王俊奇，黃衛(wèi)紅，李雙彤，袁建軍，陳洪彬，馬應(yīng)倫，張秋芳*

1(泉州師范學院 海洋與食品學院，福建 泉州，362000)2(永春老醋醋業(yè)有限責任公司，福建 泉州，362000)

福建永春老醋，別名福建紅曲陳醋，是我國四大名醋之一，其產(chǎn)品特點是能夠產(chǎn)生一種令人愉快的香氣，食用起來具有酸而不澀、酸中有甜和濃香醇厚的獨特風味，其產(chǎn)品是以紅曲、糯米、芝麻和白糖等為主要原料，在不同微生物共同參與下完成的生物轉(zhuǎn)化的液態(tài)發(fā)酵過程中形成[1-4]，細菌和真菌的組成隨著陳醋生產(chǎn)階段不同而發(fā)生變化，對陳醋品質(zhì)形成過程起著不同作用，在醋醅發(fā)酵過程中，菌群數(shù)量變化主要體現(xiàn)在酵母菌和細菌數(shù)量的變化，酵母菌和細菌數(shù)量均呈先增后減的趨勢，相比之下其他菌群的數(shù)量則較小[5]。釀造過程中微生物群落的變化對食醋的風味具有重要影響，研究發(fā)現(xiàn)食醋釀造中細菌群落對風味的相關(guān)性高于真菌群落，表明細菌群落是醋味的主要生產(chǎn)者[6]。高通量測序技術(shù)具有準確、快速和高效的檢測性能，已成為當前研究環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的主流技術(shù)[7]，該技術(shù)在食品微生物領(lǐng)域的研究也越來越受關(guān)注。目前，對永春老醋微生物的報道多為傳統(tǒng)的微生物菌種構(gòu)建、優(yōu)勢菌分離純化以及菌種保藏等研究[8-9]，運用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)分析永春老醋不同品質(zhì)階段細菌和真菌優(yōu)勢菌群變化趨勢的研究尚無相關(guān)報道。

本研究采用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)，分別以16S rRNA和18S rRNA基因為分子標記，對發(fā)酵中、1個月成品、1年陳釀和10年陳釀4個主要品質(zhì)形成階段的永春老醋中細菌與真菌群落多樣性動態(tài)變化進行分析，擬獲得永春老醋不同階段具有優(yōu)勢作用的微生物群落組成特征，為初步探究永春老醋不同階段微生物組成變化對食醋風味的影響提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

于福建省永春老醋醋業(yè)有限責任公司采集發(fā)酵中(Y1)、1個月成品(Y2)、1年陳釀(Y3)和10年陳釀(Y4)4個具有代表性的不同生產(chǎn)和保存階段樣品，分別各自混勻后，各取200 mL，用0.22 μm的水系微孔濾膜(Merck Millipore公司，美國)進行抽濾，將抽濾后收集有微生物的濾膜存放在-80 ℃下，經(jīng)凍干后的樣品用于總DNA提取。

1.2 樣品總DNA提取

用消毒剪刀將收集有微生物的濾膜剪碎，采用FastDNA Spin Kit For Soil試劑盒(MP Biomedicals公司，美國)提取總DNA，應(yīng)用核酸提取儀(MP Biomedicals公司，美國)，均質(zhì)條件為18 s和4.5 m/s，提取步驟參照說明書進行。將獲得的總DNA用70 μL DES溶液收集，核酸測定儀測定DNA濃度和純度后貯存于-80 ℃下備用。

1.3 聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增及測序

用帶有Barcode序列[10]的引物對338F/806R[11]和817f/1196r[12]分別作為細菌16S rRNA基因和真菌18S rRNA基因引物。其中，16S rRNA基因用引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′和806R：5′-GGACTACHVGGTWTCTAA-3′；18S rRNA基因用引物817f：5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′和1196r：5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′。分別用16S rRNAX和18S rRNA基因引物對提取的樣品總DNA進行PCR擴增。16S rRNA基因擴增條件：95 ℃、2 min，95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min(33個循環(huán))，72 ℃、5 min。18S rRNA基因擴增條件：95 ℃、3 min，95 ℃、30 s，54 ℃、30 s，72 ℃、45 s(35個循環(huán))，72 ℃、10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證后，取足夠量送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，在Illumina Miseq平臺上測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

