岳翠男,秦丹丹,蔡海蘭,王治會(huì),李琛,李延升,楊普香*
1(江西省蠶桑茶葉研究所,江西 南昌, 330202) 2(江西省茶葉質(zhì)量與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌, 330202)3(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所,廣東 廣州, 510640)
滋味是茶葉的重要感官屬性,影響茶葉滋味的化學(xué)組分多且存在復(fù)雜的交互影響[1-2]。食品風(fēng)味術(shù)語(yǔ)是對(duì)產(chǎn)品感官性質(zhì)的表達(dá),其形成是通過(guò)經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的評(píng)價(jià)組對(duì)代表性樣品的評(píng)價(jià)、討論而建立起來(lái),能夠描述產(chǎn)品的風(fēng)味特征、區(qū)別不同風(fēng)味的產(chǎn)品[3-5]。贛北工夫紅茶包括寧紅和浮梁紅茶,以特殊的“蘋果香”和甜醇的滋味著稱,是中國(guó)最早的工夫紅茶之一,深受市場(chǎng)和消費(fèi)者的青睞。當(dāng)前,關(guān)于贛北工夫紅茶滋味表征和其滋味貢獻(xiàn)成分尚未見(jiàn)報(bào)道,因此,研究其分子感官基礎(chǔ)具有重要意義。
非靶向代謝組學(xué)研究對(duì)象是生物樣品中所有的內(nèi)源性代謝物,采用理想的非靶向代謝組學(xué)樣品采集手段和制備方法可以盡可能多的提取出樣品的代謝物,且簡(jiǎn)便快速[6-7]。近年來(lái),越來(lái)越多的科學(xué)工作者將其應(yīng)用到茶學(xué)研究領(lǐng)域,獲得有效的茶樹(shù)次生代謝規(guī)律以及不同茶類之間的差異代謝產(chǎn)物,便于人們了解茶葉內(nèi)源性信息[8-10]。因此采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)的非靶向代謝組學(xué)可以有效地檢測(cè)出茶葉中可以被人們感受到的滋味化學(xué)物質(zhì)。定量描述分析(quantitative description analysis,QDA)是一種具備剖析、描述、定量功能的風(fēng)味檢驗(yàn)方法,其可以用簡(jiǎn)單、大眾的詞匯描述樣品的感官印象,可單獨(dú)或綜合的應(yīng)用于樣品的外觀、香氣、滋味與口感特征的評(píng)價(jià)[11-12]。前人采用QDA法構(gòu)建了綠茶滋味、綠茶香氣、紅茶香氣、烏龍茶風(fēng)味、滇紅風(fēng)味的描述詞并對(duì)其強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)價(jià),獲得相關(guān)茶類的風(fēng)味特征,提高人們對(duì)茶葉品質(zhì)的感官認(rèn)知度[11,13]。
本研究以贛北工夫紅茶為研究對(duì)象,采用LC-MS和QDA分析樣品的非揮發(fā)性化合物以及滋味特征。擬對(duì)樣品滋味進(jìn)行感官評(píng)價(jià),鑒定其滋味化合物的構(gòu)成,以非揮發(fā)性化合物含量為自變量,滋味感官分屬性強(qiáng)度為因變量,采用偏最小二乘-重要變量投影(partial least square-variable import project,PLS-VIP)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,篩選出對(duì)滋味感官分屬性有重要貢獻(xiàn)的投影變量。
