張兆云，周啟萍，鞏起福，趙保堂，尚琪，張志華，楊富民

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)

藜麥，又稱印第安麥、奎藜等，屬莧科，種植歷史悠久，是安第斯山脈土著人的傳統(tǒng)食物[1]。藜麥與其他谷物相比，蛋白含量高達(dá)14%～22%[2]。藜麥氨基酸組成平衡，是唯一一種單體植物即可滿足人類基本營(yíng)養(yǎng)需求的食物，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織推薦為最適宜人類的“全營(yíng)養(yǎng)食品”[3]。我國(guó)于20世紀(jì)90年代引入藜麥，近年來(lái)藜麥的種植范圍和產(chǎn)量逐年增長(zhǎng)。藜麥引入后經(jīng)多年培育，成功培育出了國(guó)內(nèi)首個(gè)認(rèn)定的藜麥品種—— “隴藜1號(hào)”[4]。

清蛋白是種子的貯藏蛋白之一。目前，對(duì)于蕓豆、白果、花生、核桃、菜籽和蕎麥[5]等清蛋白的研究報(bào)道較多。訾艷等[6]通過(guò)正交試驗(yàn)，對(duì)白蕓豆清蛋白提取的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)選，并對(duì)其分子組成進(jìn)行了研究。韓海濤等[7]研究發(fā)現(xiàn)，“清香”核桃清蛋白對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基的清除作用與同濃度的VC相當(dāng)。DENG等[8]探究了pH及NaCl濃度對(duì)白果清蛋白功能特性的影響。LI等[9]在對(duì)印加花生種子清蛋白級(jí)分的研究中發(fā)現(xiàn)，印加花生種子清蛋白表現(xiàn)出較好的免疫調(diào)節(jié)活性。趙蓓等[10]研究表明，超聲處理菜籽清蛋白能夠顯著提升其抗氧化性。田旭靜等[11]對(duì)藜麥糠清蛋白的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化并對(duì)其功能特性作了進(jìn)一步研究。目前，有關(guān)“隴藜1號(hào)”藜麥清蛋白的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。藜麥清蛋白作為種子清蛋白具有多種功能特性，有著廣闊的應(yīng)用前景。

本文以“隴藜1號(hào)”為試驗(yàn)對(duì)象，采用Osborne 蛋白質(zhì)分類法[12]在掌握“隴藜1號(hào)”籽實(shí)中清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白含量的前提下，以含量較高的清蛋白為研究對(duì)象，采用超聲波輔助提取法，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)其提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)選，并對(duì)其氨基酸組成、分子質(zhì)量分布以及抗氧化活性(羥自由基及DPPH自由基清除活性)進(jìn)行了測(cè)定，旨在為藜麥清蛋白的提取及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

“隴藜1號(hào)”藜麥(品種認(rèn)定號(hào)：2015001)，甘肅藜美農(nóng)業(yè)科技有限公司。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

考馬斯亮藍(lán)、牛血清白蛋白(bovine albumin,BAS),鄰二氮菲、H2O2、DPPH、十二烷基硫酸鈉( sodium dodecyl sulfate,SDS)、氨基酸混標(biāo)、溴酚藍(lán)、巰基乙醇、Tris-HCl緩沖液等,上海源葉生物科技有限公司。其他試劑均為分析純。

TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；JY99-IIDN 超聲細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；GT10-1離心機(jī)，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；日立LA8080型氨基酸分析儀，日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)那珂事業(yè)所；DYCZ-24KF垂直板電泳儀，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

將藜麥籽粒粉碎后，過(guò)60目篩。然后用石油醚(沸程30～60 ℃)回流脫脂 8 h，過(guò)濾使藜麥粉與石油醚分離，風(fēng)掃除去藜麥粉中殘余的石油醚，將得到的脫脂粉放入密封袋備用。

1.3.2 藜麥蛋白提取流程

藜麥蛋白提取流程如下：

藜麥?！鬯椤^(guò)篩→脫脂→風(fēng)干→加去離子水→調(diào)pH值至7→超聲處理→水浴磁力攪拌1 h→離心→收集上清液→考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定清蛋白濃度→計(jì)算藜麥清蛋白提取率

