向凡舒，龍旭霞，趙楠，侯強(qiáng)川，郭壯*

（1.湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610066）

作為一類傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜制品，泡菜可分為泡漬泡菜和鹽漬泡菜兩大類[1]。較之泡漬泡菜，鹽漬泡菜無需泡制發(fā)酵，制作工藝包括鹽漬、清洗整形、脫鹽脫水和配料鹽制等環(huán)節(jié)[2]。泡菜的制作屬厭氧自然發(fā)酵，其中蘊(yùn)含的微生物類群對(duì)泡菜風(fēng)味品質(zhì)的形成具有重要的作用[3]，有研究指出地理環(huán)境[4]、原料[5]、制作方式[6]、發(fā)酵溫度[7]和鹽濃度[8]等因素均對(duì)泡菜微生物類群的形成具有明顯的影響。泡菜中的微生物類群主要來源于蔬菜原料表面的乳酸菌[3]，而制作泡菜的原料通常包括蘿卜、白菜、豇豆、青椒和萵苣等各類新鮮蔬菜，但由于品種、季節(jié)和產(chǎn)地等因素的影響，不同原料表面攜帶的乳酸菌類群可能存在差異[2]。Liang H等[5]研究表明白菜泡菜鹽水中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為乳酸桿菌，而混合蔬菜鹽水中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為乳酸桿菌和魏斯氏菌。明確泡菜中微生物類群構(gòu)成是控制和提升泡菜品質(zhì)的關(guān)鍵，因而探討發(fā)酵方式和原料等因素對(duì)泡菜中微生物類群的影響，對(duì)提升泡菜品質(zhì)和食用安全性具有積極的意義。

位于恩施土家族苗族自治州的宣恩縣有以沙蔥（Allium mongolicum Regel）和切絲的青椒（Capsicum annuum var.grossum）為原料進(jìn)行鹽漬泡菜制作的習(xí)俗。當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶制作發(fā)酵沙蔥的方法如下：將洗凈的沙蔥放入濃鹽水中漂洗兩遍后瀝干，加入食鹽和陳醋置于壇中密封發(fā)酵10 d左右即可制得發(fā)酵沙蔥，除無需使用濃鹽水漂洗外，發(fā)酵青椒的做法與沙蔥相同。由此可見，相同的地理環(huán)境及相似的制作工藝，為探討原料這一因素對(duì)鹽漬泡菜細(xì)菌類群的影響提供參考。

本研究采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)宣恩縣發(fā)酵沙蔥和發(fā)酵青椒樣品的細(xì)菌多樣性進(jìn)行解析，同時(shí)對(duì)其細(xì)菌基因功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，進(jìn)而探討原料對(duì)鹽漬泡菜細(xì)菌類群及基因功能的影響，以期為后續(xù)相關(guān)鹽漬泡菜制品生產(chǎn)工藝的改良提供理論指導(dǎo)，同時(shí)為發(fā)酵沙蔥等特色發(fā)酵蔬菜制品微生物多樣性的理論研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

發(fā)酵沙蔥和青椒樣品：市售；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；引物338F/806R：天一輝遠(yuǎn)（武漢）生物科技有限公司；10倍緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）和脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（5 U/μL）：北京全式金生物技術(shù)有限公司。

Veriti FAST梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國 ABI公司；R920 型機(jī)架式服務(wù)器：美國DELL公司；164-5050基礎(chǔ)電泳儀：美國BIO-RAD公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國Protein Simple公司；Illumina MiSeq PE250高通量測(cè)序平臺(tái)：美國Illumina公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集

納入本研究的樣品均于2018年12月下旬采集自湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩縣三橋菜市場(chǎng)。發(fā)酵沙蔥編號(hào)為YSC1、YSC2和YSC3，發(fā)酵青椒編號(hào)為QJ1、QJ2和QJ3。所有樣品均在當(dāng)?shù)刂谱骱弯N售，樣品采集時(shí)其制作時(shí)間約在20 d～30 d。

1.2.2 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序

每個(gè)樣品各取2 g，使用試劑盒提取微生物的總DNA，并參照文獻(xiàn)[9]中的方法進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物寄往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

