗仍無藥害癥狀；噴施10 d 后，絕大部分M2幼苗葉片變淺綠色，有極少數(shù)幼苗葉片仍呈深綠色，且植株明顯增高；噴施15 d 后，非抗性苗葉片明顯失綠、停止生長甚至枯死，抗性苗正常生長，葉片深綠色，株高增長明顯(圖1)。篩選M2種子約50 kg，共計(jì)獲得61 個(gè)抗性M2單株，成熟后單株收種。

圖1 甲咪唑煙酸(160 mg·L-1)莖葉噴霧15 d 后的M2 抗性株Fig.1 The imidazolinone resistant plantlets in M2 population at 15 d of spray with 160 mg·L-1 imazapic

2.2 ALS 基因序列分析

已知植物對咪唑啉酮類除草劑的抗性是源于ALS基因的突變[4]。本研究利用引物組合OsALS-F/OsALS-R 擴(kuò)增了野生型和抗百壟通除草劑61 個(gè)M2株系的M3單株ALS基因序列，每株系各測試3 ～4 個(gè)M3單株，獲得的特異片段為2 051 bp，包括1 935 bp的ALS開放閱讀框。與野生型ALS的開放閱讀框序列相比，突變體ALS基因突變類型可分為三類(表1):1)20 個(gè)測序株系在第1 880 nt 由G 堿基突變?yōu)锳 堿基(G1880A)，導(dǎo)致編碼的第627 位氨基酸由絲氨酸(AGT)突變?yōu)樘於０?AAT)，為已報(bào)道的突變類型；2)23 個(gè)測序株系在第1 879、第1 880 nt 由AG 堿基突變?yōu)镃T 堿基(A1879C、G1880T)，導(dǎo)致編碼的第627 位氨基酸由絲氨酸(AGT)突變?yōu)榱涟彼?CTT)，為新發(fā)現(xiàn)的突變類型；3)1 個(gè)測序株系檢測出同時(shí)存在上述兩種突變，即A1879C、G1880T 和G1880A，表明該單株ALS基因還未純合。剩余17 個(gè)測序株系中，12個(gè)測序株系含有G1880A 突變外，還各檢測到1 個(gè)或2個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP) 或 插 入 缺 失(insertion-deletion，InDel) 突 變(C731A、 C531T、 G1763A、 C429T、 G896A、 C414T、G254A、A1409G、C651A、G1888A、C927T、G216A、1 296～1 297 nt 間插入T 堿基)；5 個(gè)測序株系含有A1879C、G1880T 突變外，還各檢測到1 個(gè)SNP 突變或InDel 突變(T1547C、G198A、C1474T、G1888A、1 330 nt處缺失G 堿基)。由此可推斷突變體抗除草劑功能的獲得是由于ALS 第627 位氨基酸由絲氨酸(AGT)突變?yōu)榱涟彼?CTT)或天冬酰胺(AAT)所致。

表1 61 個(gè)抗咪唑啉酮水稻株系在M3 的ALS 基因型分類Table 1 The genotyping of ALS genes in the M3 generation of sixty-one imidazolidone-resistant rice lines

2.3 抗性水平和遺傳穩(wěn)定性鑒定

取3 個(gè)抗性株系 M133 (堿基突變類型為G1880A)、M135(堿基突變類型為A1879C、G1880T)和M142(堿基突變類型為A1879C、G1880T/G1880A)后代進(jìn)行抗性鑒定。莖葉噴霧15 d 后，野生型水稻幼苗經(jīng)12 mg·L-1甲咪唑煙酸噴霧處理后產(chǎn)生明顯的生長抑制、葉片枯蔫等藥害癥狀，且藥害癥狀隨除草劑濃度的升高而加重，而抗性株在1 200 mg·L-1甲咪唑煙酸噴霧后才產(chǎn)生輕微葉片枯蔫癥狀(圖2-A)?？剐灾杲?jīng)12～96 mg·L-1甲咪唑煙酸噴霧21 d 后，反而促進(jìn)生長，當(dāng)噴霧濃度達(dá)120 mg·L-1時(shí)才出現(xiàn)生長抑制現(xiàn)象(圖2-B)。野生型水稻幼苗莖葉經(jīng)14 個(gè)甲咪唑煙酸濃度噴霧30 d 后，所有幼苗全部死亡；抗性株M133在1 200 mg·L-1甲咪唑煙酸噴霧后死亡；抗性株M135和M142 在1 200 mg·L-1甲咪唑煙酸噴霧后生長被抑制，濃度達(dá)2 400 mg·L-1時(shí)植株死亡(圖2-C)。這表明抗性水稻對甲咪唑煙酸的抗性能穩(wěn)定遺傳且其抗性水平不低于1 200 mg·L-1甲咪唑煙酸，其對甲咪唑煙酸的抗性是野生型的100 倍以上。此外，農(nóng)藝性狀測定結(jié)果表明，抗性株系M135、M142 的每穗粒數(shù)比野生型多出11.5%～13.4%，在株高、穗長、千粒重、抽穗期、結(jié)實(shí)率等農(nóng)藝性狀上與野生型無明顯差異(表2)，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