1.3.3 藜麥蛋白分級(jí)提取

Osborne 蛋白質(zhì)分類及“隴藜1號(hào)”各蛋白質(zhì)組分分析參照江甜等[13]的試驗(yàn)方法，并加以改動(dòng)。調(diào)整離心轉(zhuǎn)速和磁力攪拌時(shí)間，其中將離心轉(zhuǎn)速設(shè)置為5 000×g，浸提時(shí)間設(shè)置為60 min。不同溶劑依次提取得到“隴藜1號(hào)”清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白上清液。采用Bradford法測(cè)定上清液蛋白質(zhì)含量。

1.3.4 清蛋白提取率的測(cè)定

采用考馬斯藍(lán)亮法。以BSA濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)收集到的上清液中的清蛋白濃度進(jìn)行分析，清蛋白提取率計(jì)算如公式(1)所示：

清蛋白提取率/%

(1)

1.3.5 單因素試驗(yàn)

參考張舒等[14]的試驗(yàn)方法。清蛋白提取在超聲功率320 W、料液比1∶30(g∶mL)、超聲時(shí)間20 min、水浴浸提溫度40 ℃的基礎(chǔ)條件下，保持其他因素不變，只改變其中一個(gè)因素，以提取率為指標(biāo)開(kāi)展單因素試驗(yàn)。其中超聲功率設(shè)置為200、260、320、380、500 W，料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，超聲時(shí)間10、20、30、40 min，水浴溫度30、35、40、45、50 ℃。每組平行試驗(yàn)3次，取平均值。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)

對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析后，以A(超聲功率)、B(料液比)、C(超聲時(shí)間)、D(水浴溫度)為自變量，“隴藜1號(hào)”清蛋白提取率作為響應(yīng)值；設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)(共29組)[15]，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素及水平

1.3.7 清蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定

參考劉靜等[16]的方法。將提取的清蛋白溶液分為10份，用磷酸鹽緩沖溶液依次調(diào)pH值至3、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.5、4.7、5.0。靜置待蛋白沉淀，6 500×g離心10 min后收集上清液，于280 nm處測(cè)定吸光值。

1.3.8 清蛋白氨基酸組成及分子質(zhì)量測(cè)定

藜麥清蛋白各氨基酸含量分析依據(jù)GB 5009.124—2016。

清蛋白的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)測(cè)定參照王棐等[17]的方法，略作修改。分離膠及濃縮膠質(zhì)量濃度分別定為120、40 g/L；上樣量10 μL。

1.3.9 清蛋白抗氧化活性的測(cè)定

1.3.9.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參考TAI等[18]的方法并作調(diào)整。取2 mL樣品液，加入2 mL 0.15 mmol/L的DPPH-95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液，混勻、避光反應(yīng)0.5 h后5 000×g離心15 min，于517 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)1。DPPH自由基清除率按公式(2)計(jì)算：

(2)

式中：A2為對(duì)照組吸光度，95%乙醇溶液替代DPPH溶液；A3為空白組吸光度，95%乙醇代替樣品液。

1.3.9.2 羥自由基清除能力測(cè)定

參考劉倩霞等[19]的方法。取1.0 mL樣品液，依次加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液2 mL、1.0 mL 2.25 mmol/L鄰二氮菲-乙醇溶液及1.0 mL 2.25 mmol/L FeSO4溶液；再加入0.03%(體積分?jǐn)?shù))H2O21.0 mL啟動(dòng)反應(yīng)，混勻并在37 ℃水浴1 h，冷卻后于532 nm處測(cè)吸光值A(chǔ)1。羥自由基清除率計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中：A2為對(duì)照組吸光度，去離子水替代樣品液及H2O2溶液；A3為空白組吸光度，去離子水取代樣品液。

1.4 數(shù)據(jù)處理

借助SPSS 25.0及Excel，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及顯著性分析，并制作相關(guān)圖表；通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

如圖1所示，BSA濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度值作為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.643 8x-0.001 5(R2=0.997 7)。該曲線線性關(guān)系良好。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 “隴藜1號(hào)”籽實(shí)主要蛋白含量分析