去除原始序列中的引物序列與Barcode序列，得到PE-reads，利用Flash軟件[13]將所得到的PE-reads拼接成一條序列，并用QⅡME v.1.7.0軟件進行分析[14]。運用Uclust軟件[13]以97%的閾值進行操作分類單位(operational taxonomic unit，OTU)劃分，從而實現(xiàn)對序列聚類。然后通過核糖體數(shù)據(jù)庫項目(ribosomal database project，RDP)Classifier軟件[15]和SILVA數(shù)據(jù)庫[16]將提取出來的每個OTU序列的分類信息進行注釋。利用Mothur v1.30.1軟件對相似水平高于97%的OTUs進行α-多樣性分析，內(nèi)容包括覆蓋率(Coverage)、Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)，從而評估單樣品內(nèi)微生物群落的豐富度和多樣性。通過R語言統(tǒng)計和作圖工具來進行物種組成分析，包括物種Venn圖和群落組成分析[17]，運用R語言軟件進行層級聚類分析，對微生物的β-多樣性進行分析。獲得的16S rRNA和18S rRNA基因DNA序列已收錄于NCBI數(shù)據(jù)庫的Sequences Read Archive(SRA)，登錄號分別為SRP222992和SRP222989。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-多樣性分析

由表1可知，4個階段永春老醋樣品中微生物Coverage指數(shù)均大于0.99，說明樣品中絕大多數(shù)DNA序列都被測出，即測序深度可以反映出樣品中微生物的真實情況。就細菌而言，除在10年陳釀(Y4)樣品中未檢測到外，前3個階段樣品之間細菌的OTU總數(shù)區(qū)別不大，其中1個月成品(Y2)的OTU數(shù)量相對較高；1個月成品(Y2)的Chao指數(shù)最大，物種豐富度最大；3個樣品的Shannon指數(shù)區(qū)別不大，說明前3個階段的細菌生物多樣性差別較小。就真菌而言，1年陳釀(Y3)的OTU數(shù)量最少，而且1個月成品(Y2)、1年陳釀(Y3)與發(fā)酵中(Y1)、10年陳釀(Y4)的OTU總數(shù)相差較大；1個月成品(Y2)的Chao指數(shù)最小，物種豐富度最小，發(fā)酵中(Y1)、1個月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)的Shannon指數(shù)差別不大，但是10年陳釀(Y4)比其他樣品高很多，說明前3個階段樣品的真菌多樣性差別較小，10年陳釀(Y4)的真菌多樣性較好。以上可以得出，永春老醋前3個階段中細菌物種豐度顯著高于真菌，而在10年陳釀(Y4)中，真菌生物的豐度大幅增加，可能是由于貯存10年后老醋中的優(yōu)勢菌群為酵母菌。

表1 永春老醋不同階段α-多樣性指數(shù)

2.2 物種Venn圖分析

如圖1-a所示，發(fā)酵中(Y1)、1個月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)樣品中的OTU數(shù)一共為27個。3個樣品共有的OTU數(shù)為19個，除發(fā)酵中(Y1)特有1個OTU外，其他樣品無特有OTU存在。說明3個樣品物種組成較為相似，單獨存在于各樣品的物種極少；真菌OUT數(shù)量如圖1-b所示，4個階段樣品中的OTU數(shù)一共為24個，4個樣品中共有的OTU數(shù)為8個，單獨存在于發(fā)酵中(Y1)、1個月成品(Y2)和10年陳釀(Y4)的OTU數(shù)分別為5、1和7，相比較而言，發(fā)酵中(Y1)和10年陳釀(Y4)的真菌群落組成較為特殊。

a-OTU水平下細菌韋恩圖；b-OTU水平下真菌韋恩圖

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)組成分析

2.3.1 細菌群落結(jié)構(gòu)組成

在門水平下，永春老醋在發(fā)酵中(Y1)、1個月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)樣品中共檢測出2類細菌物種。

由圖2可知，3個階段樣品主要優(yōu)勢細菌物種均為變形菌門(Proteobacteria)，相對豐度分別為67.44%、68.46%和75.14%；其次是厚壁菌門(Firmicutes)，相對豐度分別為32.53%、31.51%和24.85%。結(jié)果表明，3個階段的細菌群落結(jié)構(gòu)組成相近，只是1年陳釀(Y3)樣品的組成比例與前兩個階段稍有差異。變形菌門中大部分為好氧型或自養(yǎng)型細菌，永春老醋發(fā)酵和前期貯存過程中攪拌通氧、產(chǎn)酸環(huán)境為這些細菌提供了有利的生長環(huán)境，使這類細菌相對豐度較高；厚壁菌門中大多數(shù)為厭氧細菌，這類細菌能在高酸環(huán)境下生長并且對維持食醋酸度具有重要作用[18]，因而永春老醋發(fā)酵和前期貯存過程中存在相對豐度低于變形菌門的厚壁菌門細菌群落。

