魏晉梅，劉彩云,2*，方彥，堅乃丹

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅省干旱生境作物學(xué)重點實驗室，甘肅 蘭州， 730070)2(甘肅省科學(xué)院生物研究所，甘肅 蘭州， 730000)

沙棘是一種重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)作物，胡頹子科沙棘屬，生命力頑強，可生長于極寒、極旱的環(huán)境中，其果實呈紅色、橙色或黃色，富含酚類、黃酮類、有機酸、多糖等生物活性物質(zhì)和人體所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)，如維生素、不飽和脂肪酸、氨基酸、微量元素等[1-4]，具有抗氧化、延緩衰老、抑制腫瘤細(xì)胞生長、止咳祛痰、抗輻射、活血散瘀、防治冠狀動脈粥樣硬化等作用[5-8]。沙棘果實、葉子提取物和籽油廣泛應(yīng)用于食品、保健、醫(yī)藥和化妝品行業(yè)[9]。沙棘油有“液體黃金”之美譽，被我國批準(zhǔn)臨床使用，并于1977年正式列入藥典，俄羅斯宇航員用沙棘油防止有害輻射[10]。沙棘油含有多種人體需要的微量元素，如Na、Ca、K、Mg、Fe、Zn等，無機成分對于沙棘油的營養(yǎng)性、安全性和穩(wěn)定性均起著極其重要的作用[11]，其進(jìn)入沙棘油的途徑主要是果實對自然環(huán)境無機元素的吸收與富集、加工過程中金屬的接觸及污染等[12]。

目前，文獻(xiàn)報道對沙棘的研究多集中于其葉子提取物[13-14]。油脂是生活中不可缺少的食物之一，沙棘油中脂肪酸與微量元素的測定已有文獻(xiàn)報道，但對脂肪酸含量的測定僅限于百分比含量[15-17]，目前，尚未見文獻(xiàn)報道其絕對含量。本文基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)測定沙棘果油中脂肪酸組成，應(yīng)用內(nèi)標(biāo)方法計算各成分的含量；采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(inductively coupled plasma atomic emission spectrometry，ICP-AES)測定微量元素，旨在建立沙棘果油脂肪酸和微量元素的準(zhǔn)確測定方法，為沙棘的進(jìn)一步開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

沙棘果購自寧夏回族自治區(qū)吳中市，經(jīng)亞臨界流體萃取而得沙棘果油。

1.2 儀器與試劑

CBE-20L亞臨界雙溶劑萃取實驗室成套設(shè)備，河南省亞臨界生物技術(shù)有限公司；Agilent 7890B-7000GC/TQ GC-MS，美國Agilent公司；IRIS IntrepidⅡ XSP電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀，泵管類型為Tygon-Orange，美國Thermo公司；ETHOS UP微波消解萃取系統(tǒng)，VB24 UP電子控溫趕酸器，美國Lab Tech公司；RE-52C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州市亞榮儀器有限公司；超純水處理系統(tǒng)，美國Millipore公司；氬氣、氦氣(純度：99.999%)；37 種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)對照品與十一烷酸(99.98%)，購自美國 SUPELCO 公司；K、Na、Ca、Mg、Cu、Zn、Fe和Mn標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度均為100 μg/mL)，中國計量科學(xué)研究院；正己烷(色譜純)、HNO3、高氯酸、HCl(優(yōu)級純),德國Merck公司；其他試劑均為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 沙棘油制備

亞臨界流體萃取沙棘果油工藝：

沙棘干燥→粉碎→過篩→裝料→抽真空→加入溶劑→萃取→脫溶→回收樣品

萃取工藝參數(shù)：提取溶劑為正丁烷，料液比為1∶3，萃取溫度45 ℃，萃取時間30 min，萃取次數(shù)3次。參照文獻(xiàn)方法[18-19]計算亞臨界流體萃取沙棘果油的萃取率,如公式(1)所示：

(1)

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取2.5 g十一烷酸(精確到0.01 g)，甲醇溶解，定容至500 mL容量瓶中，制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL內(nèi)標(biāo)儲備液。取2.5 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，甲醇稀釋，定容至100 mL容量瓶中，制成質(zhì)量濃度為0.125 mg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

分別取K、Na、Ca、Mg、Cu、Zn、Fe和Mn單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入空白樣品溶液，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，K的質(zhì)量濃度為0.25、0.5、2、10、20 μg/mL，Na為1、2、5、10、20 μg/mL，Cu為0.005、0.1、5、10、50 μg/mL，Zn為0.5、0.1、2、10、50 μg/mL，Ca為0.5、1、5、10、50 μg/mL、Mg為0.25、1、5、10、50 μg/mL，F(xiàn)e為0.1、0.5、2、5、10 μg/mL、Mn為0.005、0.05、1、5、10 μg/mL。

