王凱玥 張沙沙 張國裕 田佳星 張 帆 李海真 王建書 耿麗華

(1北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點(diǎn)實驗室，北京 100097；2河北工程大學(xué)園林與生態(tài)工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038)

西葫蘆(Cucurbita pepoL.)是我國普遍栽培的瓜類蔬菜，其栽培面積及產(chǎn)量均居世界第一[1]。西葫蘆產(chǎn)量高，易于管理，可為種植農(nóng)戶帶來較好的經(jīng)濟(jì)效益。但西葫蘆生產(chǎn)長期受病毒病的危害，其中番木瓜環(huán)斑病毒西瓜株系(papaya ringspot virus-watermelonstrain，PRSV-W) 常單獨(dú)侵染，或與黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus，CMV)、小西葫蘆黃化花葉病毒(zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)、西瓜花葉病毒(watermelon mosaic virus，WMV)等復(fù)合侵染西葫蘆等葫蘆科作物，田間發(fā)病普遍[2-4]。西葫蘆植株感染PRSV-W 后會出現(xiàn)花葉、泡斑、蕨葉、植株矮化、果實畸形等癥狀，可造成30%～60%的產(chǎn)量損失，甚至絕產(chǎn)，嚴(yán)重影響西葫蘆產(chǎn)量與果實的商品性[5-7]。PRSV-W病通過農(nóng)事操作中的機(jī)械摩擦或蚜蟲刺吸等途徑快速傳播，迄今尚無高效的防治藥劑，栽培抗病品種是減少危害最經(jīng)濟(jì)有效的措施[6，8]。

目前，PRSV-W 抗病種質(zhì)的評價鑒定、抗性性狀遺傳分析及抗病基因連鎖分子標(biāo)記的研究多集中于黃瓜[9-11]、西瓜[12-13]及甜瓜[14-15]等葫蘆科作物上。有關(guān)中國南瓜PRSV-W 抗性的研究也相對較多[16-18]，但有關(guān)西葫蘆PRSV-W 抗性鑒定方法、抗病種質(zhì)的篩查及抗性性狀遺傳分析的研究鮮有報道[19-21]。特別是國內(nèi)對現(xiàn)存西葫蘆品種及種質(zhì)資源的PRSV-W 抗性及抗病性狀遺傳特性研究不足，極大限制了西葫蘆抗病種質(zhì)資源的挖掘利用及抗病育種研究。因此，本研究在前期初步探索的基礎(chǔ)上[22]，進(jìn)一步完善西葫蘆PRSV-W 苗期接種鑒定方法，對收集的148 份西葫蘆品種及高代自交系進(jìn)行抗性評價篩查，并通過對六世代群體的抗性研究揭示PRSV-W 抗病性狀的遺傳規(guī)律，旨在為抗病育種提供抗病種質(zhì)及技術(shù)支持，為進(jìn)一步分離鑒定抗病基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試西葫蘆品種及育種材料(86 份主栽品種，62 份高代自交系)均由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心南瓜課題組收集保存，具體見表1。用于抗病性狀遺傳規(guī)律分析的六世代群體包括母本P1(BV21)、父本P2(BV37)和F1(BV21×BV37)各30 株，F(xiàn)2群體192 株，BC1P1(F1×BV21) 150 株，BC1P2(F1×BV37) 150 株。

表1 本試驗用148 份西葫蘆品種Table 1 148 squash varieties in this study

1.2 PRSV-W 苗期接種方法

供試種子先經(jīng)40℃干燥處理2 h，再65℃高溫處理2 h，浸種4 h 后于30℃LRH250 恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)催芽(濕度70%)24 h，然后播種于滅菌營養(yǎng)缽中，置于防蟲網(wǎng)室內(nèi)培養(yǎng)(25 ～30℃)。待子葉展平，撒少量600 目金剛砂于子葉上，用質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的病毒接種液(0.02 mol·L-1磷酸緩沖液研磨攜帶PRSV-W 病毒的葉片組織)摩擦接種。接種15～25 d 后，觀察植株第1 ～第4片真葉的發(fā)病情況，記錄并進(jìn)行抗病分級，然后取葉片保存于-70℃，備用。148 份不同品種西葫蘆及高代自交系，每份種植7 株，設(shè)3 次重復(fù)，其中2 株作為空白對照；六世代群體進(jìn)行單株接種鑒定，選擇母本BV21、父本BV37 及F1各5 株作為空白對照。