由圖2可知，經(jīng)Osborne分級(jí)法提取后，“隴藜1號(hào)”籽實(shí)蛋白主要為清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白4種。其主要蛋白組分是水溶性的清蛋白和鹽溶性的球蛋白，分別占到蛋白總量的34.96%、23.86%。而醇溶蛋白含量最少，占比為3.49%。此外，藜麥蛋白還含有9.22%的谷蛋白。

圖2 “隴藜1號(hào)”籽實(shí)主要蛋白含量

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 超聲功率對(duì)清蛋白提取率的影響

由圖3可知，隨著超聲功率的升高，清蛋白提取率顯著增高(P<0.05)，在超聲功率380 W時(shí)達(dá)到最大值；繼續(xù)增加超聲功率提取率反而下降。出現(xiàn)下降趨勢(shì)的原因可能是超聲功率過(guò)大破壞了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)部分分解及變性，使得清蛋白溶出量下降，導(dǎo)致提取率降低。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，確定380 W為最優(yōu)提取超聲功率。

圖3 超聲功率對(duì)清蛋白提取率的影響

2.3.2 水浴溫度對(duì)清蛋白提取率的影響

由圖4可知，隨著水浴溫度的持續(xù)增加，清蛋白提取率先上升后下降。當(dāng)提取溫度為30～40 ℃時(shí)，清蛋白提取率顯著增高(P<0.05)。40 ℃時(shí)，提取率達(dá)到峰值。提取溫度在40～50 ℃時(shí)，清蛋白提取率顯著降低(P<0.05)。這是因?yàn)樘崛囟葹?0～40 ℃，溫度升高促進(jìn)了清蛋白水和能力的增高，致使更多的蛋白質(zhì)分子與水結(jié)合，提取率隨之增大；而當(dāng)溫度>40 ℃時(shí)，溫度的進(jìn)一步升高將使部分蛋白分子變性、聚集。因此，提取溫度應(yīng)以40 ℃為宜。

圖4 水浴溫度對(duì)清蛋白提取率的影響

2.3.3 料液比對(duì)清蛋白提取率的影響

由圖5可知，當(dāng)料液比在1∶15～1∶30(g∶mL)時(shí)，隨料液比增大，“隴藜1號(hào)”清蛋白提取率顯著升高(P<0.05)；并在料液比為1∶30時(shí)達(dá)到最高值，為58.41 mg/g,隨著料液比繼續(xù)增大，清蛋白提取率顯著下降(P<0.05)。這可能是隨提取溶劑的增加，清蛋白充分浸出，更多的蛋白分子與水結(jié)合；當(dāng)達(dá)到最大值后，料液比增加，即溶劑增多，蛋白質(zhì)過(guò)度膨脹，與水結(jié)合力降低的緣故。因此，宜選擇1∶30為最適料液比。

圖5 料液比對(duì)清蛋白提取率的影響

2.3.4 超聲時(shí)間對(duì)清蛋白提取率的影響

由圖6可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，藜麥清蛋白的提取率先升高后降低，在30 min時(shí)清蛋白提取率達(dá)到最高值，繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間清蛋白提取率出現(xiàn)下降。原因可能是空化作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)遭到破壞，蛋白分子疏水基團(tuán)更多的暴露，在溶劑中的溶解度降低，得率也就變低。依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選取超聲時(shí)間30 min進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖6 超聲時(shí)間對(duì)清蛋白提取率的影響

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

以超聲功率(A)、料液比(B)、超聲時(shí)間(C)、水浴溫度(D)為自變量，清蛋白提取率作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)并實(shí)施4因素3水平試驗(yàn)，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

2.4.2 回歸方程及方差分析結(jié)果

根據(jù)Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸方程分析，通過(guò)上述分析，得出回歸模型， 模型中Y表示清蛋白提取率、A表示超聲功率、B表示料液比、C表示超聲時(shí)間、D表示水浴溫度，回歸方程如下：

Y=62.86-1.27A-2.10B-1.43C-0.74D+5.00AB-2.45AC-4.0AD-3.84BC+5.48BD-2.10CD-9.10A2-6.41B2-1.67C2-6.12D2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 回歸模型方差分析表