1.3.3 脂肪酸甲酯制備

參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.168—2016方法[20]，并稍作修改。稱取試樣1.0 g(精確到0.01 g)于50 mL燒瓶中，加入5 mL內(nèi)標(biāo)工作液、8 mL 2% 氫氧化鈉-甲醇溶液與5 mL 14% 三氟化硼-甲醇溶液，(80±1) ℃水浴回流60 min，取下燒瓶，迅速冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移樣品至離心管，用3 mL正己烷洗滌燒瓶2次，合并溶液于離心管中，旋渦振蕩，充分混勻后5 000 r/min離心5 min，取上清液，用0.22 μm有機相過濾膜過濾，進(jìn)GC-MS測定。

1.3.4 微量元素提取

參照袁建民等[21]方法，并稍做修改。準(zhǔn)確稱取0.3 g(精確到0.01 g)沙棘果油于聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，加入8 mL優(yōu)級純HNO3，放置5～10 min，使樣品與試劑充分混合。微波消解程序：初始溫度室溫，0～15 min升至140 ℃，保持5 min，20～35 min升至190 ℃，保持20 min，55～90 min降至室溫，趕酸后，加入2%(體積分?jǐn)?shù))優(yōu)級純HNO3定容至25 mL，進(jìn)ICP-AES測定。

1.3.5 空白溶液制備

不加試樣，按照1.3.3步驟獲得空白樣品溶液。

1.3.6 儀器工作條件

GC-MS工作條件參照魏晉梅等[22]方法；ICP-AES工作條件 RF發(fā)生器功率1 150 W；沖洗泵速120 r/min，2.22 mL/min；分析泵速120 r/min，2.22 mL/min，泵緩沖時間為5 s；輔助器流量0.5 L/min，霧化器壓力28.0 psi。

1.3.7 定性與定量方法

脂肪酸甲酯經(jīng)Agilent Masshunter數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)檢索，并與標(biāo)準(zhǔn)品比對進(jìn)行鑒定，內(nèi)標(biāo)法定量。微量元素采用外標(biāo)法定量。

脂肪酸含量計算如公式(2)所示：

(2)

式中:Xi為試樣中脂肪酸i的含量(mg/g)；CSi、ASi、C11和A11分別為37種脂肪酸甲酯混和標(biāo)準(zhǔn)中脂肪酸甲酯i的質(zhì)量濃度(mg/L)、峰面積與十一烷酸甲酯濃度(mg/L)、峰面積；Ai、AC11、CC11和VC11分別為試樣中脂肪酸甲酯i的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積、質(zhì)量濃度(mg/mL)、體積(mL)；m為試樣質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘果油脂肪酸組成與含量

沙棘果油GC-MS色譜圖見圖1，檢測到的脂肪酸種類和含量如表1所示，19種脂肪酸中飽和脂肪酸(saturated fatty acids，SFA)含量為24.42%，其中C16∶0含量較高(39.71 mg/g)，占92.03%；單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids，MUFA)含量為47.26%，含量較高的為C16∶1和C18∶1，分別為44.29和48.15 mg/g，共占99.75%；多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)含量為28.31%，C18∶2、C18∶3含量較高，均為35.25 mg/g，不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acids，USFA)含量是SFA的 3.1倍。結(jié)果表明，沙棘果油中含有豐富的棕櫚油酸、油酸、亞油酸和亞麻酸，此結(jié)果與文獻(xiàn)報道結(jié)果相近。岳虹等[16]在沙棘油中檢測到16種脂肪酸，USFA含量是SFA的4倍(分別為80.09%和19.91%)；張素敏等[23]檢測到沙棘油中有13種脂肪酸，USFA/SFA=2.7(分別69.37%為和26.01%)，青海沙棘果油中USFA/SFA=2.1(分別為66.92%和32.54%)[17]。由表1可知，沙棘果油中n-6與n-3不飽和脂肪酸比率接近1，此結(jié)果與文獻(xiàn)[6]報道結(jié)果相近。

圖1 沙棘果油脂肪酸甲酯GC-MS總離子流圖

表1 沙棘果油中脂肪酸種類和含量

2.2 溶解酸與用量的選擇

處理樣品時，酸的加入是對ICP-AES測定產(chǎn)生化學(xué)干擾的主要因素。不同的酸，由于比重、黏度等物理性質(zhì)各不相同，它們進(jìn)入ICP炬焰后，蒸發(fā)速率不一致，從而在分析過程中帶來化學(xué)干擾。根據(jù)酸效應(yīng)的干擾順序HCl

