張曉曉，任劍星，劉凱毅，李瀟，董健

(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)

保護(hù)生態(tài)環(huán)境以及發(fā)展可持續(xù)再生的清潔能源是人類需要致力去完成的2個(gè)生態(tài)目標(biāo)。而被公認(rèn)為可再生清潔能源中最有發(fā)展前景之一的就是燃料乙醇，其因具有清潔、可再生、能夠降低尾氣中有害物質(zhì)的排放等優(yōu)點(diǎn)受到各界的廣泛關(guān)注[1]。釀酒酵母是以糖質(zhì)和淀粉質(zhì)為原料的乙醇發(fā)酵最經(jīng)典的菌株[2]，是出色的乙醇生產(chǎn)者，也是目前應(yīng)用最為廣泛的酵母菌株。發(fā)酵過(guò)程中面臨的各種脅迫環(huán)境使得提高釀酒酵母耐受性的研究具有很重要的意義。

酵母細(xì)胞中其中一條重要的保守信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是雷帕霉素靶標(biāo)激酶(target of rapamycin，TOR)信號(hào)通路,該通路包含兩個(gè)密切相關(guān)的因子TOR1和TOR2,它們調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)以響應(yīng)營(yíng)養(yǎng)的利用和細(xì)胞壓力[3-6]。TOR1間接指導(dǎo)蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)活性，影響細(xì)胞的磷酸化反應(yīng)，進(jìn)而影響細(xì)胞一系列的生命活動(dòng)。TOR是真核細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中非常重要的激酶[7-8]，第一次被人們發(fā)現(xiàn)是從芽殖酵母Saccharomycescerevisiae中分離得到[9]。TORC1蛋白激酶是由TOR1基因調(diào)控的，該激酶與細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及壓力有密切的關(guān)系，在多細(xì)胞動(dòng)物中TORC1可以整合來(lái)自多方的信號(hào)。TOR1作為TORC1蛋白激酶的調(diào)節(jié)亞基，不僅參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，還參與調(diào)控多種細(xì)胞過(guò)程，包括蛋白質(zhì)合成、減數(shù)分裂、轉(zhuǎn)錄激活、細(xì)胞周期等[10-11]，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)[12]。TOR活性的降低可以延長(zhǎng)許多物種的壽命，包括酵母，小鼠以及人類細(xì)胞[13]。有研究表明[14]，通過(guò)TOR1基因的缺失降低TOR信號(hào)通路的活性，可以延長(zhǎng)釀酒酵母的時(shí)序壽命，這是在繼發(fā)現(xiàn)TOR1基因敲除可以延長(zhǎng)果蠅壽命后的又一重大發(fā)現(xiàn)。TORC1對(duì)藥物雷帕霉素敏感[15]，雷帕霉素與Fpr1p形成復(fù)合物，與TOR蛋白結(jié)合并抑制復(fù)合物活性[4,16-17]。

綜上，研究TOR1基因與酵母耐受性之間的關(guān)系對(duì)于構(gòu)建高耐性的工業(yè)酵母菌株具有重要的意義。本工作通過(guò)胞內(nèi)同源重組的方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)出發(fā)菌株的TOR1基因的敲除。對(duì)親本菌株和改造菌株的生長(zhǎng)性能、脅迫環(huán)境下的耐受性以及發(fā)酵性能進(jìn)行比較。耐受性研究主要是通過(guò)稀釋點(diǎn)板試驗(yàn)對(duì)高溫、高乙醇、高滲、高乙酸脅迫環(huán)境下的菌株耐受性進(jìn)行比較，并對(duì)不同低pH以及氧化環(huán)境下的耐受性進(jìn)行了比較。發(fā)酵性能的測(cè)定采用了玉米濃醪發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，對(duì)其發(fā)酵時(shí)間，CO2失重，細(xì)胞48 h存活率以及發(fā)酵完成后的酒度和殘?zhí)沁M(jìn)行測(cè)定。通過(guò)對(duì)以上2個(gè)方面內(nèi)容進(jìn)行比較，研究在釀酒酵母中，TOR1基因的缺失對(duì)其生長(zhǎng)耐受性和發(fā)酵性能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