2.4 ALS 酶活測定

圖2 M3 抗咪唑啉酮除草劑水稻的抗性水平Fig.2 The resistance level of M3 imidazolinone-resistant rice

表2 抗咪唑啉酮除草劑水稻的農(nóng)藝性狀Table 2 The agronomic traits of the imidazolidone-resistant rice

ALS 是ALS 抑制劑除草劑的作用靶標(biāo)，其活性水平是鑒定植物對ALS 抑制劑抗性的重要生化指標(biāo)。在M142 抗性株葉片粗酶液與10 μmol·L-1甲咪唑煙酸孵育后，產(chǎn)生淡紅色產(chǎn)物，而野生型水稻葉片粗酶液產(chǎn)生黃色產(chǎn)物(圖3-A)，表明M142 在10 μmol·L-1甲咪唑煙酸下仍具有較高的ALS 酶活性。反應(yīng)產(chǎn)物在400～640 nm 下掃描測定吸收值，結(jié)果顯示水稻ALS的紅色復(fù)合物最大吸收峰在530 nm (圖3-B)。取水稻粗酶液與甲咪唑煙酸各濃度孵育后的530 nm 吸收值計(jì)算ALS 相對酶活力，結(jié)果顯示(圖3-C)，野生型水稻的ALS 對甲咪唑煙酸極為敏感，ALS 酶活在0.01 μmol·L-1開始受到抑制，并隨甲咪唑煙酸濃度的增加酶活性迅速降低，在甲咪唑煙酸濃度為10 μmol·L-1時(shí)ALS 相對酶活力為15.15%；而M142 抗性株的ALS 對甲咪唑煙酸的耐受性明顯強(qiáng)于野生型水稻，在甲咪唑煙酸濃度為10 μmol·L-1時(shí)開始受到抑制，在濃度為10 000 μmol·L-1時(shí)ALS 相對酶活力為14.42%。以SPSS 軟件對水稻ALS 酶活抑制率的幾率值和甲咪唑煙酸濃度的對數(shù)值進(jìn)行直線回歸分析，求得野生型水稻IC50=2.037 μmol·L-1，M142 抗性株IC50=222.099 μmol·L-1，即M142 抗性株對甲咪唑煙酸的耐受性是野生型水稻的109 倍。

3 討論

圖3 水稻ALS 酶活性測定Fig.3 The enzyme assay of rice ALS

目前絕大部分抗ALS 抑制劑作物的抗性機(jī)制是源于ALS基因堿基突變造成氨基酸殘基位點(diǎn)變異，引起ALS 抑制劑(除草劑)與ALS 蛋白結(jié)合性降低，從而使得突變表對該除草劑體現(xiàn)為不敏感或耐受性[4，24]，也有個(gè)別報(bào)道由細(xì)胞色素P450 單加氧酶基因CYP72A31、CYP81A6 等編碼代謝酶降解除草劑所致[25-28]。本研究在對抗除草劑突變體進(jìn)行抗性篩選和抗性表型進(jìn)行鑒定的基礎(chǔ)上，對部分抗除草劑突變體進(jìn)行了基因型鑒定，確認(rèn)這些突變體是在水稻ALS蛋白第627 位絲氨酸(AGT) 被突變?yōu)樘於０?AAT)或亮氨酸(CTT)。水稻ALS 第627 位絲氨酸對應(yīng)于擬南芥ALS 第653 位絲氨酸。該位點(diǎn)氨基酸發(fā)生突變后獲得抗ALS 抑制劑除草劑的功能在許多作物和雜草中都已被報(bào)道，包括水稻[6，8]、油菜[6，24]、玉米[6]、小麥[6]等，其除草劑抗性功能都是源于單堿基突變造成ALS 第653 位絲氨酸(以擬南芥ALS 氨基酸序列位置為標(biāo)準(zhǔn))突變?yōu)樘於０贰⑻K氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸[4]。如前所述，CL161 和金粳818 抗性水稻在該位點(diǎn)的氨基酸突變類型是絲氨酸突變?yōu)樘於０穂6，10，17]。本研究還發(fā)現(xiàn)水稻ALS 第627 位絲氨酸的2 個(gè)堿基AG 同時(shí)突變?yōu)镃T 后，造成絲氨酸變?yōu)榱涟彼?，突變體也具有抗咪唑啉酮類除草劑功能，該位點(diǎn)產(chǎn)生亮氨酸突變類型此前鮮見報(bào)道。ALS 抗性突變位點(diǎn)的不同、替換氨基酸殘基種類的不同，導(dǎo)致其蛋白結(jié)構(gòu)不同，其抗除草劑特點(diǎn)也不同[29]，如含627 天冬酰胺突變的CL161 對咪唑啉酮除草劑的抗性是CL121(含628 谷胺酸突變)的5 倍[30]。隨著對更多EMS 誘變水稻材料進(jìn)行抗ALS 抑制劑類除草劑篩選和基因型分析，還可能發(fā)現(xiàn)ALS 基因產(chǎn)生其他新的氨基酸突變類型能賦予抗除草劑功能。

