徐文文，梁玉林，王云霞，劉秀*，尹建軍，周廣軍，宋全厚，丁夢(mèng)璇，周鵬飛

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015)2(內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010110)3(山東稻香村食品工業(yè)有限公司，山東 菏澤，274100)

乳制品在食品行業(yè)中占據(jù)不可忽視的地位。據(jù)中國(guó)奶業(yè)質(zhì)量報(bào)告數(shù)據(jù)顯示，2011—2016年，我國(guó)每年以87.1萬(wàn)t的增長(zhǎng)趨勢(shì)，完成全國(guó)乳制品消耗量從2 480.5到3 204.7萬(wàn)t的飛越[1]；2018—2019年乳制品行業(yè)趨于穩(wěn)定，但全國(guó)每年總消耗量也均為2 400萬(wàn)t以上，巨大的消耗在推動(dòng)乳業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的同時(shí)，對(duì)乳制品質(zhì)量安全提出考驗(yàn)。根據(jù)國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)，沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌被列為乳粉中重點(diǎn)關(guān)注的食源性致病菌[2-3]。沙門(mén)氏菌屬腸道細(xì)菌科，其通過(guò)多種毒力因子作用于人體引起腸道炎、敗血癥，在我國(guó)已報(bào)道的細(xì)菌性食物中毒事件中沙門(mén)氏菌占比70%以上[4]，在全球沙門(mén)氏菌也穩(wěn)居前列。金黃色葡萄球菌是世界范圍內(nèi)另一大食源性致病菌，主要通過(guò)腸毒素污染食物引起食物中毒，2000年，日本雪印乳品公司的牛奶中毒事件就是由金黃色葡萄球菌感染造成，先后涉及8個(gè)縣，14 780人中毒[5]。沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌引起的乳品污染危害不容小覷。

目前沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌檢測(cè)多采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction， PCR)方法[6-7]。前者通過(guò)菌落形態(tài)特征及其生理生化特性進(jìn)行菌種鑒定，工作繁瑣且耗時(shí)較長(zhǎng)，檢測(cè)結(jié)果往往滯后于生產(chǎn)，無(wú)法及時(shí)為企業(yè)提供風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警；后者雖有效提高了檢測(cè)效率，但對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和儀器精密度要求高，難以在車(chē)間得到有效開(kāi)展。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一種依托核酸進(jìn)行目標(biāo)物體識(shí)別的一種新技術(shù)，該技術(shù)通過(guò)4條或6條引物，在等溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增。與其他方法相比，LAMP技術(shù)極大減少了對(duì)儀器精密度的要求，檢測(cè)耗時(shí)短且靈敏度高，被廣泛應(yīng)用于各類(lèi)微生物檢測(cè)[8-13]。但現(xiàn)有的LAMP方法大多只能針對(duì)一種菌種進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)樣品中同時(shí)存在多種微生物時(shí)只能分批進(jìn)行定性檢測(cè)，工作量較大。本研究分別利用沙門(mén)氏菌invA侵襲蛋白A基因[14-16]和金黃色葡萄球菌nuc耐熱核酸酶基因[17-18]設(shè)計(jì)合成引物，優(yōu)化引物濃度并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析，建立二重LAMP檢測(cè)體系，旨在為乳制品尤其是乳粉中的沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的篩查鑒定提供一種快速、有效的檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1 菌株

實(shí)驗(yàn)共涉及15株菌株，包括3株沙門(mén)氏菌、3株金黃色葡萄球菌及另外9株非目標(biāo)常見(jiàn)食源性致病菌，具體菌株信息見(jiàn)表1。

表1 菌株信息

1.2 儀器與設(shè)備

G49194G微量移液器、5804R、5424型離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；SX-700高壓滅菌鍋，日本Tomy Digital Biology公司；CPA323S精密天平，德國(guó)Sartorius公司；VORTEX-5渦旋儀，Kylin-bell公司；AC2-4S1生物安全柜，新加坡Esco公司；Biodrop超微量核酸蛋白分析儀，英國(guó)柏點(diǎn)公司；Genie Ⅱ溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)儀，英國(guó)OptiGene Limited公司。

1.3 試劑

腦心浸液肉湯(brain heart infusion broth, BHI)，平板計(jì)數(shù)瓊脂(plate count agar, PCA)，北京路橋技術(shù)股份有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒、無(wú)菌雙蒸水，天根生化科技有限公司；Isothermal Master Mix(IMM)，英國(guó)OptiGene Limited公司；LAMP擴(kuò)增引物，英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌種培養(yǎng)及DNA模板制備

將表1中沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌等15株細(xì)菌分別接種于10 mL腦心浸液肉湯中，36 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12小時(shí)，離心收集菌體。以滅菌生理鹽水對(duì)所得菌體進(jìn)行重懸，充分混勻制成菌懸液，并按照細(xì)菌DNA提取試劑盒操作步驟提取基因組DNA，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 引物設(shè)計(jì)與合成