本實(shí)驗(yàn)所用菌株以及所構(gòu)建的菌株見表1。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和酶

酵母浸粉(生化試劑),天津泰進(jìn)科技有限公司；胰蛋白胨(生化試劑),北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司；葡萄糖(分析純)、NaCl(分析純),天津索羅門生物科技有限公司；DL5000 DNA Marker(生化試劑),TaKaRa公司；rTaq DNA聚合酶,中國(guó)大連寶生物有限公司。

表1 實(shí)驗(yàn)所用菌株

1.1.3 儀器與設(shè)備

生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀，芬蘭Oy Growth Curves Ab公司；UVmini—1240島津紫外分光光度計(jì)，島津儀器(蘇州)有限公司；PCT-200聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)基因擴(kuò)增儀、PowerPacTM型電泳儀，美國(guó)BIO-RAD公司；生物顯微鏡BX43型，日本OLYMPUS會(huì)社。

1.1.4 主要培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸粉10，pH自然，115 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基需額外添加2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂粉。

SD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，無(wú)氨基酵母氮源(yeast nitrogen base without amino acids，YNB) 0.6，Ura Dropout powder 0.13，115 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基需額外添加2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂粉。

KAC培養(yǎng)基(g/L)：醋酸鉀20，瓊脂粉20，蒸餾水配制，115 ℃滅菌15 min。

耐鹽培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸粉10，NaCl 8、9、10，115 ℃滅菌20 min。

耐酒精培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸粉10，115 ℃滅菌15 min，待冷卻至室溫，加入10%vol、11%vol的無(wú)水乙醇。

耐乙酸培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸粉10，115 ℃滅菌15 min，待冷卻至室溫，加入0.4%、0.5%、0.6%(體積分?jǐn)?shù))的乙酸。

耐低pH培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸粉10，調(diào)節(jié)pH值至5、4.5，115 ℃滅菌15 min。

耐H2O2培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸粉10，115 ℃滅菌15 min，待冷卻至室溫，加入(6.5、7.5 mmol/L)的H2O2。

一級(jí)種子培養(yǎng)基：8 Bix°的玉米水解液，0.5 g/L的酵母浸粉。

二級(jí)種子培養(yǎng)基：12 Bix°的玉米水解液，0.5 g/L的酵母浸粉。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的構(gòu)建

1.2.1.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查閱到的釀酒酵母模式菌株的基因序列，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，用于改造菌株的構(gòu)建以及驗(yàn)證。三引物用來(lái)驗(yàn)證突變菌株的單倍體和二倍體，本實(shí)驗(yàn)所用引物序列如表2所示。

表2 實(shí)驗(yàn)所用PCR引物

1.2.1.2 目的片段的擴(kuò)增

以親本菌株AY12a的基因組為模板，Y-TOR1-U和Y-TOR1-D為上下游引物， PCR擴(kuò)增帶有部分同源序列的URA3基因片段，所得產(chǎn)物即帶有標(biāo)記基因URA3且該基因兩側(cè)帶有待敲除基因同源序列的DNA擴(kuò)增片段。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中釀酒酵母模式菌株S288C的序列可知其片段長(zhǎng)度大小為884 bp。

1.2.1.3 敲除TOR1基因釀酒酵母突變株的構(gòu)建

本工作以釀酒酵母菌株AY12a-ΔU為出發(fā)菌株，TOR1基因作為靶基因，選擇的篩選標(biāo)記為URA3基因，將得到的目的基因片段通過(guò)醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[18-19]導(dǎo)入酵母細(xì)胞，通過(guò)同源重組實(shí)現(xiàn)TOR1基因的敲除。轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞涂布至SD抗性平板，得到的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證。具體操作如圖1所示。

