靳 叢 郭巧會(huì) 陳國(guó)棟 孫小川 孫 敏 周 瑾 王紀(jì)忠 黃小三

(1淮陰工學(xué)院，江蘇 淮安 223003； 2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095)

多胺(polyamines，PAs)是一類具有強(qiáng)生物活性的小分子量脂肪族含氮堿，廣泛存在于生物體中。高等植物中常見的多胺有腐胺(putrescine，Put)、亞精胺(spermidine，Spd)和精胺(spermine，Spm)，它們?cè)谥参锷L(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用[1]。而植物體內(nèi)PAs 含量變化與其合成途徑中關(guān)鍵酶所編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平變化密切相關(guān)[2-3]。精氨酸脫羧酶(arginine decarboxylase，ADC)是植物在脅迫條件下形成多胺的第一個(gè)限速酶，可催化精氨酸生成Put，且此途徑是高等真核生物中植物所特有的，因此ADC 所編碼基因的結(jié)構(gòu)和功能受到廣泛關(guān)注[4-5]。據(jù)報(bào)道，ADC基因?qū)儆诹姿徇炼呷┮蕾囆悦?pyridoxal 5’-phosphate decarboxylase，PLPDE)基因家族成員，具有家族典型的N 端Org＿Arg＿deC＿N 結(jié)構(gòu)域和底物識(shí)別信號(hào)，且保守的磷酸吡哆醛(pyridoxal 5’-phosphate，PLP)結(jié)合位點(diǎn)可催化精氨酸脫羧，從而參與PAs 生物合成途徑[6]。

目前，已有多種植物ADC基因被克隆與表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)該基因在多個(gè)組織中表達(dá)，并響應(yīng)不同非生物脅迫。據(jù)報(bào)道，水稻(Oryza sativa)OsADC1 和OsADC2在根、莖、葉和花序中均有表達(dá)，且受鹽、干旱和低溫脅迫誘導(dǎo)[7]；桃樹(Prunus perica)PpADC主要在莖、葉、花和果實(shí)中表達(dá)，并響應(yīng)脫水、鹽、低溫和重金屬脅迫[8]。從顛茄(Atropa belladonna)中分離的AbADC1和AbADC2 分別在須根和主根中表達(dá)量較高，呈現(xiàn)出較明顯的組織表達(dá)特異性，且AbADC2 響應(yīng)低溫脅迫[9]；金柑(Fortunella crassifolia)中的FcADC在轉(zhuǎn)錄因子FcWRKY70 的調(diào)控下通過調(diào)節(jié)Put 含量的升高，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草和檸檬的抗旱性[10]；枳(Poncirus trifoliata)PtADC基因通過清除活性氧和促進(jìn)根系生長(zhǎng)響應(yīng)干旱脅迫[11]；在蓮藕(Lotus tenuis) 中過表達(dá)OatADC提高了鹽脅迫下ADC基因的轉(zhuǎn)錄水平，并通過促進(jìn)脯氨酸的合成及平衡Na＋/K＋增強(qiáng)了耐鹽性[12]。這些研究結(jié)果表明，ADC基因在植物抵御非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。

杜梨(Pyrus betulifolia)廣泛分布于我國(guó)北方地區(qū)，具有較強(qiáng)耐低溫、高溫、干旱和鹽堿的能力，且與栽培品種嫁接親和力強(qiáng)，成為應(yīng)用最廣的梨砧木，是進(jìn)行梨抗逆育種和基因克隆的理想材料[13-15]。本試驗(yàn)以杜梨為研究材料，通過反轉(zhuǎn)錄 PCR ( reverse transcription PCR，RT-PCR)技術(shù)克隆杜梨PbADC基因全長(zhǎng)，利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸的序列分析，結(jié)合熒光定量PCR 等方法研究PbADC基因的組織表達(dá)和對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)模式，旨在為深入探討PbADC基因功能和抗逆機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取長(zhǎng)勢(shì)健康、一致的60 d 杜梨幼苗，分別對(duì)其進(jìn)行低溫、脫水、鹽和過氧化氫的非生物脅迫處理，每個(gè)處理至少60 株幼苗，葉片隨機(jī)取樣。