以沙門(mén)氏菌invA基因，金黃色葡萄球菌nuc基因作為引物設(shè)計(jì)靶基因，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer(primerexplorer.jb/lampv5e/index.html)進(jìn)行LAMP引物設(shè)計(jì)。具體引物信息如表2，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

表2 沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌LAMP引物序列

1.4.3 單重LAMP體系的建立與二重LAMP體系的優(yōu)化

12.5 μL沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌單重LAMP反應(yīng)體系包括7.5 μL IMM、3.5 μL引物(2.5 pmol F3和B3，20 pmol FIP和BIP，10 pmol LF和LB)及1.5 μL核酸模板，擴(kuò)增溫度為65 ℃，擴(kuò)增時(shí)間為30 min。

為了保證沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌擴(kuò)增效率一致，對(duì)影響較大的引物濃度進(jìn)行優(yōu)化。分別在各自原混合引物濃度(5.2 μmol/L)的基礎(chǔ)上，調(diào)整每種引物混合液所占二重引物混合液的體積份額改變引物濃度，引物濃度比設(shè)定為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4。

1.4.4 特異性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

應(yīng)用6株目標(biāo)菌株和9株其他常見(jiàn)食源性致病菌菌株核酸，在Genie Ⅱ等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)儀上分別測(cè)試單重、二重LAMP反應(yīng)體系，并以熒光積累擴(kuò)增曲線(xiàn)觀(guān)察擴(kuò)增結(jié)果，驗(yàn)證檢測(cè)方法特異性。

1.4.5 熔解曲線(xiàn)的分析

分別以單一沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌核酸為模板，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增檢測(cè)并對(duì)所得產(chǎn)物的熔解曲線(xiàn)進(jìn)行分析，確定沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線(xiàn)特征峰。同時(shí)，觀(guān)察混合菌株核酸同時(shí)檢測(cè)時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線(xiàn)的退火溫度與單一菌株擴(kuò)增熔解曲線(xiàn)的退火溫度是否一致。

1.4.6 單一菌株檢測(cè)靈敏度

以沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌核酸為模板，進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)购怂峤K質(zhì)量濃度為100fg/μL～100ng/μL。采用LAMP方法分別對(duì)2種食源性致病菌各濃度核酸進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)梯度重復(fù)10次實(shí)驗(yàn)，把10次全部檢出的最低梯度定為最低檢測(cè)靈敏度。實(shí)驗(yàn)以無(wú)菌雙蒸水作為陰性對(duì)照。

1.4.7 混合菌間擴(kuò)增干擾測(cè)試

固定沙門(mén)氏菌核酸質(zhì)量濃度為100 pg/μL，金黃色葡萄球菌核酸分別與之按照1∶1、1∶50、1∶100、1∶150濃度比混合形成混合核酸模板；再將金黃色葡萄球菌核酸質(zhì)量濃度固定為100 pg/μL，沙門(mén)氏菌核酸分別與之按照1∶1、1∶50、1∶100、1∶150混合形成混合核酸模板，分別進(jìn)行10次二重LAMP擴(kuò)增檢測(cè)，并對(duì)產(chǎn)生的熔解曲線(xiàn)進(jìn)行分析，以此測(cè)試混合菌濃度未知情況下，高濃度核酸對(duì)低濃度核酸擴(kuò)增干擾程度。

1.4.8 脫脂乳粉樣品檢測(cè)及與國(guó)標(biāo)法的比較

將沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌分別接種于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，36 ℃培養(yǎng)12 h后，以脫脂乳粉作為基質(zhì)制備人工污染樣品，每個(gè)樣品制作10份，其中3份作為陰性對(duì)照，7份加入100CFU/mL的待檢測(cè)菌液(實(shí)際菌量通過(guò)培養(yǎng)法進(jìn)行計(jì)數(shù)獲得)作為污染樣品。為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)前經(jīng)國(guó)標(biāo)方法驗(yàn)證所用脫脂乳粉中不含任何病原菌。

將每份樣品分別采用2種方法進(jìn)行檢測(cè)，其中國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4—2016、GB 4789.10—2016作為L(zhǎng)AMP方法的基準(zhǔn)；LAMP法按照國(guó)標(biāo)法進(jìn)行預(yù)增菌后，取1 mL進(jìn)行DNA提取和擴(kuò)增檢測(cè)，探討該方法的實(shí)用性及可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 二重LAMP體系引物濃度配比

