王定美，陳新富，麥力文，楊霞，林蕊，李勤奮*

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 海口 571101；2.海南省熱帶生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571101；3.海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，海南 ?？?571199）

氧化應(yīng)激使有機(jī)體處于易損狀態(tài)，可引起有機(jī)體抗氧化系統(tǒng)崩潰、衰敗，甚至產(chǎn)生重大疾病死亡及食物腐敗等多方面不良影響。如何抗氧化已成為醫(yī)藥保健、水產(chǎn)畜禽養(yǎng)殖、食品加工領(lǐng)域面臨的關(guān)鍵課題。目前，使用外源抗氧化劑維持機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的平衡，被認(rèn)為是克服氧化應(yīng)激危害的有效方式[1]。其中，植物來(lái)源的天然抗氧化劑還具有來(lái)源可靠、安全性高、副作用低等諸多優(yōu)點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注[2]。世界衛(wèi)生組織估計(jì)，地球上80%的居民依賴(lài)傳統(tǒng)藥物滿(mǎn)足初級(jí)保健需求，這種療法大多數(shù)依賴(lài)于植物提取物及其有效成分的使用[3]。因此，篩選具高抗氧化活性的植物品種資源，并研究其抗氧化活性特性與活性成分的關(guān)系，對(duì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)安全高效的抗氧化劑具有重要意義。

木薯（Manihot esculenta Crantz）是與馬鈴薯、番薯并稱(chēng)為世界三大薯類(lèi)的重要的熱帶作物之一，為世界第五大糧食作物，在全世界熱帶地區(qū)廣泛栽培。木薯屬于大戟科，此科植物多供藥用，具有抗癌、抗菌、保肝和抗炎等功效[4]。已有研究表明，木薯葉經(jīng)搗爛、煮熟后，不僅可以作為蔬菜食用，可以治療膀胱炎，并且孕婦和哺乳期的婦女都可以食用[5]。木薯葉中還富含黃酮、胡蘿卜素、三萜類(lèi)等生物活性物質(zhì)[6-8]，前人研究表明了木薯葉乙醇提取物中的總黃酮比維生素C表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性[9]，并已作為畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料添加劑進(jìn)行應(yīng)用[10-11]，極具研究開(kāi)發(fā)價(jià)值。

目前，我國(guó)木薯種植主要以收獲塊莖為主，而占薯塊根產(chǎn)量約30%木薯葉片副產(chǎn)物，除少部分作低附加值飼料外，大部分被丟棄，尚未得到充分開(kāi)發(fā)利用[12]。研究還表明，植物抗氧化活性受品種、植齡等多種因素的影響[13-14]。但目前關(guān)于木薯葉提取物的抗氧化活性及成分的僅局限于單個(gè)品種的抗氧化活性評(píng)價(jià)、提取物成分的研究分析及總黃酮含量的動(dòng)態(tài)分析[15-17]，而關(guān)于不同品種、不同植齡的互作影響，仍未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究基于前人研究進(jìn)展，假設(shè)木薯葉乙醇提取物的抗氧化性與總黃酮含量存在顯著關(guān)系，選取9個(gè)葉片產(chǎn)量較大的木薯品種的3個(gè)植齡的葉片乙醇提取物作為研究對(duì)象，檢測(cè)提取物中總黃酮含量及抗氧化活性，探討品種和植齡對(duì)總黃酮含量與抗氧化活性及其相關(guān)關(guān)系的影響，以期將木薯葉片開(kāi)發(fā)為抗氧化劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用樣品共27個(gè)，分別為9個(gè)木薯品種（華南 系 列 品 種 SC06、SC07、SC08、SC09、SC10、SC12、SC13、SC205 及面包木薯品種 BC） 的 120、180 、240 d植齡的葉片樣品，按“品種-植齡”進(jìn)行編號(hào)，如SC06-120，表示木薯品種SC06的120 d植齡葉片樣品。木薯品種來(lái)自海南省儋州市的農(nóng)業(yè)農(nóng)村部木薯種質(zhì)資源圃，葉片樣品采自海南省?？谑腥?zhèn)美達(dá)農(nóng)園農(nóng)場(chǎng)種植基地，洗凈后經(jīng)60℃烘干至恒重，粉碎至粒徑0.3 mm，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁（含量≥98.1%，批號(hào)：1022799）：中國(guó)食品藥品檢定研究院；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；Fe3+-三吡啶三嗪（TPTZ）：比利時(shí)Acros organics公司，試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀：沃特世科技（上海）有限公司；ME204E電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；JL-721DTH數(shù)控超聲波清洗器：南京科捷分析儀器有限公司；HACH DR 6000紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)：美國(guó)哈希公司。