圖2 門水平下永春老醋發(fā)酵中(Y1)、1個月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)3個階段細菌群落結(jié)構(gòu)

在綱水平下，永春老醋在發(fā)酵中(Y1)、1個月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)樣品中共檢測出4類細菌物種。相對豐度>1%的物種如圖3所示，3個階段的優(yōu)勢菌綱分別是α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)和芽孢桿菌綱 (Bacilli)，α-變形菌綱的相對豐度分別為67.41%、68.25%和75.04%，芽孢桿菌綱的相對豐度分別為32.53%、31.51%和24.85%。3個階段中α-變形菌綱的相對豐度與變形菌門的相對豐度非常接近，說明3個階段細菌物種在變形菌門水平下主要為α-變形菌綱，同時包含少量其他物種；芽孢桿菌綱的相對豐度與厚壁菌門的相對豐度完全一致，說明細菌物種在厚壁菌門水平下均為芽孢桿菌綱。α-變形菌綱菌群多為專性好氧菌，是食醋釀造中將糖類和醇類物質(zhì)氧化為有機酸的主要微生物[19]；芽孢桿菌綱菌群為兼性厭氧菌，這類微生物含有的特殊酶系能夠?qū)⒋蠓肿犹穷愇镔|(zhì)和蛋白質(zhì)分解為葡萄糖和簡單肽段，為α-變形菌綱菌群提供可利用的有機物質(zhì)。

圖3 綱水平下永春老醋發(fā)酵中(Y1)、1個月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)3個階段細菌群落結(jié)構(gòu)

在屬水平下，永春老醋前3個階段樣品一共檢測出13類細菌物種。圖4顯示的是豐度水平前2的物種，其他物種合并為others。發(fā)酵中(Y1)樣品的優(yōu)勢細菌物種分別是相對豐度為66.58%的醋酸桿菌屬(Acetobacter)和31.74%的乳桿菌屬(Lactobacillus)，在1個月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)樣品中醋酸桿菌屬相對豐度分別為68.21%和74.84%，乳桿菌屬相對豐度分別為30.88%和24.72%。3個階段中的絕對優(yōu)勢菌醋酸菌屬是一類好氧微生物[20]，氧化生成的醋酸是食醋中有機酸的主要成分，因此食醋發(fā)酵階段主要添加醋酸菌；在1年陳釀(Y3)中醋酸菌屬豐度達到最高，可能是發(fā)酵結(jié)束后食醋中存在充足的氧氣和有機物質(zhì)，更利于這類微生物生長；乳酸菌屬為兼性厭氧菌，在低氧環(huán)境下仍能快速生長繁殖，所以發(fā)酵過程中乳酸菌屬的相對豐度要高于成品貯存階段。乳酸菌是調(diào)和食醋終產(chǎn)品風味的重要組成部分，可能來源于醋醅中。此外乳酸菌還具有蛋白質(zhì)分解酶，把蛋白質(zhì)分解為肽和氨基酸，但酶活相比其他微生物則較弱，需要更長時間來分解蛋白質(zhì)[21]，乳酸菌的存在可增加食醋中多種有機酸和胞外多糖等功能性成分的含量，提高食醋風味和營養(yǎng)價值[22]。從永春老醋前3個階段乳酸菌屬和醋酸菌屬各自所占比例來看，3個階段中2個菌屬都以接近1∶3的比例共存，可能是形成永春老醋獨特風味的重要原因。

圖4 屬水平下永春老醋發(fā)酵中(Y1)、1個月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)3個階段細菌群落結(jié)構(gòu)

2.3.2 真菌群落結(jié)構(gòu)組成

在門水平下，4個階段永春老醋樣品中共有7類真菌物種。圖5顯示的是相對豐度水平>1%的優(yōu)勢物種，子囊菌門(Ascomycota)皆為4個階段永春老醋的優(yōu)勢菌種，相對豐度分別為98.90%、99.98%、99.96%和97.12%，說明其對永春老醋不同階段風味和品質(zhì)的形成皆起著重要作用；發(fā)酵中(Y1)和10年陳釀(Y4)還檢測到相對豐度分別為1.03%和1.01%的擔子菌門(Basidiomycota)，說明擔子菌門對食醋的發(fā)酵和后期貯存過程中風味和品質(zhì)的形成也具有一定作用；此外，10年陳釀(Y4)中還存在1.72%為分類不明的真菌(norank_k_Fungi)。