不同濃度配比的二重LAMP體系對(duì)沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。由結(jié)果可知沙門(mén)氏菌∶金黃色葡萄球菌引物濃度比為 3∶1時(shí)，同濃度核酸擴(kuò)增效率相對(duì)一致，均可在7.5 min產(chǎn)生熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)，因此確定沙門(mén)氏菌∶金黃色葡萄球菌最佳引物濃度比為3∶1。

a-沙門(mén)氏菌∶金黃色葡萄球菌1∶1;b-沙門(mén)氏菌∶金黃色葡萄球菌2∶1;c-沙門(mén)氏菌∶金黃色葡萄球菌3∶1;d-沙門(mén)氏菌∶金黃色葡萄球菌4∶1

2.2 特異性驗(yàn)證

對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行特異性驗(yàn)證，結(jié)果如表3所示。單重LAMP體系及二重LAMP體系均只特異性擴(kuò)增沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌，而對(duì)其他非目標(biāo)菌株無(wú)擴(kuò)增，表明建立的方法對(duì)沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA具有良好特異性。

2.3 LAMP擴(kuò)增熔解曲線(xiàn)分析

對(duì)單重沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌擴(kuò)增熔解曲線(xiàn)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。單一沙門(mén)氏菌的熔解曲線(xiàn)在85～90 ℃出現(xiàn)，特征峰在88 ℃產(chǎn)生；單一金黃色葡萄球菌的熔解曲線(xiàn)在80～84 ℃出現(xiàn)，特征峰在83 ℃產(chǎn)生。對(duì)等濃度混合基因組核酸進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增產(chǎn)物分別在85～90 ℃和80～84 ℃各有一個(gè)熔解曲線(xiàn)特征峰，與單重熔解曲線(xiàn)特征峰退火溫度范圍一致，表明建立的二重LAMP擴(kuò)增方法可實(shí)現(xiàn)沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌同時(shí)檢測(cè)。此外，根據(jù)不同特征峰退火溫度，也可直接判斷菌株信息，完成菌株定性區(qū)分鑒定。

2.4 單一菌檢測(cè)靈敏度

分別對(duì)不同濃度梯度沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌核酸進(jìn)行LAMP法檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。陰性對(duì)照及核酸質(zhì)量濃度為100fg/μL時(shí)，沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌樣品均無(wú)擴(kuò)增曲線(xiàn)，≥101fg/μL時(shí)有擴(kuò)增曲線(xiàn)。對(duì)產(chǎn)生擴(kuò)增曲線(xiàn)的核酸濃度進(jìn)行10次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，把10次全部檢出的最低梯度定為最低檢測(cè)靈敏度。結(jié)果表明，當(dāng)核酸質(zhì)量濃度為101fg/μL時(shí)，10次LAMP重復(fù)試驗(yàn)有2、3次未檢出；核酸質(zhì)量濃度≥102fg/μL時(shí)，10次重復(fù)試驗(yàn)全部檢出，因此規(guī)定本實(shí)驗(yàn)建立的二重LAMP檢測(cè)方法對(duì)沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌最低穩(wěn)定檢測(cè)靈敏度為102fg/μL。

表3 LAMP特異性熒光曲線(xiàn)擴(kuò)增結(jié)果

2.5 混合菌間擴(kuò)增干擾測(cè)試

對(duì)不同濃度配比的沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌混合基因組核酸進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖4。當(dāng)沙門(mén)氏菌與金黃色葡萄球菌核酸濃度比為1∶1時(shí)，沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌在85～90 ℃和80～84 ℃均有明顯的熔解曲線(xiàn)，隨著沙門(mén)氏菌核酸體積比減少，沙門(mén)氏菌特征峰熒光值漸漸降低，當(dāng)濃度比為1∶150時(shí)，85～90 ℃已不能觀(guān)察到對(duì)應(yīng)沙門(mén)氏菌的熔解曲線(xiàn)，反之亦然。證明進(jìn)行混合菌檢測(cè)時(shí)，2種菌液核酸濃度比不能超過(guò)100倍，一旦超過(guò)100倍時(shí)，高濃度核酸熔解曲線(xiàn)會(huì)掩蓋低濃度核酸熔解曲線(xiàn)的出現(xiàn)，影響目標(biāo)菌株的定性鑒定。

a-沙門(mén)氏菌熔解曲線(xiàn);b-金黃色葡萄球菌熔解曲線(xiàn);c-混合菌熔解曲線(xiàn)

a-沙門(mén)氏菌檢測(cè)靈敏度;b-金黃色葡萄球菌檢測(cè)靈敏度

a-沙門(mén)氏菌∶金黃色葡萄球菌熔解曲線(xiàn);b-金黃色葡萄球菌∶沙門(mén)氏菌熔解曲線(xiàn)