1.2 脅迫處理試驗(yàn)

低溫處理，將幼苗置于4℃的人工氣候室，并在0、6、12、24 和48 h 進(jìn)行采樣。脫水處理，將幼苗從土中不傷根取出，并在清洗干凈根部后，放入裝有蒸餾水的燒杯中，置于溫度25℃，光周期16 h 光照/8 h 黑暗交替的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，將預(yù)培養(yǎng)的幼苗放在濾紙上進(jìn)行脫水處理，分別在0、0.5、1、3 和6 h 進(jìn)行采樣。鹽和過氧化氫處理，分別將上述預(yù)培養(yǎng)的幼苗置入200 mmol·L-1氯化鈉(NaCl)溶液和2% H2O2溶液中，采樣時(shí)間點(diǎn)為處理后0、6、12、24 和48 h。每個(gè)處理所采樣品迅速進(jìn)行液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PbADC 基因及啟動(dòng)子克隆

從梨基因組數(shù)據(jù)庫(http:/ /peargenome.njau.edu.cn/)獲得精氨酸脫羧酶基因ADC的基因序列，命名為PbADC，并選擇PbADC基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp 左右啟動(dòng)子片段，利用Primer 5.0 設(shè)計(jì)基因克隆引物PbADC-F(A T G C C G G C C C T G G C T T G T TG)和PbADC-R(AGCACAGCAATAAGACCACTGT)及啟動(dòng)子克隆引物PbADC-Pro-F(TCACATAACGTAAAG TGATAAATGG)和PbADC-Pro-R(AAGGGATTAGG GTTGGGC)。分別以杜梨葉片cDNA 和DNA 為模板擴(kuò)增基因和啟動(dòng)子全長(zhǎng)，PCR 反應(yīng)程序均為:98℃預(yù)變性30 s；98℃變性10 s，66℃退火30 s，72℃延伸2 min，35 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后分別產(chǎn)生單一條帶的特異PCR 產(chǎn)物，膠回收后將回收產(chǎn)物與pMD 18-T(大連TaKaRa 生物工程公司)進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(南京擎科生物科技有限公司)，在含有100 mg·L-1的LB/Amp 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，挑選陽性克隆測(cè)序。

1.4 序列分析

利用軟件ProtParam 分析PbADC 蛋白的相對(duì)分子量和等電點(diǎn)，用軟件Softberry 分析亞細(xì)胞定位[16]；利用軟件Plantcare 分析啟動(dòng)子順式作用元件，軟件Signal P 預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽[17]；分別應(yīng)用軟件SOPMA和SWISS-MODEL 預(yù)測(cè)PbADC 蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)[18]；利用軟件NetPhos 3.1 Server 和DictyOGlyc 1.1 Server 分析蛋白質(zhì)修飾方式[19]；利用NCBI 數(shù)據(jù)庫中的BLAST 檢索PbADC 蛋白的同源序列，并使用軟件MEGA 6.0 的最大似然法(maximum likelihood，ML)進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建；利用軟件MEGA 6.0 和Genedoc 進(jìn)行多序列比對(duì)分析；利用軟件Pfam 進(jìn)行蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析[20]。

1.5 PbADC 基因表達(dá)特性分析

基于完成測(cè)序的PbADC基因序列，設(shè)計(jì)特異性表達(dá)引物PbADC-QF(GTATGCCTCCGCAGTTGTC)和PbADC-QR(GGTTCAGGTAATCGGCACG)進(jìn)行基因組織表達(dá)及在多種非生物脅迫下的表達(dá)模式分析，內(nèi)參基因引物為PbTublin-F(TGGGCTTTGCTCCTCTT AC)和PbTublin-R(CCTTCGTGCTCATCTTACC)[21]。利用LightCycler 480 熒光定量PCR 儀(Roche，美國(guó))進(jìn)行PbADC基因表達(dá)特性分析，反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性5 min；94℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，45 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸3 min。每個(gè)樣品的檢測(cè)平行重復(fù)3 次，采用2-ΔΔCt法[22]進(jìn)行定量數(shù)據(jù)計(jì)算。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)利用Microsoft Office Excel 2016 和SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并采用Duncan 法進(jìn)行差異顯著性分析(P＜0.05)；應(yīng)用Origin 9.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PbADC 基因的克隆與序列分析