圖5 門水平下永春老醋發(fā)酵中(Y1)、1個月成品(Y2)、1年陳釀(Y3)和10年陳釀(Y4)4個階段真菌群落結(jié)構(gòu)

在綱水平下，4個階段的永春老醋樣品共有13類真菌物種，圖6顯示的是相對豐度水平前3的物種，其他物種合并為others。發(fā)酵中(Y1)、1個月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)樣品的優(yōu)勢菌綱為酵母綱(Saccharomycetes)，相對豐度分別達到96.84%、98.85%和98.93%，其次是散囊菌綱(Eurotiomycetes)，相對豐度分別為1.80%、1.09%和0.98%；10年陳釀(Y4)的優(yōu)勢菌綱為散囊菌綱，相對豐度為50.36%，酵母菌綱相對豐度只占46.43%。以上說明，發(fā)酵中(Y1)、1個月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)樣品的優(yōu)勢菌群除了相對豐度略顯差異外，其群落結(jié)構(gòu)組成較為相近；10年陳釀(Y4)中優(yōu)勢菌群的結(jié)構(gòu)組成和比例均與前3個階段存在明顯差異。原因可能是由于永春老醋在生產(chǎn)和前期貯存過程中存在充足的糖類物質(zhì)供酵母類菌群降解為乙醇和CO2，所以酵母類菌群能夠大量存活；而貯存10年后的老醋隨著貯存時間延長，食醋中有機物質(zhì)含量下降，水分活度降低，滲透壓升高，優(yōu)勢菌群由酵母菌綱轉(zhuǎn)變?yōu)橐子谠诘退只疃群透邼B透壓環(huán)境中生長的散囊菌綱。

圖6 綱水平下永春老醋發(fā)酵中(Y1)、1個月成品(Y2)、1年陳釀(Y3)和10年陳釀(Y4)4個階段真菌群落結(jié)構(gòu)

在屬水平下，4個階段永春老醋樣品共有17個真菌物種，圖7顯示的是相對豐度水平前5的物種，其他物種合并為others。發(fā)酵中(Y1)、1個月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)樣品中絕對優(yōu)勢菌群均為酵母目未分類屬(unclassified_o_Saccharomycetales)，相對豐度分別為96.37%、98.80%和98.73%。酵母菌是食醋釀造過程中主要功能微生物，發(fā)酵過程中的酵母菌大部分源于醋醅，酵母菌不僅能發(fā)酵糖類產(chǎn)生乙醇，而且能代謝產(chǎn)生豐富的風味成分，例如生香釀酒酵母、假絲酵母和產(chǎn)酯的畢赤酵母等[23]。10年陳釀(Y4)中真菌群落的組成和比例發(fā)生一定變化，優(yōu)勢菌群主要由相對豐度為50.36%的發(fā)菌科未分類屬(unclassified_f_Trichocomaceae)、28.07%的酵母目分類不明屬(norank_o_Saccharomycetales)以及17.68%的畢赤酵母屬(Pichia)組成。永春老醋在發(fā)酵和前期貯存中存在充足的糖類有機物質(zhì)，非常適于酵母菌屬菌群生長，所以酵母菌屬在永春老醋發(fā)酵階段和成品前期貯存中均占絕對優(yōu)勢；10年陳釀中酵母菌屬比例明顯減少，可能是由于老醋在長期貯存中糖類物質(zhì)含量降低，使得酵母菌屬生長被抑制。10年陳釀(Y4)中存在了一定比例的畢赤酵母屬，畢赤酵母是食醋發(fā)酵中常見的產(chǎn)香酵母，具有增加食醋香味的作用[24]。這類微生物在低pH、高滲透壓等不利環(huán)境下適應(yīng)能力較強[25]。

圖7 屬水平下永春老醋發(fā)酵中(Y1)、1個月成品(Y2)、1年陳釀(Y3)和10年陳釀(Y4)4個階段真菌群落結(jié)構(gòu)