供試材料來(lái)自贛北不同廠家和不同等級(jí)的11份工夫紅茶樣品。其中編號(hào)1~8為寧紅,采購(gòu)于修水縣,編號(hào)9~11為浮梁紅茶,采購(gòu)于浮梁縣,樣品的加工采用傳統(tǒng)的工夫紅茶加工方法,包括鮮葉采摘、萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥、提香。每個(gè)樣品包裝采用統(tǒng)一規(guī)格的茶葉專用鋁箔袋,統(tǒng)一放在-4 ℃冰箱。
1.2.1 樣品非揮發(fā)性化合物檢測(cè)
實(shí)驗(yàn)樣品處理:(1)稱取50 mg粉碎后的樣品于5 mL離心管,加入0.1 mg/mL的L-2-氯苯丙氨酸,0.1 mg/mL的Lyso PC17∶0,0.1 mg/mL的Cholesterol-3,4-13C2,0.1 mg/mL的Glycocholic acid-13C1各20 μL作為內(nèi)標(biāo);(2)繼續(xù)向離心管中加入1 mL體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇水溶液,密封超聲提取30 min,-20 ℃靜置20 min,在13 000 r/min,4 ℃條件下離心10 min;(3)將上清液轉(zhuǎn)入新的5 mL離心管中;重復(fù)操作步驟(2)2次,每一次獲得的提取液均移入(3)中的離心管,定容;(4)將獲得的提取液旋渦30 s,用注射器吸取200 μL的上清液,使用0.22 μm的有機(jī)相針孔過(guò)濾器過(guò)濾后,轉(zhuǎn)移到LC進(jìn)樣小瓶進(jìn)行LC-MS分析,每個(gè)樣品3次重復(fù)。
液相色譜-質(zhì)譜分析條件:采用Waters ACQUITY UPLC I-Class/VION IMS Qtof MS高分辨質(zhì)譜儀組成的液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)。色譜柱為:Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫45 ℃;流動(dòng)相A:0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸,流動(dòng)相B:V(乙晴)∶V(甲醇)=2∶3(含0.1%甲酸);流速0.4 mL/min;進(jìn)樣量1 μL。流動(dòng)相A的洗脫梯度為:0 min~1 min,99%~70%;1 min~2.5 min,70%~40%;2.5 min~6.5 min,40%~10%;6.5 min~8.5 min,10%~0%;8.5 min~10.7 min,0%~0%;10.7 min~10.8 min,0%~99%;10.8 min~13 min,99%~99%。質(zhì)譜條件:離子源ESI;樣品質(zhì)譜信號(hào)采集分別采用正負(fù)離子掃描模式。毛細(xì)管電壓2.5 kV;進(jìn)樣電壓40 V;碰撞電壓6 eV;離子源溫度115 ℃,脫溶劑溫度450 ℃,脫溶劑氣流速900 L/h,質(zhì)譜掃描范圍50~1 000 amu;掃描時(shí)間0.2 s;掃描間延遲0.02 s。
LC-MS定性:原始數(shù)據(jù)經(jīng)代謝組學(xué)處理軟件Progenesis QI V2.3軟件進(jìn)行基線過(guò)濾、峰識(shí)別、積分、保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊和歸一化?;衔锏蔫b定基于精確質(zhì)量數(shù)、二級(jí)碎片以及同位素分布,使用The Human Metabolome Database(HMDB)和Lipidmaps(V2.3)以及METLIN數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行定性。LC-MS定量:采用峰面積歸一法。