圖1 敲除TOR1基因的構(gòu)建過(guò)程

1.2.2 釀酒酵母細(xì)胞單雙倍體制備

(1)酵母二倍體融合制備及驗(yàn)證：分別取a型菌株與α型菌株于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12 h，然后從中各取0.5 mL菌液接于含有5 mL的YEPD培養(yǎng)基的試管中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，再各取0.5 mL于30 ℃、180 r/min菌液混合培養(yǎng)6 h，混合培養(yǎng)的菌液劃三區(qū)純化，待長(zhǎng)出單菌落后，于顯微鏡下觀察是否有啞鈴狀，并用三引物驗(yàn)證是否單倍體融合成功。

(2)二倍體酵母細(xì)胞產(chǎn)孢制備單倍體：將活化好的二倍體菌株涂布在固體YEPD培養(yǎng)基上，待其長(zhǎng)出菌落后，將菌泥涂布在干燥的KAC平板上，于28 ℃下培養(yǎng)4～5 d，然后取少量菌體于顯微鏡下觀察，看是否有子囊孢子形成，如果有大量子囊孢子形成，則刮取大量菌泥，將其懸浮于0.5 mL的生理鹽水中，取出0.1 mL，加入3%(體積分?jǐn)?shù))的蝸牛酶0.5 mL，將其放于30 ℃水浴振蕩處理1～4 h，然后顯微鏡觀察子囊壁的水解情況，看是否破壁成功，破壁成功后，將其放至60 ℃水浴振蕩10 min，以殺死二倍體細(xì)胞，然后將菌液稀釋涂布在YEPD平板上，待其長(zhǎng)出單菌落后，使用三引物驗(yàn)證單倍體情況。

1.2.3 釀酒酵母細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

為了檢測(cè)釀酒酵母的生長(zhǎng)情況，本實(shí)驗(yàn)選擇生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀測(cè)量OD600值，其具體操作步驟如下所示。

(1)從斜面或甘油管接種適量菌種到新鮮培養(yǎng)基里，于30 ℃、180 r/min條件下活化菌種；

(2)取活化好的菌液用移液槍按梯度打到100孔板里，每株菌按0、2、4、6、8 μL的梯度，用YEPD培養(yǎng)基補(bǔ)至200 μL；

(3)將加有菌液的100孔板放置于生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀中，30 ℃，每0.5 h測(cè)定1次，測(cè)24 h；

(4)測(cè)定完成后，記錄數(shù)據(jù)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線圖。

1.2.4 釀酒酵母細(xì)胞耐受性的測(cè)定

為檢測(cè)釀酒酵母細(xì)胞的耐受性，本實(shí)驗(yàn)選擇點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其耐受性[16]。為了保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，將所測(cè)菌株的初始OD600值調(diào)到一致，然后將不同濃度梯度的菌液點(diǎn)到相應(yīng)耐受性平板上，30 ℃培養(yǎng)1～2 d，觀察菌株生長(zhǎng)情況，和出發(fā)菌株作對(duì)比，以此來(lái)判斷菌株的耐受性，本實(shí)驗(yàn)主要測(cè)了如下幾種耐受性。

(1)耐熱性：為測(cè)定菌株對(duì)高溫的耐受能力，可將菌株于55 ℃下熱擊4 min，然后用移液槍吸取2 μL菌液，按不同濃度梯度點(diǎn)到Y(jié)EPD平板，根據(jù)菌株生長(zhǎng)情況判斷耐受性；

(2)耐鹽性：用移液槍吸取2 μL菌液按不同濃度梯度點(diǎn)到含有NaCl(質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、9%)的平板上，培養(yǎng)觀察結(jié)果；

(3)耐乙酸性：用移液槍吸取2 μL菌液按不同濃度梯度點(diǎn)到含有乙酸(體積分?jǐn)?shù)0.4%、0.5%、0.6%)的平板上，培養(yǎng)觀察結(jié)果；

(4)耐醇性：用移液槍吸取2 μL菌液按不同濃度梯度點(diǎn)到含有乙醇(體積分?jǐn)?shù)10%、11%)的平板上，培養(yǎng)觀察結(jié)果。