2.4 β-多樣性分析

層級聚類分析可以直觀地將樣品間相似或差異程度反映在層級聚類樹圖上，如果樣品間物種組成越相似，在層級聚類樹圖中距離數(shù)值就越接近。如圖8-a所示，3組樣品間都相差一定距離，說明發(fā)酵中(Y1)、1個月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)樣品細菌群落都有一定差異。其中，1個月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)優(yōu)先聚類，二者的距離為0.101 6，細菌群落差異程度較小；發(fā)酵中(Y1)與1個月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)的距離分別為0.269 0和0.267 7，說明發(fā)酵中(Y1)與2個成品細菌群落的差異程度較大。由圖8-b可知，除10年陳釀(Y4)外，前3個階段樣品優(yōu)先聚類，1個月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)距離最短，幾乎沒有差異，說明兩者真菌群落相似性很高；發(fā)酵中(Y1)樣品與1個月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)的距離分別為0.024 9和0.023 8，說明發(fā)酵中Y1樣品與2個成品的真菌群落組成也較為相近；前3個階段樣品與10年陳釀(Y4)的距離分別為0.973 9、0.984 3和0.983 6，說明前3個階段樣品與10年陳釀(Y4)真菌群落之間差異非常明顯。綜上可知，發(fā)酵中(Y1)、1個月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)之間的細菌群落相似性要低于真菌群落，說明永春老醋在發(fā)酵和產(chǎn)品前期貯存過程中，醋液中細菌群落的變化大于真菌群落。

a-OTU水平下細菌層級聚類樹;b-OTU水平下真菌層級聚類樹

3 討論與結(jié)論

本研究應(yīng)用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)對形成永春老醋品質(zhì)的微生物多樣性進行了分析。研究結(jié)果表明了永春老醋發(fā)酵中、1個月成品、1年陳釀和10年陳釀4個階段主要的優(yōu)勢菌相對含量和組成均有所不同，說明了不同階段不同微生物對老醋品質(zhì)的形成可能起著不同的作用。豐度(Chao)和多樣性(Shannon)指數(shù)分析顯示，發(fā)酵中、1個月成品和1年陳釀永春老醋中細菌和真菌的豐富度與多樣性差別較小，且相同時期下細菌豐富度與多樣性均顯著高于真菌；10年陳釀永春老醋中真菌豐度和多樣性指數(shù)增加明顯。菌群OTU數(shù)量顯示發(fā)酵中、1個月成品和1年陳釀永春老醋細菌群落組成較為相似，發(fā)酵中和10年陳釀永春老醋真菌群落組成較為特殊。永春老醋發(fā)酵過程中和成品前期貯存階段(1個月和1年)以醋酸桿菌屬(Acetobacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和酵母目未分類屬(unclassified_o_Saccharomycetales)為優(yōu)勢菌，這3個階段中乳酸菌代謝產(chǎn)物為醋酸菌和酵母菌提供充足的糖類、氨基酸和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，酵母菌發(fā)酵糖類物質(zhì)產(chǎn)生的醇類和醛類物質(zhì)進一步被醋酸菌發(fā)酵生成有機酸[26-27]。種類不同的乳酸菌和酵母菌共培養(yǎng)時相互作用不同，某些特殊酵母菌和乳酸菌共培養(yǎng)時會產(chǎn)生愉悅香味，而另一些則會產(chǎn)生異味[28-29]。這3類優(yōu)勢菌共同保證了永春老醋發(fā)酵中和成品前期貯存階段的獨特風味和品質(zhì)。隨著貯存時間延長，10年陳釀永春老醋中優(yōu)勢菌由發(fā)菌科未分類屬(unclassified_f_Trichocomaceae)、酵母目分類不明屬(norank_o_Saccharomycetales)和部分畢赤酵母屬(Pichia)組成，卻無法檢測到細菌類微生物。說明經(jīng)過長期貯存和物質(zhì)轉(zhuǎn)化，其微生物組成發(fā)生了變化。10年永春老醋由于長時間密閉貯存，醋液中含氧量和營養(yǎng)物質(zhì)急劇下降，已不適合細菌類微生物在老醋溶液環(huán)境中生存，此時主要存在維持老醋品質(zhì)的酵母菌和易于低pH和高滲透壓環(huán)境中生長的發(fā)菌。1個月成品和1年陳釀2個階段細菌群落組成相近，但與發(fā)酵中的樣品存在較大差異；發(fā)酵中、1個月成品和1年陳釀3個前期生產(chǎn)和保存階段的永春老醋真菌群落相似度高，皆與10年陳釀有明顯差異，細菌與真菌群落組成在不同階段的變化趨勢不同，細菌在發(fā)酵過程中的變化大于貯存前期，說明細菌可能在生產(chǎn)前期對老醋品質(zhì)形成作用較大，而隨著時間的延長減小甚至消失，而真菌剛好相反，發(fā)酵過程中和貯存前期(1個月和1年)的群落組成變化小于長期貯存的(10年)樣品，隨著貯存時間的延長，真菌多樣性提高，可能對老醋品質(zhì)形成起著重要作用。