2.4.3 各因素相互關(guān)系的響應(yīng)面圖分析

響應(yīng)面圖中各因素對(duì)清蛋白提取率的影響大小，主要通過(guò)曲面的弧度體現(xiàn)。曲面圖傾斜程度越高，影響越顯著，反之則越不顯著。由圖7可知，兩變量交互作用BD的曲面最陡，交互作用AB的曲面陡峭程度次之，交互作用BC的曲面陡峭程度最小。即料液比和水浴溫度、超聲功率和料液比、料液比和超聲時(shí)間每2個(gè)因素間均具有顯著交互作用。AB、BC、BD每2個(gè)因素的交互作用對(duì)藜麥清蛋白提取率的影響程度先高后低，響應(yīng)值呈現(xiàn)出拋物線形狀，故各因素相互關(guān)系對(duì)清蛋白提取率的影響存在著極大值，其與表2中的方差分析結(jié)果一致。

圖7 各因素交互作用對(duì)清蛋白提取率影響的響應(yīng)面圖

2.4.4 最佳提取工藝條件的確定

運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)模型進(jìn)行分析，得到響應(yīng)值(提取率)最大，即最優(yōu)水平，“隴藜 1 號(hào)”籽實(shí)清蛋白提取的最佳工藝參數(shù)為：超聲功率 354 W，料液比 1∶25.5(g∶mL)，超聲時(shí)間 40 min，水浴溫度 36.9 ℃。在此條件下，經(jīng)驗(yàn)證(平行3次試驗(yàn))，藜麥籽實(shí)清蛋白提取率為(63.25±0.87) mg/g；與理論預(yù)測(cè)值 64.11 mg/g基本一致，因而該試驗(yàn)?zāi)Ｐ湍軌蜉^好地預(yù)測(cè)“隴藜 1 號(hào)”籽實(shí)清蛋白的實(shí)際提取效果。

2.5 等電點(diǎn)測(cè)定結(jié)果

由圖8可知，在pH值為3.0～3.4，隨著pH值增大吸光度降低，當(dāng)pH值為3.4，吸光度最低，之后隨著pH值增大吸光度升高。吸光度越低，表明蛋白沉淀越多，故“隴藜1號(hào)”清蛋白的等電點(diǎn)為3.4。

圖8 藜麥清蛋白等電點(diǎn)

2.6 清蛋白氨基酸組成

由表4可知，藜麥清蛋白含有17種氨基酸。因測(cè)定時(shí)采用酸水解法，色氨酸未檢出。除甲硫氨酸外，其他人體必需氨基酸組成均衡。藜麥清蛋白的必需氨基酸與非必需氨基酸比值為53%，與FAO提出的參考值60%較接近。藜麥清蛋白谷氨酸、天冬氨酸及精氨酸含量相對(duì)較高，而半胱氨酸為其第一限制性氨基酸，含量?jī)H為(0.28±0.01)%。賴氨酸和谷氨酸是TGase(轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶)作用的必需氨基酸，，藜麥清蛋白中賴氨酸和谷氨酸占16.85%。因此，藜麥清蛋白可以作為TGase的反應(yīng)底物[20]。

表4 “隴藜1號(hào)”清蛋白氨基酸含量

2.7 清蛋白分子質(zhì)量測(cè)定

根據(jù)Marker的分子質(zhì)量與其相對(duì)遷移率，經(jīng)過(guò)擬合得到分子質(zhì)量對(duì)數(shù)與相對(duì)遷移率的線性關(guān)系式：y=-1.450 2x+2.304 2；R2=0.989 0。將試驗(yàn)所得“隴藜1號(hào)”清蛋白的相對(duì)遷移率帶入公式，即得清蛋白亞基分子質(zhì)量對(duì)數(shù)，進(jìn)而求出其各亞基的分子質(zhì)量。

圖9 “隴藜1號(hào)”清蛋白的SDS-PAGE電泳圖

“隴藜1號(hào)”清蛋白由多亞基構(gòu)成，各亞基分子質(zhì)量如表5所示。其大致有4條譜帶，主要分布在25 kDa～35 kDa，該部分條帶分布較寬，顏色較深。BRINEGAR等[21]的研究報(bào)道表明，經(jīng)SDS-PAGE分析，藜麥2S清蛋白的分子質(zhì)量為8 kDa～9 kDa，本研究發(fā)現(xiàn)“隴藜1號(hào)”清蛋白存在少部分<15 kDa的亞基，該亞基可能來(lái)自于藜麥的2S清蛋白。