參照文獻(xiàn)[9]中的方法對(duì)下機(jī)序列進(jìn)行質(zhì)控后，將合格序列上傳至QIIME（V1.7.0）分析平臺(tái)進(jìn)行微生物類群分析，依次進(jìn)行序列對(duì)齊、分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）劃分[10]、序列比對(duì)[11]、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建[12]、α多樣性和β多樣性分析[13]。

將同一類鹽漬泡菜中平均相對(duì)含量>1.0%的門、屬和OTU，定義為優(yōu)勢(shì)門、屬和OTU；若每個(gè)樣品都含有某一OTU，則將該OTU定義為核心OTU；若某一OTU在3個(gè)發(fā)酵沙蔥樣品中均存在，而在3個(gè)發(fā)酵青椒樣品中均不存在，則將其定義為發(fā)酵沙蔥樣品的獨(dú)特 OTU，反之亦然[14]。

1.2.4 基因功能預(yù)測(cè)

使用phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states（PICRUSt）軟件預(yù)測(cè)鹽漬泡菜中細(xì)菌的基因功能[15]，并參照蛋白質(zhì)直系同源簇?cái)?shù)據(jù)庫（clusters of orthologous groups of proteins，COG）進(jìn)行注釋[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用曼惠尼（Mann-Whitney）檢驗(yàn)對(duì)各α多樣性指標(biāo)和各基因功能類別指標(biāo)進(jìn)行顯著性分析；使用多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和基因功能的整體差異性進(jìn)行分析；使用非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法（unweighted pair group method using arithmetic average，UPGMA）聚類對(duì)兩類鹽漬泡菜的β多樣性進(jìn)行分析。采用R語言實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序情況和α多樣性分析

本研究采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)發(fā)酵沙蔥和發(fā)酵青椒的細(xì)菌類群結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，6個(gè)樣品測(cè)序共得到了225 242條序列，每個(gè)樣品平均測(cè)序深度為37 540條，其中有5條序列經(jīng)對(duì)齊后比對(duì)失敗，剩余225 237條序列依據(jù)97%相似性劃分了OTU，共得到了10 213個(gè)OTU，每個(gè)樣品平均含有1 702個(gè)OTU，其中發(fā)酵沙蔥中共有7 689個(gè)OTU，發(fā)酵青椒中共有6 763個(gè)OTU。所有樣品的測(cè)序情況和各分類學(xué)地位數(shù)量見表1。

表1 樣品測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 1 Sequencing results of samples

由表1可知，對(duì)OTU中代表性序列進(jìn)行同源性比對(duì)，將所有序列鑒定為26個(gè)門、64個(gè)綱、105個(gè)目、204個(gè)科和444個(gè)屬，不能鑒定到門和屬的序列數(shù)分別占總序列的0.18%和11.96%。經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵沙蔥超1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)均顯著偏高（P<0.05），因而其細(xì)菌的豐度和多樣性均高于發(fā)酵青椒。制作發(fā)酵青椒所使用的辣椒品種為二荊條，其辣度在5 000～15 000史高維爾指標(biāo)（scoville heat units，SHU），其中含有的辣椒素和辣椒堿等活性成分具有一定的抑菌作用，這可能是導(dǎo)致其細(xì)菌豐度和多樣性低的主要原因[17]。Jeong等[18]的研究亦表明，在泡菜中添加辣椒粉會(huì)影響泡菜在發(fā)酵初期微生物的演替和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致泡菜發(fā)酵過程減慢。

2.2 β多樣性分析

本研究進(jìn)一步采用基于UniFrac距離的加權(quán)和非加權(quán)UPGMA對(duì)兩類鹽漬泡菜菌群差異性進(jìn)行了分析見圖1。

圖1 基于OTU水平加權(quán)和非加權(quán)UniFrac距離的UPGMAFig.1 UPGMA based on weighted and unweighted UniFrac distance at OTU lever

