呂品，桑田，李朋偉

（河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046）

原花青素（procyanidins，PC）是植物中廣泛存在的一類多酚化合物，由黃烷-3-醇單體（如兒茶素、表兒茶素及其沒食子酸酯等）及其聚合體組成。原花青素具有抗氧化[1-2]、抗腫瘤[3]、防治心血管疾病[4]等多種生物活性，在食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域有著廣泛用途。目前，原花青素含量的測定方法主要有鐵鹽催化比色法[5]、正丁醇-鹽酸法[6]、香草醛法[7]、紫外分光光度法[8]、高效液相色譜法[9]等。其中，香草醛法的準(zhǔn)確度、精密度較好，能同時測定單體及聚合體的總量，操作簡單快捷，是原花青素含量測定常用的方法[10]。其原理是原花青素在酸性條件下，黃烷-3-醇單體A環(huán)的間苯三酚或間苯二酚與香草醛發(fā)生縮合，生成紅色絡(luò)合物，于500 nm處有最大吸收峰，可測其吸光度進(jìn)而定量。香草醛法已用于葡萄[11]、蓮子[12]及花生[13]等多種植物中原花青素含量的測定，但操作方式在不同植物間存在一定差異。

莽吉柿（Garcinia mangostana L.）屬藤黃科藤黃屬植物，別名山竹、倒捻子，果實為著名熱帶水果之一。莽吉柿果殼呈紫褐色，堅硬厚實，包含多種活性成分，如氧雜蒽酮[14]、原花青素[15]及果膠[16]等，具有很高的經(jīng)濟(jì)開發(fā)價值。關(guān)于莽吉柿中原花青素含量測定方面的研究較少[17-18]。本實驗室在前期工作中，參照其他植物建立的香草醛法對莽吉柿原花青素進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)結(jié)果穩(wěn)定性不高，有必要對測定方法進(jìn)行優(yōu)化。因此本文以莽吉柿果殼為材料，研究酸種類與濃度、香草醛濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間對香草醛法測定原花青素的影響，通過響應(yīng)面分析優(yōu)化獲得最佳顯色條件，為莽吉柿果殼中原花青素含量提供準(zhǔn)確有效的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

莽吉柿：鄭州水果市場；兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）：中國食品藥品檢定研究院；香草醛：上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇、無水甲醇、濃硫酸、濃鹽酸（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

精密電子天平（LT200E）：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；超聲清洗機(jī)（PL-FS80T）：東莞康士潔超聲波科技有限公司；低速臺式離心機(jī)（TD-600）：四川蜀科儀器有限公司；電子恒溫水浴鍋（DZKW-4）：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；紫外可見分光光度計（UV-2600A）：尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 莽吉柿果殼原花青素的提取

稱取1 g莽吉柿果殼干粉末，置于100 mL具塞三角瓶內(nèi)，加入20 mL 50%乙醇溶液，放入超聲清洗機(jī)中，設(shè)定超聲功率300 W，超聲提取20 min后，將料液3 000 r/min離心10 min取上清，即得原花青素提取液。取提取液10 mL，置于250 mL容量瓶內(nèi)，加入50%乙醇溶液定容，作為供試樣品溶液[19]。

1.3.2 原花青素的測定

取樣品溶液0.5 mL（另取50%乙醇為空白對照），置于10 mL具塞試管內(nèi)，加入3 mL一定濃度的香草醛-甲醇溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配），再緩慢加入1.5 mL一定濃度的酸溶液，混勻，放入恒溫水浴中避光反應(yīng)，用分光光度計在500 nm處測定其吸光度值。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 酸種類與濃度對吸光度值的影響

在香草醛濃度10 g/100 mL，反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)時間10 min，硫酸濃度分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%及70%，或鹽酸濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%、90%及100%條件下，按照1.3.2方法測定吸光度值。

1.3.3.2 香草醛濃度對吸光度值的影響

在硫酸濃度70%或鹽酸濃度100%，反應(yīng)溫度30 ℃，反應(yīng)時間 10 min，香草醛濃度分別為 2、4、6、8、10、12、14 g/100 mL條件下，按照1.3.2方法測定吸光度值。

1.3.3.3 反應(yīng)溫度對吸光度值的影響

在香草醛濃度10 g/100 mL，硫酸濃度70%或鹽酸體積分?jǐn)?shù)100%，反應(yīng)時間10 min，反應(yīng)溫度分別為10、20、30、40、50、60、70 ℃條件下，按照 1.3.2 方法測定吸光度值。