以杜梨葉片cDNA 為模板，利用特異性克隆引物擴(kuò)增出目的片段，測(cè)序結(jié)果證明該片段與目的基因保持一致。PbADC開放性閱讀框(open reading frame，ORF)全長(zhǎng)為2 190 bp，編碼730 個(gè)氨基酸(圖1)。

圖1 杜梨PbADC 基因核苷酸序列及其編碼的氨酸酸序列Fig.1 cDNA and predicted protein sequence of PbADC gene form Pyrus betulifolia

PbADC啟動(dòng)子順式作用元件的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，除具備啟動(dòng)子核心啟動(dòng)元件TATA-box 和CAAT-motif外，還存在多種非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)順式作用元件，主要有厭氧響應(yīng)元件(cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction，ARE)，鹽響應(yīng)元件(MYB binding site in drought-inducibility，MBS)，低溫響應(yīng)元件(cir-acting element involved in low-tempreture responsiveness，LTR)，干旱響應(yīng)元件(inducer，injury and pathogen responses combined with WRKY trascription factors，W-box) 和 脅 迫 響 應(yīng) 元 件(stress response element，STRE)等[23]，暗示PbADC可能在植物防御非生物脅迫過程中發(fā)揮一定作用。

2.2 PbADC 蛋白序列與生物活性分析

預(yù)測(cè)PbADC 蛋白質(zhì)分子量約為78.53 kDa，理論等電點(diǎn)為5.23，不穩(wěn)定指數(shù)為42.64，親水性系數(shù)為-0.044，表明其是不穩(wěn)定親水性蛋白；信號(hào)肽分析結(jié)果表明，PbADC 不存在信號(hào)肽序列，屬于非分泌型蛋白；亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，PbADC 主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，PbADC 蛋白含有44.38%的α-螺旋，14.79%的延伸鏈，6.44%的β-轉(zhuǎn)角和34.38%的無規(guī)卷曲。利用SWISS-MODEL 軟件中的ADC 蛋白模板(PDB ID:3nzq.1.A)對(duì)PbADC 進(jìn)行蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析(圖2)，所構(gòu)建模型與模板的序列覆蓋率達(dá)84%，氨基酸序列覆蓋范圍為53～684 位。

磷酸化和糖基化是常見的蛋白修飾方式，可能會(huì)影響蛋白的結(jié)構(gòu)與功能。PbADC 蛋白磷酸化分析結(jié)果顯示，該蛋白有66 個(gè)磷酸化位點(diǎn)超過可能性臨界值，其中絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點(diǎn)數(shù)量分別為44、12 和10 個(gè)，并在氨基酸序列范圍350 ～430 和610～720 部分出現(xiàn)較為密集的磷酸化位點(diǎn)分布(圖3)。糖基化預(yù)測(cè)分析PbADC 蛋白不存在糖基化位點(diǎn)。

2.3 PbADC 的氨酸酸序列同源性和進(jìn)化樹分析

圖2 PbADC 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 The predicted three-dimensional structure of PbADC protein

圖3 PbADC 蛋白氨酸酸序列翻譯后磷酸化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of phosphorylation site in amino acid sequence of PbADC protein

將PbADC與擬南芥(Arabidopsis thaliana，AAB09723)AtADC、枳(Poncirus trifoliata，AEE99192)PtADC、石榴(Punica granatum，XP ＿ 031390051)PgADC、棗(Ziziphus jujuba，XP＿015892431)ZjADC、甜櫻桃(Prunus avium，XP＿021806331) PaADC、桃(Prunus persica，BAG68575) PpADC 和蘋果(Malus domestica，BAD74163)MdADC 進(jìn)行序列同源性分析，結(jié)果顯示氨基酸序列相似性分別為68.70%、72.46%、77.15%、77.93%、89.73%、90.14%和92.47%，表明PbADC 的氨基酸序列與這7 個(gè)物種具有較高同源性，包含完整的Orn＿Arg＿deC＿N(PF02784)結(jié)構(gòu)域，并在第329～第345 殘基發(fā)現(xiàn)精氨酸脫羧酶基因家族典型的底物識(shí)別信號(hào)結(jié)構(gòu)域，同時(shí)擁有保守的氨基端的賴氨酸(K)和羧基端的半胱氨酸(C)這兩個(gè)重要的酶活位點(diǎn)，且賴氨酸(K)殘基可能是PLP 的磷酸基結(jié)合位點(diǎn)(圖4)。