1.2.2 茶樣感官評(píng)價(jià)
評(píng)價(jià)員篩選與描述詞產(chǎn)生:依據(jù)Herbert Stone建立的QDA理論體系,參與感官評(píng)價(jià)的人員必須具備一致、敏感、客觀及可控性[14-16]。因此,采用一般味覺(jué)篩選的三角試驗(yàn)以及順位試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)員篩選,最終篩選出能分辨80%以上滋味的6名評(píng)茶員組成評(píng)價(jià)小組。稱取3.0 g干茶放入評(píng)茶杯中,注入150 mL沸水,5 min后瀝出茶湯,由建立的評(píng)價(jià)小組對(duì)樣品的滋味剖面進(jìn)行初步描述,產(chǎn)生初步描繪詞。之后進(jìn)行討論,再結(jié)合已有文獻(xiàn)所報(bào)道的工夫紅茶的風(fēng)味描述詞和江西紅茶傳統(tǒng)風(fēng)味特描述詞,刪除描述不清的和重復(fù)的詞匯,最終建立的描繪詞及定義見(jiàn)表1。
茶樣滋味感官評(píng)價(jià):茶湯制備與上述相同,由評(píng)價(jià)小組按照建立的滋味描述詞及參比物進(jìn)行評(píng)價(jià),滋味描繪詞的感覺(jué)強(qiáng)度尺度為1~15,1~3為極微弱;3~5為微弱;5~7為弱;7~9為一般;9~11為較強(qiáng);11~13為強(qiáng);13~15為極強(qiáng)。結(jié)果取均值。
表1 贛北工夫紅茶滋味描述詞
采用SPSS 20.0進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)、方差分析和相關(guān)分析;采用SIMCA14.1進(jìn)行偏最小二-乘重要變量投影分析。
2.1.1 樣品滋味分屬性強(qiáng)度的方差分析
樣品的9種滋味分屬性的強(qiáng)度評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2。從樣品各滋味分屬性平均值及方差分析可以看出贛北工夫紅茶的感官特征以甜、醇和回甘為主,各樣品的感官分屬性之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。苦、澀、酸、甜、鮮是人類的基本味覺(jué)屬性,厚、醇、回甘等滋味分屬性是茶湯在口腔中的質(zhì)構(gòu)表征和味感持續(xù)效應(yīng)[17]。QDA分析發(fā)現(xiàn),茶湯的苦味、澀味、酸味及鮮味強(qiáng)度在“一般”及以下水平;樣品的甜味強(qiáng)度整體較高,只有11號(hào)樣的甜味和其他樣品間均存在顯著差異(P<0.05);“厚”是茶湯內(nèi)含物質(zhì)在口腔中的綜合反映,茶湯厚度高,說(shuō)明內(nèi)含成分豐富[14],本研究所選擇樣品的厚度存在顯著性差異(P<0.05),推測(cè)原因是樣品之間的滋味成分差異性較大;“醇”是衡量茶湯滋味品質(zhì)的重要指標(biāo),醇味強(qiáng)度的高低一定程度上可以反映消費(fèi)者的喜好度,樣品的醇味強(qiáng)度為6.5~10.5,部分樣品間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但整體較高,從側(cè)面說(shuō)明了寧紅和浮梁紅茶市場(chǎng)接受性高的原因;異味產(chǎn)生多因加工工藝不當(dāng)、加工環(huán)境不夠潔凈、貯存不當(dāng)?shù)?,本研究所抽取樣品的異味均在極微弱水平。
表2 贛北工夫紅茶滋味感官定量描述分析結(jié)果
2.1.2 樣品滋味分屬性強(qiáng)度的相關(guān)性分析