1.3.3.4 反應(yīng)時間對吸光度值的影響

在香草醛濃度10 g/100 mL，硫酸濃度70%或鹽酸濃度100%，反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)時間分別為5、10、15、20、25、30、35 min 條件下，按照 1.3.2 方法測定吸光度值。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，選取對測定影響較大的3個因素（硫酸濃度、香草醛濃度、反應(yīng)溫度）為自變量，以吸光度值為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗。響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品配制成0.5 mg/mL母液，經(jīng)稀釋獲得 0.01、0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.20 mg/mL濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照響應(yīng)面優(yōu)化的最佳顯色條件，各取0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入3 mL 12 g/100 mL香草醛溶液，再緩慢加入1.5 mL 70%硫酸溶液，混勻后放入43℃水浴中，避光反應(yīng)10 min，在500 nm處測定吸光度值。以吸光度值Y為縱坐標(biāo)，兒茶素濃度X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=6.1295X+0.0416，R2=0.998 9。

1.3.6 測定精密度試驗

取樣品溶液5份，每份0.5 mL，按照響應(yīng)面優(yōu)化的最佳條件進(jìn)行測定，并于次日同樣取5份樣品溶液測定，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值。

1.3.7 加標(biāo)回收率試驗

取樣品溶液0.5 mL，按照優(yōu)化的最佳條件進(jìn)行測定，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出原花青素含量。再取樣品溶液0.5 mL，加入0.12 mg/mL兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL，測定混合溶液中原花青素總含量，計算加標(biāo)回收率。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

每組樣品做3～5個平行，采用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)并制作圖表；采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計與回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 酸種類與濃度對吸光度值的影響

酸種類與濃度對吸光度值的影響見圖1。

如圖1所示，隨著硫酸與鹽酸濃度的增高，吸光度值均越來越大。當(dāng)硫酸濃度為70%時，吸光度值最大，超過70%后，樣品溶液遇酸立即變?yōu)椴厍嗌?，無法進(jìn)行測定，故硫酸濃度70%為濃度上限；鹽酸濃度為100%時，吸光度值達(dá)到最大，無遇酸變色現(xiàn)象。相同濃度的硫酸與鹽酸條件下，硫酸體系測定的吸光度值較高。因此選擇最適宜的硫酸溶液濃度為70%。

圖1 酸種類與濃度對吸光度值的影響Fig.1 Effect of acid type and concentration on absorbance value

2.1.2 香草醛濃度對吸光度值的影響

香草醛濃度對吸光度值的影響見圖2。

圖2 香草醛濃度對吸光度值的影響Fig.2 Effect of vanillin concentration on absorbance value

如圖2所示，隨著香草醛濃度的增高，硫酸與鹽酸體系測定的吸光度值呈現(xiàn)相同變化趨勢。香草醛濃度在2 g/100 mL～10 g/100 mL之間，吸光度值逐漸增大，該階段香草醛濃度越高，與原花青素縮合生成的產(chǎn)物越多，吸光度值越大；當(dāng)香草醛濃度超過10 g/100 mL后，吸光度值趨于平緩，說明樣品溶液中原花青素已經(jīng)反應(yīng)完全，不再生成過多產(chǎn)物，故吸光度值變穩(wěn)定。因此選擇最適宜的香草醛濃度為10 g/100 mL。

2.1.3 反應(yīng)溫度對吸光度值的影響

反應(yīng)溫度對吸光度值的影響見圖3。

圖3 反應(yīng)溫度對吸光度值的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on absorbance value

如圖3所示，隨著反應(yīng)溫度的增高，吸光度值呈現(xiàn)先升后降的趨勢。硫酸體系反應(yīng)溫度在10℃～40℃之間，吸光度值逐漸上升，溫度為40℃時，吸光度值達(dá)到最大；鹽酸體系反應(yīng)溫度為30℃～40℃時，吸光度值較高；溫度超過40℃后，吸光度值均逐漸降低，可能溫度過高會影響原花青素的化學(xué)活性，干擾其與香草醛發(fā)生縮合，導(dǎo)致反應(yīng)不充分，吸光度值下降[12]。因此選擇最適宜的反應(yīng)溫度為40℃。

2.1.4 反應(yīng)時間對吸光度值的影響

反應(yīng)時間對吸光度值的影響見圖4。

圖4 反應(yīng)時間對吸光度值的影響Fig.4 Effect of reaction time on absorbance value

如圖4所示，隨著反應(yīng)時間的延長，硫酸體系測定的吸光度值變化平坦；而鹽酸體系在反應(yīng)10 min時，吸光度值達(dá)最大，超過10 min后，吸光度值呈現(xiàn)緩慢降低的趨勢，在以鹽酸為酸性介質(zhì)測定其它植物原花青素的研究中有類似現(xiàn)象[7，12，20-21]。因此選擇最適宜的反應(yīng)時間為10 min。對比試驗結(jié)果，硫酸體系的穩(wěn)定性較強(qiáng)，響應(yīng)面試驗選擇硫酸為考察因素進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)表1試驗因素與水平值，以吸光度值為響應(yīng)值，對3個試驗因素進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology

2.2.2 回歸方程擬合與方差分析

對表2試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，建立回歸模型，獲得吸光度值與硫酸濃度A、香草醛濃度B、反應(yīng)溫度C三因素變量的二次多項回歸方程：