系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，杜梨PbADC 與同為薔薇科的蘋果MdADC、甜櫻桃PaADC 和桃PpADC 聚為一類，親緣關(guān)系最近；與棗ZjADC、川桑MnADC 和楊梅MrADC 的親緣關(guān)系較近；與番木瓜CpADC、山茶CsADC 和擬南芥AtADC 等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖5)。

2.4 PbADC 基因的組織表達(dá)和非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析

利用熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)PbADC基因在杜梨根、莖和葉中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)(圖6)，結(jié)果表明，該基因在莖、根和葉中均有表達(dá)，其中在葉中表達(dá)量最高，根次之，莖中最低，呈現(xiàn)顯著的組織表達(dá)特異性。

由圖7 可知，PbADC基因的轉(zhuǎn)錄水平受低溫(4℃)、脫水、鹽脅迫(200 mmol·L-1NaCl)和過氧化氫(2% H2O2)誘導(dǎo)。低溫處理過程中，PbADC的相對(duì)表達(dá)量持續(xù)升高，處理48 h 時(shí)相對(duì)表達(dá)量增加至CK 的12 倍；在脫水處理1 h 內(nèi)，PbADC的相對(duì)表達(dá)水平持續(xù)升高，之后相對(duì)表達(dá)水平開始下降；鹽脅迫與H2O2處理的基因表達(dá)結(jié)果相似，都是在處理后12 h 時(shí)，PbADC的相對(duì)表達(dá)量最高，之后逐漸下降，但處理48 h 時(shí)的相對(duì)表達(dá)量仍高于CK。

3 討論

PAs 作為一種新型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或“第二信使”，參與植物衰老、成花、胚胎形成、果實(shí)成熟與逆境響應(yīng)等生理代謝活動(dòng)[24]。ADC 是PAs 生物合成途徑中的關(guān)鍵限速酶，通常在脅迫條件下調(diào)節(jié)PAs 的含量變化。盡管已有多個(gè)ADC基因被分離，但不同物種中ADC基因的組織表達(dá)模式和非生物脅迫下的響應(yīng)水平存在差異，鑒定不同植物的ADC基因?qū)檠芯吭摶蚬δ芎蛻?yīng)用奠定基礎(chǔ)。

本研究克隆了杜梨PbADC基因，ORF 全長(zhǎng)2 190 bp，編碼730 個(gè)氨基酸，含有66 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，高于茶樹CsADC 蛋白中的磷酸化位點(diǎn)數(shù)目，表明PbADC 可能在磷酸化蛋白調(diào)控過程中發(fā)揮更豐富的作用[25]。在PbADC啟動(dòng)子序列中預(yù)測(cè)到的LTR 和STRE 等多種脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件也存在于響應(yīng)低溫脅迫的AtADC1 啟動(dòng)子中[26]，表明PbADC可能參與低溫響應(yīng)；金柑轉(zhuǎn)錄因子FcWRKY70 通過特異性結(jié)合FcADC啟動(dòng)子上的順式作用元件W-box，提高了ADC基因在脫水脅迫下的表達(dá)水平[10]；順式作用元件主要參與基因的表達(dá)調(diào)控，PbADC啟動(dòng)子中含有上述順式作用元件，表明其與這些同源基因可能響應(yīng)相似的非生物脅迫。