采用相關(guān)性分析法探究茶湯滋味分屬性之間的相關(guān)性,結(jié)果見(jiàn)表3。贛北工夫紅茶的整體滋味強(qiáng)度與異味、苦味分別呈極顯著、顯著負(fù)相關(guān),與酸味、澀味呈負(fù)相關(guān),但未達(dá)到顯著水平;其與甜味和醇味分別呈極顯著和顯著正相關(guān),回甘、鮮味、厚味也與茶湯的整體滋味品質(zhì)呈正相關(guān),但未達(dá)到顯著水平。滋味分屬性之間也存在顯著相關(guān)性,茶湯的苦味和澀味呈顯著正相關(guān),與甜味呈顯著負(fù)相關(guān),有研究表明澀味和苦味兩者之間具有明顯的加和效應(yīng)[15];甜味與異味之間具有極顯著負(fù)相關(guān);鮮味與回甘之間具有極顯著正相關(guān),這兩者均與整體滋味強(qiáng)度呈正相關(guān)。
表3 各滋味分屬性的相關(guān)性分析
對(duì)贛北工夫紅茶樣品進(jìn)行LC-MS檢測(cè)分析,其分析結(jié)果見(jiàn)圖1,紅色代表化合物在茶樣中含量高于平均值,綠色代表化合物在茶樣中含量低于平均值,顏色深淺代表含量高低程度。主要檢測(cè)到的共有非揮發(fā)性化合物74種,包括25種酚類、23種氨基酸類、9種色素類、9種有機(jī)酸類、5種糖類、2種生物堿和茶皂素,酚類包括兒茶素類、黃酮醇類和黃酮苷類,氨基酸為不同類型的氨基酸單體和復(fù)合氨基酸,色素類分為茶黃素類、花色素類和花青素類;糖類包括單糖、二糖和三糖;生物堿包括咖啡堿和可可堿。從熱圖顏色深淺上可以看出,每一種化合物在11份工夫紅茶中含量均有差異,未發(fā)現(xiàn)顏色完全一致的成分,此結(jié)果也從側(cè)面說(shuō)明了茶樣各感官分屬性均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的原因。
圖1 主要非揮發(fā)性成分熱圖分析
PLS-VIP可以對(duì)龐大的數(shù)據(jù)系統(tǒng)進(jìn)行分解和降維,從復(fù)雜的數(shù)據(jù)變量中識(shí)別出對(duì)因變量影響較大的自變量,且可以有效地避免自變量之間多重共線性的干擾[17-18]。以非揮發(fā)性化合物為自變量X,滋味感官分屬性為因變量Y,進(jìn)行PLS-VIP分析。樣品在前2個(gè)主成分上的分布結(jié)果見(jiàn)圖2。
圖2 樣品在主成分上的分布
PLS提取出3個(gè)主成分,對(duì)模型的總解釋度為72.1%,11個(gè)樣品中7、8號(hào)樣品以及4、6號(hào)樣品存在重疊,原因7、8號(hào)和4、6號(hào)樣品源于同一生產(chǎn)廠家,所使用茶樹(shù)品種以及鮮葉等級(jí)一致,其他各樣品可以在主成分上有效的區(qū)分開(kāi)來(lái),說(shuō)明模型的可信度較高,可以進(jìn)行下一步的PLS分析。滋味分屬性與主要非揮發(fā)性成分的關(guān)聯(lián)圖見(jiàn)圖3。
圖3中的非揮發(fā)性成分對(duì)滋味分屬性的VIP值>1時(shí),即說(shuō)明其為贛北工夫紅茶滋味的關(guān)鍵貢獻(xiàn)成分,其中共有33種化合物的VIP值>1,包括10種氨基酸類、12種酚類、3種色素類、1種生物堿、4種酸類、3種糖類。分別是L-組氨酸、富馬酸、咖啡堿、L-天冬酰胺、異麥芽糖、L-精氨酸、山奈酚、槲皮素、茶黃素酸、D-木糖、D-葡萄糖、甲基半胱氨酸、奎寧酸、紫云英苷、L-酪氨酸、L-谷氨酸、胱氨酸、莽草酸、茶黃素 3-沒(méi)食子酸酯、表兒茶素(epicathchin,EC)、飛燕草色素-3-O-葡萄糖苷、L-天門冬氨酸、兒茶素沒(méi)食子酸(catechin gallate,CG)、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸(gallocatechin gallate,GCG)、山奈素3-O-鼠李糖苷、沒(méi)食子兒茶素(gllocatechin,GC)、楊梅素、沒(méi)食子酸(gallic acid,GA)、檸檬酸、茶黃素、L-焦谷氨酸、L-蘇氨酸和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)。說(shuō)明此33種非揮發(fā)性成分為贛北工夫紅茶滋味的關(guān)鍵貢獻(xiàn)成分。