西葫蘆對PRSV-W 病的抗性劃分為0 ～4 級(圖1)。其中，0 級:植株無任何癥狀；1 級:少數(shù)葉片局部輕微花葉，形態(tài)正常；2 級:多數(shù)葉片花葉，形態(tài)正常，個別葉片畸形；3 級:多數(shù)葉片嚴(yán)重花葉、泡斑，新葉畸形；4 級:幾乎所有葉片嚴(yán)重花葉、畸形。按照公式計算植株病情指數(shù)(disease index，DI):

DI=100×Σ(各級病株數(shù)×各級代表值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級代表值)。

DI ≤5 為高度抗病(high resistant，HR)；5 ＜DI≤25 為抗病(resistant，R)；25 ＜DI ≤70 為感病(susceptible，S)，DI＞70 為高度感病(high susceptible，HS)。

1.3 DAS-ELISA 及RT-PCR 檢測

使用DAS-ELISA 試劑盒(美國Agdia 公司)進(jìn)行葉片 PRSV-W 病毒酶聯(lián)免疫 ( enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測，具體方法參照試劑盒使用說明。反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)分析參照劉勇等[4]的方法。引物:PRSVdF:GACCTACAAGCGTGACTTTAC；PRSVdR:CACCCATG CCATGCATCTTTC。RNA 提取方法參照EasyPure?Plant RNA Kit 試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)說明書進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)分析及卡方檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 西葫蘆PRSV-W 抗病種質(zhì)篩查鑒定

PRSV-W 病毒病接種鑒定結(jié)果顯示，在收集的148份西葫蘆材料中，22 份表現(xiàn)為高度抗病(HR)，11 份表現(xiàn)為抗病(R)，抗病總占比為22.3%；12 份表現(xiàn)為感病(S)，103 份表現(xiàn)為高度感病(HS)，感病總占比為77.7%(表2、圖1)。ELISA 與RT-PCR 的檢測結(jié)果輔助驗證了表型鑒定結(jié)果，但均存在漏檢出材料，其中，ELISA 漏檢出感病材料5 份，RT-PCR 漏檢出3 份。此外，萬盛嬌子與BV23 這2 份種質(zhì)材料雖然表現(xiàn)抗病，但RT-PCR 也檢測出葉片中存在病毒粒子(表2)。上述結(jié)果表明，RT-PCR 檢測結(jié)果較ELISA 更為靈敏、可靠。

表2(續(xù))

表3 西葫蘆各世代群體植株P(guān)RSV-W 抗性表現(xiàn)Table 3 PRSV-W resistance performance of plants in different generation of Zucchini

2.2 西葫蘆PRSV-W 抗病性狀遺傳分析

抗病種質(zhì)材料中，高代自交系BV21 表現(xiàn)為非常高的抗性，接種PRSV-W 病毒后未見明顯病癥，由圖3可知，與對照未接種植株無明顯差異；感病自交系BV37 則表現(xiàn)為嚴(yán)重感病，新生葉片出現(xiàn)花葉泡斑、嚴(yán)重畸形(圖3)。以2 份材料配制六世代群體(P1、P2、F1、F2、BC1P1和BC1P2)，進(jìn)行PRSV-W 抗性遺傳分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)2群體中137 株抗病，55 株感病，符合顯性單基因控制性狀的分離比例3 ∶1(χ2=1.36，P=0.24)；回交群體中，與抗性親本BV21 回交，其后代均表現(xiàn)為抗病，與感病親本BV37 回交，其后代的抗、感單株分離比符合1 ∶1(χ2=1.71，P=0.19)(表3)。綜上表明，BV21 的PRSV-W 抗性受1 對顯性抗病基因控制。