1.3 方法

1.3.1 木薯葉乙醇提取物制備

參考文獻(xiàn)[9]，采用超聲波輔助法制備木薯葉乙醇提取物，具體為：精確稱(chēng)取1 g樣品于50 mL帶螺旋紋的離心管中，加入40 mL 90%的乙醇提取液。以?xún)?yōu)化的超聲波輔助法進(jìn)行提取，提取條件為：超聲功率90 W，提取溫度70℃，提取時(shí)間20 min。提取液分裝于離心管中，-20℃保存作為待測(cè)母液備用。

1.3.2 木薯葉總黃酮含量測(cè)定

精密稱(chēng)取10.0 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，以70%的乙醇溶液溶解并定容至25 mL，制得0.4 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。分別向 10 mL 比色管中加入 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，并用70%乙醇補(bǔ)充體積至5mL，加入0.3 mL質(zhì)量濃度為5%的NaNO2溶液，混勻后反應(yīng)6 min，加入0.3 mL質(zhì)量濃度為10%的Al（NO3）3溶液，混勻后反應(yīng)6 min，加入4 mL 1 mol/L的NaOH溶液，混勻后反應(yīng)10 min，加70%乙醇至10 mL。以70%乙醇為參比，于510 nm下比色。以0.4 mL提取液母液代替蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行樣品測(cè)試，3個(gè)平行。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)獲得的回歸方程，計(jì)算木薯葉總黃酮含量[18]。

1.3.3 DPPH自由基清除率測(cè)定

參考文獻(xiàn)[19-20]，吸取經(jīng)梯度稀釋后的待測(cè)母液1 mL于2 mL的離心管中，加入2×10-4mol/L的DPPH乙醇液1 mL，搖勻后暗處反應(yīng)30 min，于517 nm下比色。同時(shí)以無(wú)水乙醇代替樣品同程序操作測(cè)定溶劑空白，以無(wú)水乙醇代替DPPH乙醇液同程序測(cè)定樣品空白。DPPH自由基清除率按下述公式計(jì)算。

式中：A0為1 mL DPPH乙醇液與1 mL無(wú)水乙醇在517 nm處的吸光度；A1為1 mL樣品液與1 mL DPPH乙醇液在517 nm處的吸光度；A2為1 mL樣品液與1 mL無(wú)水乙醇在517 nm處的吸光度。

將各種濃度的母液待測(cè)液DPPH自由基清除率數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Origin 2018，通過(guò)最優(yōu)模型計(jì)算DPPH自由基清除率為50%時(shí)的母液濃度，記為EC50。

1.3.4 FRAP測(cè)定

參考文獻(xiàn)[19-20]，以不同濃度的FeSO4溶液在590 nm下的吸光度制得工作曲線(xiàn)。精密吸取提取液0.3 mL于小試管中，加入預(yù)熱至37℃的TPTZ工作液2.7 mL，搖勻后放置10 min，于590 nm測(cè)其吸光度值，以無(wú)水乙醇代替樣品加入TPTZ工作液為空白，每個(gè)濃度做3次，求平均值。根據(jù)所得吸光值，在工作曲線(xiàn)上求得相應(yīng)Fe2+當(dāng)量，定義為FRAP值。FRAP按下述公式計(jì)算。

式中：C為樣品扣除空白后的吸光度代入回歸方程得到的Fe2+當(dāng)量，μmol/L；V為待測(cè)液總體積，取3 mL；N為樣品稀釋倍數(shù)；M為樣品質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用EXCEL 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和計(jì)算。采用SPSS 25軟件進(jìn)行差異顯著性分析、聚類(lèi)分析與相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯葉總黃酮含量

各樣品的總黃酮含量如圖1所示，木薯葉總黃酮含量在植齡與品種間變異程度分析見(jiàn)表1。

圖1 各品種不同植齡木薯葉中總黃酮含量Fig.1 Total flavonoids contents in cassava leaves of different cultivars at different cultivation time

表1 木薯葉總黃酮含量在植齡與品種間變異程度分析Table 1 Variation degree analysis of total flavonoids contents in cassava leaves among cultivation times and cultivars

續(xù)表1 木薯葉總黃酮含量在植齡與品種間變異程度分析Continue table 1 Variation degree analysis of total flavonoids contents in cassava leaves among cultivation times and cultivars

由圖1可知，木薯葉總黃酮含量存在顯著差異，受品種和植齡共同影響。120 d植齡下品種SC12、BC、SC08、SC09、SC13、SC205間，180d植齡下品種 SC12、BC、SC08、SC09、SC13 間，240 d 植齡下品種 SC12、BC、SC13間，葉片總黃酮含量差別不顯著（P>0.05），并顯著高于同一植齡下的其它品種，總黃酮含量存在明顯的基因型差異。其中，SC12、BC、SC13的葉片總黃酮含量均處于各個(gè)植齡下最高水平；其總黃酮含量隨植齡的變異系數(shù)分別是10.77%、8.60%、8.14%，為各品種中最小，穩(wěn)定性好，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為富含黃酮的木薯品種。