本研究中，蛋白序列分析顯示PbADC 含有家族保守的2-磷酸吡哆醛結(jié)合位點(diǎn)、PLP 磷酸基結(jié)合位點(diǎn)和底物識(shí)別信號(hào)，與進(jìn)行比對(duì)的多個(gè)ADC 同源蛋白一致，這些是鑒定磷酸吡哆醛依賴性酶(pyridoxal 5′-phosphate decarboxylase，PLPDE)家族Ⅲ型PLPDE 亞家族成員的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，也是ADC基因行使功能的主要基序[27]。杜梨為薔薇科植物，本研究中系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，PbADC 與薔薇科的蘋果MdADC、甜櫻桃PaADC 和桃PpADC 處于同一進(jìn)化分支上，與棗ZjADC、川桑MnADC 和楊梅MrADC 等果樹的親緣關(guān)系也較近，表明ADC基因在進(jìn)化過程中保守性較高。

圖5 PbADC 與部分物種ADC 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of PbADC and ADC proteins from other species

圖6 不同組織中PbADC 基因的表達(dá)水平Fig.6 Expression levels of PbADC gene in different tissues

ADC基因分布于植物的多個(gè)組織中，不同植物的同源基因呈現(xiàn)明顯的組織表達(dá)特異性。本研究中的杜梨PbADC基因在葉、根和莖中都有表達(dá)，其中，在葉中的相對(duì)表達(dá)量最高，莖中的相對(duì)表達(dá)量最低。同樣在棉花中，GhADC1 基因在葉、莖和根部等組織中都有表達(dá)，而葉中基因的相對(duì)表達(dá)量最高[27]；芒果MiADC基因也被檢測(cè)到在根、莖、葉和花等組織中有表達(dá)，但在莖中的表達(dá)量高于葉中的表達(dá)量[28]；而橡膠樹HbADC1 基因在葉、雌花、雄花和樹皮等組織中都進(jìn)行高量表達(dá)[29]。這種同源基因間表現(xiàn)出不同的組織表達(dá)差異可能與其參與的主要生理功能相關(guān)，也可能與PAs 的區(qū)域化分布及物種特異性有聯(lián)系。研究表明，多種植物ADC基因的轉(zhuǎn)錄水平受非生物脅迫誘導(dǎo)，調(diào)控腐胺含量變化，影響植物抗逆能力。ADC 蛋白通過與枳ICE1 相互作用調(diào)節(jié)PAs 水平提高抗寒性[30]；過表達(dá)AtADC2 的擬南芥具有較高的Put 含量，降低了體內(nèi)H2O2的水平，增強(qiáng)了耐鹽性[31]；橡膠樹HbADC1 以不同表達(dá)模式響應(yīng)低溫、干旱、高鹽和H2O2脅迫[29]；蘋果MdADC的轉(zhuǎn)錄水平與Put 含量呈正相關(guān)，且受低溫、脫水和鹽脅迫的誘導(dǎo)[32]； 枳轉(zhuǎn)錄抑制因子PtrNAC72 反向調(diào)控PtADC的表達(dá)，抑制了Put 的合成，提高了PtrNAC72 過表達(dá)株系對(duì)干旱脅迫的敏感性[33]。本研究中，杜梨PbADC參與了對(duì)低溫、脫水、鹽和H2O2的應(yīng)答，表明該基因可能在杜梨響應(yīng)非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用。但杜梨PbADC基因抵御非生物脅迫的分子機(jī)制及不同條件下如何調(diào)控PAs的代謝，還有待進(jìn)一步深入研究。

圖7 不同非生物脅迫誘導(dǎo)下杜梨PbADC 的相對(duì)表達(dá)模式Fig.7 Relative expression pattern of the PbADC gene under different abiotic stresses in Pyrus betulifolia

4 結(jié)論

本研究從杜梨中克隆得到精氨酸脫羧酶基因PbADC，序列分析證明該蛋白屬于磷酸吡哆醛依賴性酶(PLPDE)家族Ⅲ型PLPDE 亞家族成員，與薔薇科的蘋果、甜櫻桃和桃中的ADC 蛋白聚為一類，在杜梨葉中的表達(dá)水平最高，根次之，莖中的相對(duì)表達(dá)量最低，呈現(xiàn)顯著的組織表達(dá)特異性，受低溫、脫水、鹽和H2O2等逆境脅迫誘導(dǎo)，說明可能參與杜梨抵御非生物脅迫的過程。本研究結(jié)果為探討PbADC的基因功能和作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為梨抗逆育種提供了思路和方向。