圖1 西葫蘆PRSV-W 病苗期鑒定抗性分級Fig.1 Identification and resistance classification of PRSV-W disease in Summer squash

3 討論

3.1 西葫蘆PRSV-W 抗病種質(zhì)的評價鑒定

準(zhǔn)確、高效簡便的PRSV-W 抗性鑒定方法及抗病種質(zhì)資源的篩查是西葫蘆抗病育種的重要組成部分。Barbosa 等[6]利用性狀觀察結(jié)合ELISA 檢測，篩查獲得8 份中等抗性的南瓜種質(zhì)材料；Nogueira 等[19]利用兩次病毒子葉摩擦接種法對16 份西葫蘆雜交種及8份自交系進(jìn)行了PRSV-W 抗性接種鑒定，獲得了1 份抗病雜交種材料。本研究經(jīng)過對收集的西葫蘆種質(zhì)資源進(jìn)行廣泛的PRSV-W 接種試驗，建立了簡便高效的苗期抗性鑒定技術(shù)，并利用ELISA 及RT-PCR 技術(shù)驗證了抗性性狀分級的科學(xué)性，同時對國內(nèi)主要西葫蘆栽培品種進(jìn)行了統(tǒng)一的抗性篩查評價，獲得22 份高抗

圖2 部分西葫蘆育種材料PRSV-W 病毒病的RT-PCR 分析Fig.2 RT-PCR analysis of PRSV-W virus disease of part of Zucchini breeding material

圖3 西葫蘆PRSV-W 病毒病抗、感親本材料Fig.3 Symptom expressions on the resistant and susceptible parent lines of squash to PRSV-W infection

種質(zhì)資源，這對我國西葫蘆生產(chǎn)中的品種選擇及PRSV-W 抗病育種具有較高的利用價值。

3.2 西葫蘆PRSV-W 病毒病的抗性遺傳規(guī)律

不同葫蘆科作物對PRSV-W 抗性的遺傳規(guī)律不同，甚至同一作物不同種質(zhì)材料間的抗性控制基因也存在差異。黃瓜對PRSV-W 的抗性既存在顯性控制基因也有隱性控制基因[9-11，23-24]；西瓜則受1 個隱性[13]或2 個具有加性且不完全顯性效應(yīng)的抗病基因控制[12，25-26]；甜瓜及葫蘆則表現(xiàn)為單顯性抗病基因[14，26-27]。Brown 等[16]研究認(rèn)為中國南瓜野生近緣種Nigerian Local 攜帶1 個隱性抗病基因prv，是中國南瓜及西葫蘆栽培種中PRSV-W 抗性基因的來源，不過McPhail-Medina 等[17]和Seda-Martinez[18]則認(rèn)為該材料的抗性至少受1 個顯性抗性基因及1 個顯性上位抑制基因控制。de Oliveira 等[5]研究表明，中國南瓜的PRSV-W 抗性受1 個不完全顯性抗病基因控制。南瓜(C.ecuadorensis)中PRSV 抗性受單顯性基因控制[28]，而印度南瓜的PRSV-W 抗性可能受2 ～3 個基因控制[29]。西葫蘆Whitaker 中的PRSV-W 抗性可能受1個主效基因及多個微效基因的調(diào)控[20]。本研究認(rèn)為西葫蘆BV21 的抗性受單顯性抗病基因控制，以上研究結(jié)果之間的差異可能取決于抗性材料的選擇，以及抗、感群體劃分標(biāo)準(zhǔn)的不同。

4 結(jié)論

本研究建立并完善了西葫蘆PRSV-W 病的苗期人工接種鑒定方法，并對高代自交系育種材料及國內(nèi)目前主栽西葫蘆品種進(jìn)行了系統(tǒng)的抗性評價篩查，獲得了22 份高抗PRSV-W 種質(zhì)材料，同時揭示了西葫蘆自交系BV21 的PRSV-W 抗性受單顯性基因控制。本研究為西葫蘆PRSV-W 抗病育種提供了種質(zhì)材料及技術(shù)支持，也對生產(chǎn)中抗病品種的選擇及進(jìn)一步分離鑒定抗病基因具有重要意義。