抗草甘膦轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的大面積推廣表明轉(zhuǎn)基因是培育抗除草劑作物的有效途徑之一。但轉(zhuǎn)基因作物自面世以來，其環(huán)境安全和食品安全等問題一直備受公共部門、學(xué)術(shù)界和普通公眾的廣泛關(guān)注，引發(fā)的爭議也在一定程度上阻礙了轉(zhuǎn)基因作物的發(fā)展。如我國轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米和轉(zhuǎn)Bt 基因抗蟲水稻在2009年已獲得生產(chǎn)應(yīng)用安全證書，但至今尚未進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，其原因之一是基于國內(nèi)有關(guān)轉(zhuǎn)基因的輿論氛圍，以及我國對轉(zhuǎn)基因主糧作物產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程穩(wěn)重、謹(jǐn)慎的考慮[31]。所以，我國目前仍未批準(zhǔn)抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻的商業(yè)化。相比之下，傳統(tǒng)育種手段培育的作物品種由于沒有導(dǎo)入外源物種基因，更容易被接受和推廣，如抗咪唑啉酮油菜及油菜籽可以自由進(jìn)入歐盟及其他國家[32]，抗咪唑啉酮除草劑的非轉(zhuǎn)基因Clearfield 水稻在美國也產(chǎn)生了良好的經(jīng)濟(jì)效益[10]。EMS 屬于常用的一種化學(xué)誘變劑，可產(chǎn)生豐富的基因組突變及表型突變類型，廣泛用于植物誘變育種[33-34]。本研究通過EMS 誘變水稻93-11 種子篩選到的抗咪唑啉酮除草劑水稻能耐受不低于1 200 mg·L-1甲咪唑煙酸，而野生型水稻在甲咪唑煙酸濃度為12 mg·L-1時(shí)就已死亡，表明所獲得抗性水稻對甲咪唑煙酸的抗性水平是野生型的100 倍以上。ALS 酶活測定結(jié)果也揭示抗性水稻對甲咪唑煙酸的耐受性是野生型的109 倍。該抗除草劑性狀對咪唑啉酮抗性倍數(shù)高，且能穩(wěn)定遺傳，具備生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。利用同樣的手段，在華占、1892S 不育系、嘉花1 號、淮稻5 號、臨稻16 號、鎮(zhèn)稻18 號、鎮(zhèn)糯19 號、圣稻19 號、蘇秀867 等多個(gè)水稻品種上都成功獲得抗咪唑啉酮除草劑的突變材料。它們對咪唑啉酮除草劑的抗性源于水稻基因組堿基突變產(chǎn)生，無轉(zhuǎn)基因環(huán)境釋放的安全性問題，在控制免耕和直播稻田雜草方面具有廣闊的推廣應(yīng)用前景。此外，本研究發(fā)現(xiàn)低濃度百壟通莖葉噴霧處理對抗性水稻的生長有促進(jìn)作用的現(xiàn)象。該現(xiàn)象是由除草劑產(chǎn)品本身還是由抗性突變體自身基因型引發(fā)產(chǎn)生還有待進(jìn)一步驗(yàn)證和確認(rèn)。

4 結(jié)論

本研究通過EMS 誘變獲得的抗咪唑啉酮水稻突變體材料可耐受不低于1 200 mg·L-1甲咪唑煙酸，其抗性水平是野生型的100 倍以上，抗性倍數(shù)高，且能穩(wěn)定遺傳，具有生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。其抗除草劑功能源于ALS基因開放閱讀框在第1 879、第1 880 nt 由AG 堿基突變?yōu)镃T 堿基，或在第1 880 nt 由G 堿基突變?yōu)锳堿基，導(dǎo)致編碼的第627 位氨基酸由絲氨酸(AGT)突變?yōu)榱涟彼?CTT)或天冬酰胺(AAT)；其中第627 位氨基酸由絲氨酸(AGT)突變?yōu)榱涟彼?CTT)鮮有報(bào)道。突變后的水稻ALS 對咪唑啉酮類除草劑的耐受性顯著提高，其IC50是野生型水稻的100 倍以上。在當(dāng)前我國嚴(yán)格監(jiān)管轉(zhuǎn)基因水稻的背景下，該非轉(zhuǎn)基因的抗除草劑水稻具有廣闊的應(yīng)用前景。