為進(jìn)一步探討每個(gè)滋味分屬性的關(guān)鍵貢獻(xiàn)成分,以各滋味分屬性強(qiáng)度為因變量Y和主要非揮發(fā)性化合物為自變量X進(jìn)行PLS-VIP分析,得到對(duì)8個(gè)滋味分屬性具有重要貢獻(xiàn)的化合物,因異味PLS解釋度較差,對(duì)異味具有重要貢獻(xiàn)的物質(zhì)需進(jìn)一步結(jié)合香氣成分進(jìn)行討論,VIP值>1的成分篩選結(jié)果見(jiàn)表4。
苦味-VIP:對(duì)苦味有重要貢獻(xiàn)的化合物有14種,包括2種氨基酸類、3種多酚類、4種色素類、2種生物堿、2種酸類、1種糖類和茶皂素;對(duì)苦味影響最大的為咖啡堿,其次為可可堿,兩者的的VIP值分別為4.17和3.59,遠(yuǎn)高于其他化合物的VIP值,從呈味特性來(lái)看,咖啡堿和可可堿均為苦味,相關(guān)研究已表明,咖啡堿與苦味有顯著的正相關(guān)[19];4種色素類化合物主要是茶黃素類,其可以和咖啡堿絡(luò)合從而改善茶湯的風(fēng)味[15],3種酚類物質(zhì)均屬于黃酮苷類化合物,通常在口腔里表現(xiàn)為澀味,可以加強(qiáng)味覺(jué)和大腦對(duì)苦味的感知,繼而增強(qiáng)茶湯的苦味;茶皂素具有辛辣的苦味,會(huì)抑制茶湯的甜味[20]。
澀味-VIP:對(duì)澀味有重要貢獻(xiàn)的化合物有27種,包括10種氨基酸、9種酚類、5種酸類、1種生物堿類、1種色素類、1種糖類。對(duì)澀味影響較大的化合物為具有澀味的酚類和苦味氨基酸類化合物,以及呈酸味的草酸和呈苦味的L-異亮氨酸、L-酪氨酸;多酚類中EGCG閾值較低,屬于含量最高的兒茶素,被認(rèn)為是對(duì)綠茶澀味貢獻(xiàn)最大的兒茶素[15],而在澀味PLS-VIP分析中,EGCG的貢獻(xiàn)不大,可能是由于贛北工夫紅茶中的EGCG氧化較為充分。
鮮味-VIP:鮮味具有味覺(jué)平衡風(fēng)味增強(qiáng)作用[21]。影響茶湯鮮味的關(guān)鍵化合物有27種,包括10種酚類、7種氨基酸類、4種色素類、2種酸類、2種生物堿、2種糖類,對(duì)鮮味影響較大化合物為L(zhǎng)-谷氨酸、L-精氨酸、異麥芽糖、和紫云英苷,本研究中工夫紅茶的鮮味處于“弱”強(qiáng)度水平,推測(cè)可能是由于L-谷氨酸的滋味被呈澀味的酚類化合物削弱而引起的;投影到鮮味的化合物種類較多為呈澀味的多酚類物質(zhì),口腔中澀味的存在對(duì)鮮味具有抑制效應(yīng)。
酸味-VIP:對(duì)酸味有關(guān)鍵影響的滋味化合物有33種,包括8種氨基酸類、11種酚類、5種色素類、7種酸類、2種糖類,對(duì)酸味影響較大的是天冬酰胺、芹菜素和莽草酸等。7種酸類對(duì)酸味的VIP值為1.01~1.50,對(duì)酸味有貢獻(xiàn)的化合物呈味特性主要為酸味、甜味和澀味,說(shuō)明這幾種滋味之間可能存在交互效應(yīng),相關(guān)性分析結(jié)果也顯示澀味、苦味與酸味之間呈正相關(guān),甜味、鮮味與酸味呈負(fù)相關(guān)。樣品的酸味整體強(qiáng)度較低,可能是由于贛北工夫紅茶的甜味強(qiáng)度高,抑制了酸味在味蕾上的表達(dá)。