表2 酸對樣品處理的影響

2.3 分析譜線的選擇

測定中發(fā)現(xiàn)各元素都有不同的光譜干擾，根據(jù)譜線與級次選取的原則(分析微量元素時，要采用靈敏線)，本實驗選擇的各元素分析線為：K 766.491 nm，Na 588.995 nm，Cu 324.754 nm，Zn 213.856 nm，Ca 393.366 nm，Mg 279.553 nm，F(xiàn)e 259.940 nm，Mn 257.610 nm。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

基體匹配是減少、消除基體干擾的有效方法，本實驗系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用空白樣品溶液稀釋配制，并在選定的儀器條件下測定，根據(jù)濃度與響應(yīng)值的關(guān)系，儀器自動繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)(表3)，8種元素的相關(guān)系數(shù)r2為0.999 3～1.000。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，求出實際樣品含量值，將得到更準(zhǔn)確的測定結(jié)果。

表3 8種元素工作曲線

2.5 加標(biāo)回收與精密度實驗

在已知各元素含量的沙棘油中添加高、中、低3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1 mL，每個濃度添加6個樣品，按1.4.2方法進(jìn)行回收率實驗，結(jié)果見表4。各元素的平均回收率為85.0%～94.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為3.28%～9.23%(RSD<10%)，因此本實驗方法可行，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表4 方法回收率與精密度實驗

2.6 檢出限

參照呂小園等方法[27]，并稍作修改。按分析方法進(jìn)行15次空白實驗，以10倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差除以標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率，計算各元素的檢出限。K、Na、Ca、Mg、Cu、Zn、Fe和Mn的檢出限分別為0.006、0.003、0.001 5、0.001 2、0.001 2、0.001 2、0.002 5和0.005 μg/mL。按照稱樣0.3 g定容至25 mL，本實驗方法樣品中K、Na、Ca、Mg、Cu、Zn、Fe和Mn的檢出限分別為0.5、0.25、0.125、0.1、0.1、0.1、0.2和0.4 μg/g。

2.7 微量元素測定

運用建立的分析方法測定沙棘油中8種微量元素的含量，重復(fù)3次，求平均值，得到樣品中各元素的濃度，計算含量，結(jié)果見表5。Na、Ca、K、Mg、Fe、Zn含量較高，與張榮[28]結(jié)果相近。本實驗研究結(jié)果與文獻(xiàn)報道結(jié)果有一定差異，董亞蕾等[11]報道沙棘果汁中含量較高的微量元素依次為 K、Na、Ca、Mg，F(xiàn)e元素含量范圍是1.8～2.8 mg/L，TSERING等[29]測定了跨喜馬拉雅山的萊赫山谷的沙棘果實中微量元素，K、Ca、Na含量較高，分別為647.2、176.6、414.2 mg/L，F(xiàn)e和Mg分別為30.9、22.5 mg/L，Zn、Cu、Mn含量較低，分別為1.4、0.7和1.06 mg/L，原因可能是沙棘品種和生長地域環(huán)境條件影響了植物對微量元素的吸收與富集。HU等[30]認(rèn)為Ca在沙棘中的含量為葉>籽>果，說明植物不同部位對微量元素的吸收與富集能力不同。

表5 沙棘油中8中微量元素含量

3 結(jié)論

采用內(nèi)標(biāo)方法定量了沙棘果油中19種脂肪酸。C16∶0、C16∶1、C18∶1、C18∶2、C18∶3含量較高，分別為39.71、44.29、48.15、35.25和35.25 mg/g，USFA含量是SFA的3.1倍。沙棘果油中含有豐富的油酸、亞油酸和亞麻酸。K、Na、Ca、Mg、Cu、Zn、Fe和Mn的檢出限分別為0.5、0.25、0.125、0.1、0.1、0.1、0.2和0.4 μg/g，各元素的平均回收率為85.0%～94.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.28%～9.23%(RSD<10%)。沙棘果油中含有豐富的Na(149.28 μg/g)、Ca(65.29 μg/g)、K(41.08 μg/g)、Mg(21.27 μg/g)、Fe(14.43 μg/g)、Zn(4.71 μg/g)等微量元素。沙棘果油中含有豐富的不飽和脂肪酸與人體所需微量元素，具有很高的營養(yǎng)價值，該研究結(jié)果為沙棘的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。