表5 “隴藜1號(hào)”清蛋白分子質(zhì)量

2.8 清蛋白抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.8.1 DPPH自由基清除率

由圖9可知，隨濃度增大藜麥清蛋白對(duì)DPPH自由基的清除作用增強(qiáng)，但與VC相比均低于同濃度的VC對(duì)照組。當(dāng)清蛋白質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率為67.15%。

圖10 藜麥清蛋白和VC的DPPH自由基清除作用

2.8.2 羥自由基清除率

由圖11可知，藜麥清蛋白羥自由基清除率隨蛋白濃度增大而升高。低濃度下，清除作用上升較慢；隨濃度進(jìn)一步升高，表現(xiàn)出更好的清除效果。在蛋白質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時(shí)，清除率為46.34%，是相同濃度VC清除率的51.46%。

圖11 藜麥清蛋白和VC的羥自由基清除作用

3 討論

藜麥蛋白質(zhì)的提取方法主要有酶法、堿溶酸沉法和超聲波提取法等[22]。超聲波提取法具有安全、節(jié)能、簡(jiǎn)單、高效等優(yōu)點(diǎn)。超聲波能夠產(chǎn)生強(qiáng)烈的機(jī)械振動(dòng)和空化效應(yīng)，其能量可破壞植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)容物溶出，增加有效成分的提取率，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)提取[23]。李茉等[24]采用超聲輔助提取辣椒籽蛋白，超聲輔助與傳統(tǒng)提取相比蛋白提取率增加0.81 g/100g。王緲等[25]利用超聲波提取玉米醇溶蛋白，使得醇溶蛋白的提取率達(dá)到了93.6%。本研究采用超聲輔助提取法浸提“隴藜1號(hào)”清蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，超聲處理可以使藜麥清蛋白的提取率增至40.1%，表明超聲處理可以有效提高藜麥清蛋白提取率，這與李茉、王緲等人的研究報(bào)道基本一致。

植物清蛋白及其酶解物具有較高的抗氧化活性已被大量的研究所證實(shí)。范三紅等[26]對(duì)通過(guò)Osborne分級(jí)法提取的羊肚菌清蛋白抗氧化活性研究表明，羊肚菌清蛋白抗氧化活性雖均低于同濃度的VC對(duì)照組，但仍然對(duì)羥自由基以及DPPH自由基具有良好的清除效果。植物清蛋白屬于天然活性蛋白，較化學(xué)合成物安全性更高,本研究清蛋白抗氧化活性低于同濃度的VC對(duì)照組，與范三紅所報(bào)道的基本一致。盧紅妍等[27]研究發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶酶解松仁清蛋白可得到具有高抗氧化活性的清蛋白肽；陳思遠(yuǎn)等[28]采用胰蛋白酶和堿性蛋白酶分步酶解麥胚清蛋白，制備得到了單一高活性抗氧化肽，未來(lái)對(duì)于藜麥清蛋白肽的研究將有著廣闊的前景。

4 結(jié)論

“隴藜1號(hào)”籽實(shí)主要蛋白依次為清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白，其含量分別為34.96%、23.86%、9.22%、3.49%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。超聲波輔助提取可有效增加提取率，在超聲功率 354 W、料液比 1∶25.5(g∶mL)、超聲時(shí)間 40 min、水浴溫度 36.9 ℃的條件下，藜麥清蛋白的提取率可達(dá)到64.11 mg/g?！半]藜1號(hào)”籽實(shí)清蛋白含有17種氨基酸，其中谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸及精氨酸含量相對(duì)較高，而半胱氨酸為其第一限制性氨基酸；分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果表明，其亞基分布主要是在15 kDa～25 kDa以及25 kDa～35 kDa。當(dāng)“隴藜1號(hào)”籽實(shí)清蛋白質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時(shí)，其對(duì)羥自由基及DPPH自由基清除率分別為46.34%和67.15%。