Y=0.73+0.22A+0.026B+0.022C-1.750×10-3AB-5.000×10-4AC-4.000×10-3BC+0.032A2-0.028B2-0.036C2。

對模型系數(shù)的方差分析結(jié)果如表3所示。

表3 回歸模型的方差分析表Table 3 Analysis of variance table of regression model

該模型P＜0.000 1，達(dá)到差異極顯著水平，表明本次建模有意義；模型失擬項F=3.40，P＞0.05，無顯著差異，說明試驗結(jié)果誤差較??；RSD=0.749 3%，說明可信度和精確度高；模型系數(shù)R2=0.999 0，校正系數(shù)Radj2=0.997 7，回歸方程擬合度較好，可以利用該方程對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和預(yù)測；模型變異系數(shù)C.V.=1.05%，顯示試驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)可靠，能很好地預(yù)測響應(yīng)面。從對響應(yīng)值的影響程度來看，一次項 A、B、C，二次項 A2、B2、C2均達(dá)到極顯著水平，表明試驗因素對吸光度值的影響是一種非線性關(guān)系，影響大小依次為：硫酸濃度>香草醛濃度>反應(yīng)溫度。

2.2.3 因素間交互作用分析

各試驗因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖5～圖7，通過判斷響應(yīng)面的坡度和等高線的圓形程度，從而獲得最佳的工藝條件[22]。

圖5 硫酸濃度與香草醛濃度交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour map for the effects of sulfuric acid and vanillin concentration

圖6 硫酸濃度與反應(yīng)溫度交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour map for the effects of sulfuric acid and reaction temperature

圖7 香草醛濃度與反應(yīng)溫度交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour map for the effects of vanillin concentration and reaction temperature

分析響應(yīng)面圖可知，隨著硫酸濃度的增高，吸光度值越來越大，隨著香草醛濃度、反應(yīng)溫度的增高，吸光度值分別呈現(xiàn)上升后平穩(wěn)與先上升后下降的趨勢。將各響應(yīng)面圖進(jìn)行對比，硫酸濃度對吸光度值的影響最大，表現(xiàn)為其曲面坡度較為陡峭；而香草醛濃度、反應(yīng)溫度的曲面坡度相對較平緩，說明兩因素對吸光度值的影響較小。硫酸濃度、香草醛濃度、反應(yīng)溫度兩兩交互作用對吸光度值沒有顯著影響，表現(xiàn)為各等高線圖中等高線的圓形程度明顯[23]，這與回歸方程的方差分析結(jié)果一致。

2.2.4 最佳顯色條件的驗證

響應(yīng)面優(yōu)化的最佳條件為：香草醛濃度11.69 g/100 mL、硫酸濃度70%、反應(yīng)溫度42.82℃、反應(yīng)時間10 min，吸光度預(yù)測值可達(dá)0.985。根據(jù)實際操作需要，將最佳條件改進(jìn)為：香草醛濃度12 g/100 mL、硫酸濃度70%、反應(yīng)溫度43℃、反應(yīng)時間10 min，以此條件進(jìn)行5次驗證試驗，獲得吸光度平均值為0.979，RSD值為0.609%，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出莽吉柿果殼中原花青素的含量為76.45 mg/g。所建模型優(yōu)化的最佳顯色條件穩(wěn)定，能夠真實反映試驗值，可行性強(qiáng)。

2.3 測定精密度試驗結(jié)果

按照最佳條件平行測定5份樣品溶液，計算RSD值，結(jié)果見表4。

表4 測定精密度試驗結(jié)果Table 4 Results of precision tests

由表4可知，吸光度值RSD分別為0.635%和0.612%，表明優(yōu)化最佳條件測定表現(xiàn)出良好的精密度。

2.4 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果

按照最佳條件進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗，結(jié)果見表5。

表5 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果Table 5 Results of recovery rate tests

由表5可知，加標(biāo)回收率的平均值為98.83%，RSD值為1.25%，表明優(yōu)化最佳條件測定表現(xiàn)出較高的準(zhǔn)確度。

3 結(jié)論

本文首次對香草醛法測定莽吉柿果殼原花青素的顯色條件進(jìn)行優(yōu)化。單因素試驗顯示采用硫酸作為酸性介質(zhì)，體系的穩(wěn)定性較強(qiáng)；響應(yīng)面優(yōu)化最佳顯色條件為：樣品溶液0.5 mL，12 g/100 mL香草醛溶液3 mL，70%硫酸溶液1.5 mL，反應(yīng)溫度43℃，避光反應(yīng)10 min；在此條件下測得莽吉柿果殼中原花青素含量為76.45 mg/g，RSD值為0.609%。優(yōu)化后的方法具有較高的精密度及準(zhǔn)確度，穩(wěn)定性良好，適用于莽吉柿果殼中原花青素含量的測定。