由圖1A可知，除QJ1和QJ2形成一個(gè)聚類外，其他同類樣品并未呈現(xiàn)出明顯的聚類趨勢(shì)，而由圖1B可知，QJ2和QJ3形成一個(gè)聚類，YSC1和YSC2形成一個(gè)聚類，因而基于非加權(quán)分析的同一類樣品間聚類趨勢(shì)要明顯于加權(quán)分析。較之UPGMA，基于UniFrac距離的UPGMA考慮了不同物種在進(jìn)化譜系中的遺傳距離[19]，同時(shí)在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的加權(quán)分析還進(jìn)一步考慮了OTU中序列豐度，而非加權(quán)分析僅考慮OTU中序列的有和無，有即為1，無則為0[20]。基于OTU相對(duì)含量矩陣，本研究進(jìn)一步使用MANOVA對(duì)兩類鹽漬泡菜微生物群落結(jié)構(gòu)的差異性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示差異顯著（P<0.05）。由此可見，雖然在聚類圖中存在交疊現(xiàn)象，但兩類鹽漬泡菜的微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著。

2.3 基于門、屬和OTU水平的相對(duì)含量比較

發(fā)酵沙蔥（A）和發(fā)酵青椒（B）中優(yōu)勢(shì)菌門相對(duì)含量如圖2所示。

圖2 發(fā)酵沙蔥和發(fā)酵青椒中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門相對(duì)含量Fig.2 Relative abundance of dominant bacterial phyla in fermented Allium mongolicum Regel and Capsicum annuum var.grossum

由圖2可知，發(fā)酵沙蔥中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為Proteobacteria（變形菌門，49.92%）、Firmicutes（硬壁菌門，45.77%）、Actinobacteria（放線菌門，2.18%） 和 Bacteroidetes（擬桿菌門，1.44%）；發(fā)酵青椒中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為 Proteobacteria（68.70%）、Actinobacteria（17.05%）、Firmicutes（10.08%）和 Bacteroidetes（2.30%）。經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵沙蔥中Firmicutes的相對(duì)含量顯著偏高（P<0.05）。

發(fā)酵沙蔥（A）和發(fā)酵青椒（B）中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的相對(duì)含量如圖3所示。

圖3 發(fā)酵沙蔥和青椒中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬相對(duì)含量Fig.3 Relative abundance of dominant bacterial genera in fermented Allium mongolicum Regel and Capsicum annuum var.grossum

由圖3A可知，發(fā)酵沙蔥中有11個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，分別為隸屬于Firmicutes的Lactobacillus（乳酸桿菌屬，22.8%）、Lentibacillus（慢生芽胞桿菌屬，7.68%）、Weissella（魏斯氏菌屬，5.03%）、Gracilibacillus（糖球菌屬，3.70%）、Oceanobacillus（海洋桿菌屬，1.78%）和Bacillus（芽孢桿菌屬，1.51%），隸屬于 Proteobacteria的Pantoea（泛菌屬，13.54%）、Acinetobacter（不動(dòng)菌屬，5.74%）、Pseudomonas（假單胞菌屬，5.70%）、Erwinia（歐文氏菌屬，3.21%）和 Rahnella（拉恩氏菌屬，3.11%）；由圖3B可知，發(fā)酵青椒中有8個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，分別為隸屬于Proteobacteria的Pseudomonas（假單胞菌屬，31.35%）、Obesumbacterium（肥桿菌屬，7.70%）、Rouxiella（2.10%）和 Psychrobacter（嗜冷桿菌屬，1.61%），隸屬于Actinobacteria的Thermoleophilum（棲熱嗜油菌屬，16.31%）和 Kluyvera（克呂沃爾氏菌屬，8.93%），隸屬于Firmicutes的Lactococcus（乳球菌屬，3.08%）和Lactobacillus（乳桿菌屬，2.30%）。經(jīng) Mann-Whitney檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵沙蔥中 Lactobacillus、Pantoea、Lentibacillus和Rahnella的相對(duì)含量顯著偏高（P<0.05）。沙蔥為百合科蔥屬植物，有研究表明Pantoea allii可導(dǎo)致與沙蔥同一屬的洋蔥發(fā)生枯萎病[21]，因而發(fā)酵沙蔥中存在Pantoea的原因可能在于制作過程中使用了患枯萎病的原料。由此可見，兩類鹽漬泡菜細(xì)菌類群在屬水平上存在較大的差異。