由表1可知，隨植齡增大，總黃酮含量平均值呈逐漸下降變化、各品種間的變異系數(shù)呈逐漸增大變化。這種變化規(guī)律與王偉等[15]、王琴飛等[17]的研究結(jié)果一致。這可能與木薯各生長(zhǎng)階段的生長(zhǎng)策略有關(guān)。120 d處于木薯地上莖葉生長(zhǎng)高峰期，各品種葉片生長(zhǎng)茂盛、葉片中黃酮等成分大量積累；180 d處于木薯塊根伸長(zhǎng)膨大和淀粉積累充實(shí)時(shí)期，葉片合成的大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐步被用于維持地下部生長(zhǎng)，葉片中黃酮等成分累積減少；240 d處于木薯塊根營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累完成期，并且由于處于冬季，葉片代謝減弱，趨于變黃掉落，黃酮等成分累積更少。

2.2 提取物抗氧化活性表征

2.2.1 還原力測(cè)定結(jié)果

FRAP法通過(guò)測(cè)定化合物的還原能力來(lái)表征其抗氧化活性，F(xiàn)RAP值越大，抗氧化活性越強(qiáng)。圖2為不同植齡下各品種木薯葉FRAP抗氧化能力測(cè)定結(jié)果。

由圖2可知，不同植齡下同一品種的FRAP值差別不大，但不同品種的FRAP值差別顯著，各植齡下各品種的FRAP值差別顯著程度均為SC12、SC13＞BC、SC205＞SC06、SC07、SC08、SC09、SC10（P＜0.05）。說(shuō)明木薯葉的FRAP抗氧化能力不受植齡影響，存在明顯的基因型差異，品種SC12、SC13具有較強(qiáng)的FRAP抗氧化活性，達(dá)到20 mmol/g以上。

圖2 不同植齡的木薯葉FRAP抗氧化活性測(cè)定結(jié)果Fig.2 FRAP antioxidant activity of cassava leaves at different cultivation times

2.2.2 DPPH自由基清除結(jié)果

結(jié)合對(duì)DPPH自由基的清除率測(cè)定結(jié)果，計(jì)算50%清除率下的提取液濃度EC50值，表征抗氧化活性，EC50值越小，抗氧化活性越強(qiáng)，各樣品的EC50值如圖3所示。EC50值在植齡與品種間變異程度分析見(jiàn)表2。

由圖3、表2可知，品種和植齡對(duì)EC50的影響程度不一，9個(gè)品種的EC50平均值在各植齡下分別是120 d（22.65%）≈180 d（22.33%）＞ 240 d（17.94%），EC50值的品種間變異系數(shù)分別是120 d（13.95%）、180 d（18.06%）、240 d（29.12%），DPPH 自由基的清除力較高（EC50小于20%）的樣品數(shù)量分別是120 d和180 d下均為2個(gè)、240 d為4個(gè)，說(shuō)明植齡越大，DPPH自由基清除能力與品種間的差別程度均增大，這與總黃酮含量變化規(guī)律一致。同一品種下，隨植齡增大，各品種EC50的變異系數(shù)處于3.43%～29.79%，離散程度不一。植齡和品種共同影響木薯葉DPPH自由基的清除能力。其中，品種SC12、SC13在各植齡下，DPPH自由基清除能力均處于較高水平，但SC12隨植齡的變異系數(shù)為7.68%，明顯低于SC13隨植齡的變異系數(shù)25.24%，DPPH自由基的清除能力，SC12比SC13穩(wěn)定。

圖3 不同植齡的木薯葉DPPH法抗氧化活性測(cè)定結(jié)果Fig.3 DPPH free radicals scavenging ability of cassava leaves at different cultivation times

2.3 木薯葉乙醇提取物樣品聚類(lèi)分析

為進(jìn)一步挖掘木薯品種間的差異，根據(jù)木薯葉總黃酮含量和抗氧化活性指標(biāo)，通過(guò)聚類(lèi)分析法對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)，采用組間平均聯(lián)結(jié)法，以歐氏距離作為測(cè)度方法，結(jié)果見(jiàn)圖4。

表2 EC50值在植齡與品種間變異程度分析Table 2 Variation degree analysis of EC50 in cassava leaves among cultivation times and cultivars