(5)耐低pH:用移液槍吸取2 μL菌液按不同濃度梯度點(diǎn)到不同pH(4.5、 5)的平板上，培養(yǎng)觀察結(jié)果。

(6)耐氧化環(huán)境：用移液槍吸取2 μL菌液按不同濃度梯度點(diǎn)到含有H2O2(6.5 mmol/L、7.5 mmol/L H2O2)的平板上，培養(yǎng)觀察結(jié)果。

1.2.5 乙醇含量的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用示差液相色譜儀對(duì)發(fā)酵液中的乙醇含量進(jìn)行測(cè)定[20]。

色譜條件：色譜柱為Bio-Red的Aminex HPX-87H色譜柱；柱溫60 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相為5 mmoL的H2SO4；流速0.6 mL/min。

1.2.6 還原糖的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)使用斐林試劑法[21]對(duì)發(fā)酵完成后發(fā)酵液中的還原糖進(jìn)行滴定。

1.2.7 細(xì)胞存活率的測(cè)定

細(xì)胞存活率的測(cè)定通過(guò)次甲基藍(lán)染色法[22]來(lái)測(cè)定。

亞甲基藍(lán)是一種生物活體染色劑，屬于堿性染料，可以快速區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。它的作用機(jī)理是活細(xì)胞的細(xì)胞膜是完整的，可以阻止藍(lán)色染料進(jìn)入細(xì)胞，從而不被染成藍(lán)色；而喪失活性細(xì)胞的細(xì)胞膜是不完整的，它的細(xì)胞膜通透性變強(qiáng)，因此會(huì)被染成藍(lán)色。

當(dāng)濃醪發(fā)酵進(jìn)行48 h后，搖勻發(fā)酵液，取25 mL發(fā)酵液，離心取上清液，將上清液稀釋為合適的梯度。將100 μL稀釋后的樣液和900 μL的亞甲基藍(lán)染液混合均勻，靜置5 min，待充分染色后，吸取100 μL混合液置于血球計(jì)數(shù)板上，隨后在顯微鏡下觀察并且數(shù)菌落數(shù)即可。

1.2.8 玉米原料高溫濃醪酒精發(fā)酵

為檢測(cè)菌種發(fā)酵性能，本實(shí)驗(yàn)?zāi)M白酒發(fā)酵工藝，選擇玉米原料高溫濃醪酒精發(fā)酵[23-25]。其主要操作步驟如下：

(1)玉米水解液的制備

稱取1 kg的玉米顆粒，向其中加入3 L預(yù)熱到60～70 ℃的自來(lái)水，靜置20 min左右，進(jìn)行玉米粒的糊化，使得充分膨脹，然后加入0.6 mL的液化酶(α-淀粉酶2×105U/mL)，于85～90 ℃條件下液化1.5 h，期間可進(jìn)行攪拌，提高液化效率，液化結(jié)束后，降溫至55～60 ℃，加入2 mL糖化酶(200 U/mL)糖化20 h，同樣進(jìn)行攪拌。待糖化結(jié)束后，將糖化液用3層濾布過(guò)濾，得到滲出液即為玉米水解液，在105 ℃下高壓滅菌20 min，室溫保存使用。

(2)種子培養(yǎng)基的制備

一級(jí)種子培養(yǎng)基：將制備好的玉米水解液的糖度調(diào)到8 °Bé，向其中加入0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的酵母浸粉，然后根據(jù)需求分裝，每個(gè)試管分裝6 mL，于105 ℃下高壓滅菌20 min，待降至室溫時(shí)，接1環(huán)菌，放置于30 ℃培養(yǎng)箱，靜置培養(yǎng)24 h。

二級(jí)種子培養(yǎng)基：將制備好的玉米水解液的糖度調(diào)到12 °Bé，向其中加入0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的酵母浸粉，然后根據(jù)需求分裝，每個(gè)錐形瓶分裝54 mL，于105 ℃下高壓滅菌20 min，待降至室溫時(shí)，將培養(yǎng)好的一級(jí)種子液全部加入錐形瓶中，放置于30 ℃培養(yǎng)箱，靜置培養(yǎng)16 h。