甜味-VIP:甜味是贛北工夫紅茶優(yōu)異品質(zhì)的重要表現(xiàn)。影響茶湯甜味的化合物主有19種,包括8種氨基酸類、6種酚類、3種糖類、1種酸類、1種色素類,對(duì)甜味影響較大的為D-葡萄糖、山奈素-3-O-鼠李糖苷和山奈酚等,后兩者屬于黃酮苷類,而該類物質(zhì)多表現(xiàn)為澀味,且在高濃度條件下,還可以增強(qiáng)茶湯的苦味[22-23],因此,在茶葉加工過(guò)程中應(yīng)減少黃酮苷類化合物的積累,還需通過(guò)一定工藝處理,促進(jìn)多糖類和糖苷化合物水解為單糖、二糖等可溶性糖類化合物,提高茶湯的甜度。
回甘-VIP:回甘是多種滋味分屬性的綜合效應(yīng)[15]。對(duì)回甘有關(guān)鍵影響的化合物有30種,包括6種氨基酸類、13種多酚類、4種色素類、4種酸類、2種糖類、1種生物堿,其中異麥芽糖、原花青素、紫云英苷影響較大,有研究表明,澀感是回甘的關(guān)鍵貢獻(xiàn)分屬性之一,前面相關(guān)性分析結(jié)果表明,回甘與苦味、澀味以及酸味呈負(fù)相關(guān),與鮮味、甜味呈顯著的正相關(guān),表明具有甜味和鮮味的化合物對(duì)回甘有正效應(yīng),呈苦味、澀味、酸味的化合物對(duì)回甘有負(fù)效應(yīng),然而,在PLS-VIP結(jié)果中,VIP值>1多為呈澀味、苦味和酸味的化合物,呈甜味或鮮味的化合物只有L-組氨酸、異麥芽糖和D-葡萄糖,從側(cè)面說(shuō)明了樣品的整體回甘強(qiáng)度較弱的原因。
醇味-VIP:醇味是滋味化合物之間互作效應(yīng)協(xié)調(diào)的表現(xiàn)[17]。對(duì)醇味有重要影響的化合物有20種,包括8種氨基酸類、茶皂素、3種酚類、1種色素、1種生物堿、5種酸類、1種糖類,其中貢獻(xiàn)較大的為L(zhǎng)-天冬氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸,VIP>1的化合物以呈鮮味、甜味、酸味為主,從化合物種類來(lái)看,糖類化合物對(duì)醇味的影響較小。
厚味-VIP:對(duì)厚味有重要貢獻(xiàn)的化合物有34種,包括16種氨基酸、7種酚類、3種色素、5種酸類、2種糖類和茶皂素,貢獻(xiàn)較大的為草酸、谷氨酰胺、L-蘋果酸,此3種化合物均帶有酸味,且所檢測(cè)到的酸類化合物中,有50%以上與厚味密切相關(guān),因此,推測(cè)酸類化合物對(duì)“厚”的影響極大,然而,在滋味分屬性相關(guān)性分析中,酸味與厚味之間并沒(méi)有明顯的相關(guān)性,目前,本研究未能對(duì)這2種相悖的結(jié)論做出有價(jià)值的解釋,需要進(jìn)一步的研究。
獲得了贛北工夫紅茶的9個(gè)滋味描繪詞及定義,其滋味特征以甜味、醇味和回甘為主,各樣品的滋味分屬性之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,且滋味分屬性之間存在復(fù)雜的相關(guān)性。共篩選到74種共有非揮發(fā)性化合物,包括25種酚類、23種氨基酸類、9種色素類、9種有機(jī)酸類、5種糖類、2種生物堿和茶皂素;其中有33種化合物對(duì)贛北工夫紅茶滋味具有重要貢獻(xiàn),分別為L(zhǎng)-組氨酸、富馬酸、咖啡堿、L-天冬酰胺、異麥芽糖、L-精氨酸、山奈酚、槲皮素、茶黃素酸、D-木糖、D-葡萄糖、甲基半胱氨酸、奎寧酸、紫云英苷、L-酪氨酸、L-谷氨酸、胱氨酸、莽草酸、茶黃素-3′-沒(méi)食子酸酯、EC、飛燕草色素-3-O-葡萄糖苷、L-天門冬氨酸、CG、GCG、山奈素3-O-鼠李糖苷、GC、楊梅素、GA、檸檬酸、茶黃素、L-焦谷氨酸、L-蘇氨酸和EGCG,并進(jìn)一步得到了對(duì)各滋味分屬性具有重要貢獻(xiàn)的化合物。