由圖4可知，所有樣品被分成5類(lèi)：Ⅰ類(lèi)包括SC08-240、SC10-240、SC06-180、SC06-120、SC07-180、SC10-180、SC205-180、SC09-180、SC09-240、SC205-240；Ⅱ類(lèi)包括 SC06-240、SC07-240；Ⅳ類(lèi)包括 SC07-120、SC08-180、SC10-120、BC-180、SC08-120、SC09-120、SC205-120、BC-120；Ⅴ類(lèi)包括 SC12-240、BC-240、SC13-240、SC13-120、SC12-180、SC13-180；Ⅵ類(lèi)包括SC12-120。同一植齡的樣品沒(méi)有都處于一個(gè)聚類(lèi)之中，說(shuō)明不同品種的樣品具有一定的內(nèi)在相似性。結(jié)合圖1、圖2、圖3可知，總黃酮含量高、抗氧化活性大的樣品基本處于一個(gè)類(lèi)別里，5類(lèi)樣品總黃酮含量與抗氧化活性大小排序?yàn)椋孩躅?lèi)、Ⅵ類(lèi)＞Ⅳ類(lèi)＞Ⅰ類(lèi)＞Ⅱ類(lèi)，Ⅴ類(lèi)、Ⅵ類(lèi)中所含樣品可做為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為抗氧化劑的對(duì)象。進(jìn)一步從品種篩選考慮，SC12、SC13在各個(gè)植齡均具有較高的總黃酮含量及抗氧化活性，這兩個(gè)品種作為天然植物抗氧化劑開(kāi)發(fā)的潛力最大。這與前文分析結(jié)果一致，這也預(yù)示著建立統(tǒng)一的基準(zhǔn)，用于評(píng)價(jià)不同品種抗氧化活性是可行的。

2.4 總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析

為進(jìn)一步明確不同品種木薯葉抗氧化活性與其總黃酮含量的關(guān)系，對(duì)不同植齡的木薯葉乙醇提取物中總黃酮含量與抗氧化活性進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，總黃酮含量與鐵離子還原能力FRAP值在240 d植齡和全植齡下存在顯著正相關(guān)關(guān)系（P<0.05），相關(guān)系數(shù)分別為 0.797、0.423；總黃酮含量只有在240 d植齡下與DPPH自由基清除力的EC50值存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P<0.05），相關(guān)系數(shù)為-0.748；其他植齡下，總黃酮含量與抗氧化活性指標(biāo)之間不存在顯著相關(guān)關(guān)系。分析原因是：1）本研究采用的120、180 d植齡的木薯葉乙醇提取物中，總黃酮類(lèi)物質(zhì)并不是唯一起抗氧化作用的物質(zhì)，可能存在黃酮以外具有抗氧化效果的多酚類(lèi)物質(zhì)；2）木薯葉中黃酮類(lèi)物質(zhì)存在多樣性，不同成分的抗氧化作用機(jī)理不一，多種黃酮類(lèi)化合物的抗氧化作用效果相互抵消。由以上分析，240 d植齡下，總黃酮是木薯葉乙醇提取物的主要抗氧化活性成分，并且各黃酮成分抗氧化作用效果表現(xiàn)出協(xié)調(diào)正作用。但木薯葉乙醇提取物中的其他抗氧化活性成分及其抗氧化相互作用機(jī)理，仍需進(jìn)一步研究。

圖4 9個(gè)品種3個(gè)植齡的木薯葉樣品的聚類(lèi)分析結(jié)果Fig.4 Cluster analysis result of cassava leaf samples from 9 cassava cultivars at three cultivation times

表3 不同植齡木薯葉總黃酮含量與抗氧化活性的Pearson相關(guān)分析Table 3 Pearson correlation analysis of total flavonoids content and antioxidant activity of cassava leaves at different cultivation times

3 結(jié)論

木薯葉乙醇提取物中總黃酮含量、抗氧化活性受品種、植齡的影響不一。在各植齡下，品種SC13、SC12的總黃酮含量最高，F(xiàn)RAP值最大、DPPH自由基清除率的EC50值最小，抗氧化活性最強(qiáng)，是天然抗氧化劑的良好來(lái)源。

聚類(lèi)分析將不同品種不同植齡的樣品分為5類(lèi)，揭示了不同品種之間具有內(nèi)在的相似性，與總黃酮含量水平、抗氧化活性評(píng)價(jià)結(jié)果一致，預(yù)示著建立統(tǒng)一的基準(zhǔn)，用于評(píng)價(jià)不同品種抗氧化活性是可行的。

240 d植齡下，木薯葉乙醇提物抗氧化能力與其中總黃酮物質(zhì)有顯著的相關(guān)性，但乙醇提取物中抗氧化組分及其其抗氧化相互作用機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。