(3)玉米水解液發(fā)酵

將制備好的玉米水解液的糖度調(diào)到20 °Bé，然后根據(jù)需求分裝，每個(gè)錐形瓶分裝135 mL，于105 ℃下高壓滅菌20 min，待降至室溫時(shí)，接種二級(jí)種子液15 mL，再加入1 mL的營(yíng)養(yǎng)鹽，放置于30 ℃培養(yǎng)箱發(fā)酵，每隔12 h稱重1次，記錄CO2產(chǎn)量，當(dāng)差值在0.1 g左右時(shí)，即發(fā)酵結(jié)束。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段的獲得與驗(yàn)證

以親本菌株AY12a為模板，利用引物對(duì)TOR1-U和TOR1-D，通過(guò)PCR反應(yīng)，擴(kuò)增URA3基因片段，在該基因兩端各帶有40 bp的同源序列，片段長(zhǎng)度為884 bp。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)片段的正確性，結(jié)果如圖2所示。

M-DL5000 marker；泳道1、2、3-884 bp

2.2 突變株獲得的驗(yàn)證

提取陰性對(duì)照AY12a基因組及SD平板上長(zhǎng)出來(lái)的轉(zhuǎn)化子的基因組，利用驗(yàn)證引物Y-TOR1- U和Y-TOR1-D對(duì)構(gòu)建的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行定點(diǎn)驗(yàn)證，其片段長(zhǎng)度為993 bp，且陰性對(duì)照無(wú)條帶，表明其菌株構(gòu)建成功,結(jié)果如圖3所示。

2.3 URA3基因的回復(fù)驗(yàn)證

釀酒酵母中的HO基因編碼一種負(fù)責(zé)啟動(dòng)配對(duì)型轉(zhuǎn)化的內(nèi)切酶，即HO基因的存在，可以實(shí)現(xiàn)單倍體之間的相互轉(zhuǎn)換或者單倍體轉(zhuǎn)換為二倍體[26-27]。本實(shí)驗(yàn)以釀酒酵母AY12a為出發(fā)菌株，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增HO基因，證明了在該菌株中存在HO基因。其片段長(zhǎng)度為1 761 bp，與預(yù)期片段長(zhǎng)度一致，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖4所示。

M-DL5000 marker；泳道1-擴(kuò)增片段(1 761 bp)

由于URA3基因突變的菌株可能會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)性能和發(fā)酵性能產(chǎn)生影響，故本實(shí)驗(yàn)中選擇通過(guò)融合生胞的方式達(dá)到回復(fù)突變的目的。按照1.2.2方法對(duì)突變菌株的URA3基因進(jìn)行回復(fù)突變，URA3正確回復(fù)的菌株在SD平板上生長(zhǎng)良好且在SD-5FOA平板上不能生長(zhǎng)或者生長(zhǎng)極其緩慢，通過(guò)生長(zhǎng)驗(yàn)證得到URA3成功回復(fù)的改造菌株，結(jié)果如圖5所示。

2.4 突變株AY12a-tor1Δ與親本菌株AY12a生長(zhǎng)性能的比較

為了檢測(cè)親本菌株AY12a和構(gòu)建菌株AY12a-tor1Δ的生長(zhǎng)性能，本實(shí)驗(yàn)按照1.2.3方法，對(duì)2株菌在30 ℃培養(yǎng)條件下的吸光值進(jìn)行了測(cè)定，并據(jù)此繪制生長(zhǎng)曲線圖，結(jié)果如圖6所示。