2.6 脫脂乳粉樣品檢測(cè)及與國(guó)標(biāo)法的比較

制備30個(gè)脫脂乳粉樣品，預(yù)增菌培養(yǎng)后分別進(jìn)行LAMP法檢測(cè)和國(guó)標(biāo)法檢測(cè)。結(jié)果如表4所示，100CFU/mL濃度的沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌污染樣品，經(jīng)36 ℃增菌12 h，LAMP檢出結(jié)果和國(guó)標(biāo)法檢出結(jié)果完全一致，未出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，說(shuō)明該方法具有良好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。此外，從預(yù)增菌到獲得檢測(cè)結(jié)果，全過(guò)程可在1 d內(nèi)完成，大大縮短了國(guó)標(biāo)法檢測(cè)周期，更省時(shí)便捷。

表4 脫脂乳粉樣品檢測(cè)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌已成為全球關(guān)注的食源性致病菌，每年感染人數(shù)達(dá)千萬(wàn)人，死亡病例達(dá)上萬(wàn)例，是我國(guó)乳粉出廠(chǎng)必檢項(xiàng)目[19-21]。通常被沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌污染的乳粉外觀(guān)和氣味沒(méi)有明顯異常，消費(fèi)者難以通過(guò)感官品評(píng)判斷產(chǎn)品污染，一旦被群眾食用，將對(duì)消費(fèi)者和廠(chǎng)家造成嚴(yán)重的健康危害和經(jīng)濟(jì)損失，因此對(duì)這2種食源性致病菌的實(shí)時(shí)檢測(cè)非常必要[22-23]。實(shí)驗(yàn)依據(jù)前人研究成果，選擇沙門(mén)氏菌特有侵襲蛋白invA基因和金黃色葡萄球菌特有耐熱核酸酶nuc基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。同時(shí)，由于不同引物本身對(duì)核酸擴(kuò)增效率不同，為避免低效率擴(kuò)增菌種漏檢風(fēng)險(xiǎn)，保證實(shí)際檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性，對(duì)二重引物配比進(jìn)行調(diào)整。結(jié)果，沙門(mén)氏菌∶金黃色葡萄球菌引物濃度比為3∶1時(shí)，建立的二重檢測(cè)方法效率最佳。對(duì)6株目標(biāo)菌株和9株非目標(biāo)菌株分別進(jìn)行單獨(dú)和混合檢測(cè)，對(duì)應(yīng)的沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌核酸均能得到特異性擴(kuò)增，而其他非目標(biāo)菌的菌液核酸均未產(chǎn)生擴(kuò)增，證明引物擴(kuò)增具有良好的特異性和穩(wěn)定性。

現(xiàn)階段應(yīng)用LAMP方法對(duì)微生物的定性檢測(cè)多集中在單一菌種的檢測(cè)，主要原因在于LAMP引物數(shù)量多，單個(gè)目標(biāo)菌的檢測(cè)已達(dá)到4條或者6條引物，多重引物更會(huì)翻倍增加，引物間堿基互補(bǔ)配對(duì)的不確定性為L(zhǎng)AMP多重體系的構(gòu)建帶來(lái)了難度。TANNE等[24]和XIA[25]等也對(duì)多重體系進(jìn)行了研究，但多數(shù)僅能用于菌種快速篩查，而不能對(duì)幾種菌進(jìn)行同時(shí)定性鑒定。本實(shí)驗(yàn)采用熔解曲線(xiàn)法對(duì)二重LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，通過(guò)觀(guān)察熔解曲線(xiàn)、特征峰的退火溫度，直接對(duì)檢測(cè)菌種進(jìn)行區(qū)分判定，直觀(guān)簡(jiǎn)單，保證了2種菌種同時(shí)快速篩查和定性鑒定需求。

在單一菌種靈敏度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌靈敏度均達(dá)到102fg/μL，與文獻(xiàn)報(bào)道PCR法比較，檢測(cè)靈敏度提高了10～100倍[26]，檢測(cè)結(jié)果較理想。對(duì)混合菌間擴(kuò)增干擾測(cè)試中設(shè)置了1∶1、1∶50、1∶100、1∶150四個(gè)濃度梯度，擬驗(yàn)證實(shí)際樣品菌濃度不定情況下的檢出限制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌濃度比相差100倍以上時(shí)，低濃度菌種核酸會(huì)被高濃度菌種核酸掩蓋，使其無(wú)法產(chǎn)生對(duì)應(yīng)熔解曲線(xiàn)，低濃度目標(biāo)菌株產(chǎn)生假陰性結(jié)果，也是實(shí)驗(yàn)存在的一個(gè)局限，但乳粉中沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測(cè)本身就是一種低濃度污染樣品檢測(cè)，因此實(shí)際應(yīng)用中，結(jié)果局限性實(shí)現(xiàn)可能不大。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)以沙門(mén)氏菌侵襲蛋白invA基因和金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶nuc基因設(shè)計(jì)建立的二重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，實(shí)施性好，為乳粉企業(yè)沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供方向，應(yīng)用前景廣闊。