發(fā)酵沙蔥中存在68個(gè)特殊OTU，累計(jì)平均含量為8.40%，其中24個(gè)OTU隸屬于Pantoea，累計(jì)含量達(dá)5.54%；4個(gè)OTU隸屬于Pseudomonas，累計(jì)含量達(dá)0.025%；3個(gè) OTU隸屬于 Rahnella，累計(jì)含量達(dá)0.045%；而其他OTU均不可鑒定到屬水平，且平均相對(duì)含量均低于0.01%。發(fā)酵青椒中存在2個(gè)特殊OTU，分別被鑒定為Lactobacillus和Bacteroides，平均相對(duì)含量分別為0.007%和0.03%。由此可見，兩類鹽漬泡菜在含量較低的OTU上存在一定的差異。

2.4 核心細(xì)菌類群的研究

在對(duì)不同樣品中獨(dú)特OTU進(jìn)行甄別的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)核心OTU進(jìn)行了解析。共發(fā)現(xiàn)35個(gè)核心OTU，累計(jì)平均相對(duì)含量為17.23%，其中平均相對(duì)含量>1.0%的如圖4所示。

圖4 發(fā)酵沙蔥和青椒中優(yōu)勢(shì)核心OTU相對(duì)含量Fig.4 Relative abundance of dominant core OTUs in fermented Allium mongolicum Regel and Capsicum annuum var.grossum

由圖4可知，共有6核心OTU平均相對(duì)含量>1.0%，累計(jì)平均相對(duì)含量達(dá)到12.34%，其中OTU4948、OTU789、OTU3975、OTU3978、OTU2257 和 OTU2191 的平均相對(duì)含量為3.38%、2.95%、2.16%、1.78%、1.07%和1.01%，除 OTU4948和 OTU789被鑒定為 Thermoleophilum外，其他4個(gè)OTU被依次鑒定為Weissella、Pseudomonas、Acinetobacter和 Lactobacillus。由此可見，雖兩類鹽漬泡菜在含量較低的細(xì)菌類群上存在差異，但亦共有部分相同的細(xì)菌類群。

2.5 基于PICRUSt功能預(yù)測(cè)分析

發(fā)酵沙蔥和發(fā)酵青椒細(xì)菌類群功能大類的注釋結(jié)果如圖5所示。

圖5 發(fā)酵沙蔥和青椒細(xì)菌基因功能預(yù)測(cè)Fig.5 Predict gene functions of bacteria in fermented Allium mongolicum Regel and Capsicum annuum var.grossum

由圖5可知，所有細(xì)菌共注釋到了4 166個(gè)GOG，分別隸屬于23個(gè)功能大類，且兩類鹽漬泡菜在氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝（E）、碳水化合物運(yùn)輸與代謝（G）以及轉(zhuǎn)錄（K）功能上均具有較高表達(dá)，而在RNA的加工與修飾（A）、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué)（B）和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（N）等功能上的表達(dá)較低。經(jīng)Mood-median檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵青椒中細(xì)菌在能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換（C）、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝（E）、核苷轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝（F）和轉(zhuǎn)錄功能（K）的表達(dá)上顯著偏高（P<0.05）。由圖5可知，不同類型的樣品呈現(xiàn)出明顯的聚類趨勢(shì)，其中YSC1、YSC2和YSC3形成一個(gè)聚類，QJ1和QJ3形成一個(gè)聚類。基于基因功能預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)矩陣，本研究進(jìn)一步使用MANOVA對(duì)兩類鹽漬泡菜基因功能的整體差異性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示差異顯著（P<0.05）。由此可見，兩類鹽漬泡菜細(xì)菌基因功能的表達(dá)存在顯著差異。

3 結(jié)論

兩類鹽漬泡菜在細(xì)菌類群和基因功能的表達(dá)上均存在顯著差異，其中發(fā)酵沙蔥細(xì)菌類群的豐度和多樣性及硬壁菌門、乳酸桿菌屬、慢生芽胞桿菌屬、泛菌屬和拉恩氏菌屬的相對(duì)含量均顯著偏高，而菌群能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、核苷轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝和轉(zhuǎn)錄等功能基因的表達(dá)均顯著偏低。由此可見，原料對(duì)鹽漬泡菜的細(xì)菌類群與菌群基因功能的表達(dá)具有顯著的影響。