在30 ℃培養(yǎng)條件下，突變株AY12a-tor1Δ與親本菌株AY12a的生長(zhǎng)性能沒(méi)有明顯差別，其均在4 h時(shí)達(dá)到對(duì)數(shù)期。對(duì)于工業(yè)菌株來(lái)說(shuō)，生長(zhǎng)性能是否發(fā)生明顯改變是一個(gè)非常重要的選擇條件。本實(shí)驗(yàn)中，該改造菌株的生長(zhǎng)性能并沒(méi)有明顯降低，故可用于下一步耐受性及發(fā)酵性能的驗(yàn)證。

a-SD平板；b-SD-5FOA平板

圖6 菌株的生長(zhǎng)曲線

2.5 突變株AY12a-tor1Δ與親本菌株AY12a耐受性的比較

為了檢測(cè)菌種的耐受性，本實(shí)驗(yàn)按照1.2.4方法檢測(cè)了高溫(55 ℃)、高乙醇(體積分?jǐn)?shù)10%、11%)、高鹽(質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、9%)、高乙酸(體積分?jǐn)?shù)0.4%、0.5%、0.6%)、低pH及氧化環(huán)境對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，并進(jìn)行了耐受性分析。結(jié)果如圖7所示。

由圖7-a可知，在未添加脅迫的生長(zhǎng)環(huán)境下，出發(fā)菌株AY12a和突變株AY12a-tor1Δ的生長(zhǎng)情況未出現(xiàn)明顯差異，表明點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)之前這2株菌的初始菌體濃度基本上是一致的。由圖7-b可知，在經(jīng)過(guò)55 ℃水浴熱激4 min后，出發(fā)菌株AY12a和突變菌株的生長(zhǎng)都受到了不同程度的抑制。在相同的稀釋倍數(shù)(10-3)下，突變株AY12a-tor1Δ有菌落長(zhǎng)出。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該效果的真實(shí)性，對(duì)這株菌的熱激存活率進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示改造菌株的熱激存活率較原菌提高了5%，可見其熱激耐受性較親本菌株有所提高，敲除TOR1基因?qū)μ岣呔甑臒峒つ褪苄杂幸欢ǖ男Ч?；圖7-d中，在添加9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl的脅迫環(huán)境下，可以明顯看出AY12a-tor1Δ突變株的菌落數(shù)多于原菌，說(shuō)明敲除TOR1基因提高了對(duì)高滲環(huán)境的耐受性；如圖7-c所示，在添加0.4%、0.5%、0.6%(體積分?jǐn)?shù))乙酸的脅迫環(huán)境下，相較于出發(fā)菌株AY12a，在相同稀釋倍數(shù)下，突變菌株AY12a-tor1Δ菌落數(shù)略多于原菌，尤其在0.6%乙酸脅迫下，當(dāng)稀釋100倍后，該乙酸濃度抑制了原菌的生長(zhǎng)，表明敲除TOR1基因可以提高菌株的乙酸耐受性；如圖7-e所示，在培養(yǎng)基中添加10%、11%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇后，與出發(fā)菌株AY12a相比較，突變菌株AY12a-tor1Δ的生長(zhǎng)沒(méi)有較大的變化，說(shuō)明10%、11%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇對(duì)突變株的生長(zhǎng)沒(méi)有協(xié)迫性；如圖7-f所示，在pH 5的平板上，突變菌株AY12a-tor1Δ的菌落數(shù)較原菌略少；在pH 4.5的平板上，2株菌的生長(zhǎng)情況有明顯的區(qū)別，改造菌株的菌落數(shù)明顯減少，說(shuō)明TOR1基因的敲除沒(méi)有改善菌株對(duì)酸性環(huán)境(HCl)的耐受性；如圖7-g所示，突變菌株的耐氧化能力明顯較原菌好，表明敲除TOR1基因可以提高釀酒酵母的抗氧化能力。PKA的活性與菌株的耐受性有一定的關(guān)聯(lián)，有研究報(bào)導(dǎo)PKA活性的降低可以增加菌株的耐受性[28]，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果也從側(cè)面證明了敲除該通路中的TOR1基因，PKA活性降低，進(jìn)而增加了其對(duì)一些脅迫環(huán)境的耐受性。

2.6 突變株AY12a-tor1Δ與親本菌株AY12a的玉米原料高溫濃醪酒精發(fā)酵

為檢測(cè)菌種的發(fā)酵性能，按照1.2.8方法將改造后的菌株AY12a-tor1Δ和出發(fā)菌株AY12a進(jìn)行模擬白酒發(fā)酵。按照1.2.5～1.2.7方法分別對(duì)發(fā)酵液中的乙醇含量、殘?zhí)呛俊?4 h細(xì)胞存活率進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如表3所示。

表3 親本菌株和改造菌株的發(fā)酵性能比較

由表3可知，在30 ℃玉米濃醪發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，突變株AY12a-tor1Δ的殘?zhí)呛枯^出發(fā)菌株下降27.8%，且其乙醇產(chǎn)量有所上升，大約提高9.2%；48 h主發(fā)酵完成后的細(xì)胞存活率略微提高，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)24 h。酵母細(xì)胞的正常發(fā)酵時(shí)間是72 h，改造菌株發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，可以從側(cè)面證明細(xì)胞對(duì)脅迫環(huán)境的耐受性提高[29]。由此看來(lái)，該發(fā)酵數(shù)據(jù)與細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果基本一致，與耐受性實(shí)驗(yàn)也大致相符。

a-對(duì)照；b-高溫(55 ℃)處理；c-乙酸處理；(1、2、3代表乙酸體積分?jǐn)?shù)0.4%、0.5%、0.6%)；d-高鹽處理(1、2代表NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、9%);e-高乙醇處理(1、2乙醇體積分?jǐn)?shù)10%、11%)；f-低pH處理(1、2代表pH 5、pH 4.5)；g-氧化處理(1、2代表添加H2O2 6.5、7.5 mmol/L)

2.7 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)采用長(zhǎng)引物敲除法，以釀酒酵母AY12a為親本菌株，TOR1基因?yàn)榘谢?，通過(guò)胞內(nèi)同源重組，獲得突變株AY12a-tor1Δ。釀酒酵母菌株的生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)圖表明，在30 ℃的培養(yǎng)條件下，突變株AY12a-tor1Δ的生長(zhǎng)性能與AY12a相比沒(méi)有明顯變化。菌株AY12a和AY12a-tor1Δ在高溫脅迫環(huán)境下的耐受性結(jié)果顯示，AY12a-tor1Δ的高溫耐受性高于原菌；在乙酸，高鹽脅迫下的耐受性結(jié)果表明TOR1基因的敲除有效提高了其對(duì)這些脅迫的耐受性；在低pH環(huán)境下，突變株AY12a-tor1Δ的耐受力較差；氧化環(huán)境下突變株AY12a-tor1Δ的抗氧化能力有明顯的提高。30 ℃下玉米濃醪發(fā)酵數(shù)據(jù)表明突變株AY12a-tor1Δ的乙醇產(chǎn)量上升，殘?zhí)窍陆?，但其發(fā)酵時(shí)間有所延長(zhǎng)。

3 結(jié)論

本文以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有菌種AY12a為出發(fā)菌株，URA3基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，利用長(zhǎng)引物敲除法來(lái)實(shí)現(xiàn)TOR1基因的缺失，成功構(gòu)建了缺失TOR1基因的突變菌株AY12a-tor1Δ，期望通過(guò)TOR1基因的敲除達(dá)到提高工業(yè)菌株釀酒酵母耐受性的目的。

對(duì)突變株AY12a-tor1Δ進(jìn)行耐受性和發(fā)酵性能的測(cè)定，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示突變株AY12a-tor1Δ表現(xiàn)出一定的耐高溫性，在其他脅迫環(huán)境下，耐受性也有明顯提高。發(fā)酵數(shù)據(jù)顯示突變株AY12a-tor1Δ的乙醇含量較出發(fā)菌株上升，殘?zhí)呛肯陆?，且其發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)?？傮w來(lái)看，改造菌株的耐受性和發(fā)酵性能均較原菌有所改善，為工業(yè)菌株耐受性的提高奠定了一定的基礎(chǔ)。