李 玲，朱夢晨，李 點，楊婷婷，邱 婷，王 健

0引言

隨著現代生活計算機、手機的普及，外界環(huán)境風沙、煙塵的侵襲，隱形眼鏡和冷暖空調的廣泛使用，干眼的發(fā)病率呈逐年升高趨勢[1-2]。因此，對干眼發(fā)病機制與藥物防治的研究具有重要的現實意義?；跍I腺細胞原代培養(yǎng)構建穩(wěn)定的干眼細胞模型成為本課題組研究的首要工作，然而，干眼細胞模型雖有報道，但不盡詳細，模型的穩(wěn)定性也有待考究，不利于以原代淚腺細胞為工具的相關的基礎和臨床研究。因此，本研究使用原代培養(yǎng)兔淚腺上皮細胞，采用脂多糖(LPS)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)干預的方式構建干眼細胞模型，并通過免疫熒光、流式和ELISA方法，對原代細胞進行活性和純度檢測，并對比兩種建模方式的差異，為進一步篩選干眼防治藥物和評價藥效學奠定基礎。

1材料和方法

1.1材料新西蘭白兔，雄性，12只，90日齡，1～1.2kg，普通級，由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供(SPF級)。湖南許可證號：SCXK(湘)2013-0004。飼養(yǎng)溫度20～25℃，濕度50%～70%。所有動物實驗操作均經過湖南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審議并通過。流式細胞儀(美國Beckman，coulter-cytexpert)，細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo，3111)，臺式高速冷凍離心機(美國Thermo)，ELX800-酶標儀(美國Bio-tek，ELX800)，微量移液器(德國Eppendorf)；FBS、DMEM/F12的培養(yǎng)液購自美國Gibco，Ⅱ型膠原酶(V900892)、LPS(Sigma，L2880)，TNF-α因子(美國Immunochemistry，6519)，Pan-cytoeratin抗體(bs-1712R)、FITC-羊抗兔IgG(bs-0370R)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(BA00101)、CCK-8細胞增殖-毒性檢測試劑盒(Biosharp，BS350A)。

1.2方法

1.2.1完全培養(yǎng)液的配置取10mL FBS、40mL DMEM/F12基礎培養(yǎng)基混合，配成含20%FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)液。Ⅱ型膠原酶：0.01gⅡ型膠原酶粉溶于基礎培養(yǎng)基中定容至5mL，配制成2g/L應用液。

1.2.2淚腺上皮細胞的原代培養(yǎng)[3-4]隨機選取1只雄兔，選用20%烏拉坦1.5g/mL耳緣靜脈注射，在超凈工作臺上常規(guī)無菌操作，用眼科剪取出淚腺組織。置于培養(yǎng)皿中用含雙抗的PBS清洗兩遍，換成DMEM/F12基礎培養(yǎng)基，剝離小血管及纖維結締組織，并剪碎淚腺小組織塊，整個過程在冰上操作。轉移至15mL BD管中，1500r/min，離心5min去上清，加入5mLⅡ型膠原酶，置于搖床80r/min消化20～30min后加入完全培養(yǎng)液終止消化。1500r/min離心5min，棄部分上清，加入5mL 0.25%胰蛋白酶后于培養(yǎng)箱消化5min。終止消化后進行吹打并吸走絮片狀組織塊，經200目篩網過濾，1500r/min，離心5min去上清。加入含20% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，制備細胞懸液。細胞按(4～6)×104cells/mL的密度接種于培養(yǎng)瓶，常規(guī)培養(yǎng)，12h后換液，以去除沒有貼壁的細胞及碎片。此后每12h換液一次。

1.2.3免疫熒光法檢測Pan-cytoeratin蛋白取第二代細胞，接種于預置在12孔板的爬片上，當細胞基本融合，及時取出作4%多聚甲醛固定30min。冷0.01mol/L PBS洗5min×3次，5%BSA封閉30min后，每孔加入一抗兔源Pan-cytoeratin(1∶200)50μL，4℃孵育過夜。PBS洗爬片5min×3次，吸水紙吸干多余液體后加入FITC標記抗兔IgG(1∶200)，室溫避光孵育1h，棄液，PBS洗5min×5次。細胞骨架羅丹明(1∶100)染色，避光孵育20min，棄液，PBS洗5min×5次。滴加DAPI(1∶200)避光孵育5min，棄液，PBS洗5min×8次。防熒光淬滅劑封片。檢測淚腺上皮細胞特異性蛋白Pan-cytoeratin表達情況。

1.2.4干眼細胞模型[5]根據LPS和TNF-α的IC50值，結合預實驗結果，分別選取LPS(10μg/mL)和TNF-α(2.5ng/mL)作為干預淚腺細胞的施加因素，干預12h后，處理細胞，收集樣本，對相關炎性因子的細胞損傷關鍵元件進行檢測，擬構建淚腺細胞的炎癥微環(huán)境，模擬干眼的生物學特征，同步設空白對照組。

1.2.4.1藥物IC50的測定淚腺細胞接種于96孔板(6000cells/well)。分別用不同濃度(0、5、10、20、40μg/mL)的LPS和TNF-α(0、2.5、5、10、20ng/mL)孵育12h。根據試劑盒說明書，使用CCK-8測定細胞毒性。在450nm處測量光密度(OD)。根據光密度(OD)計算細胞抑制率IR(%)=(對照-干預)/(對照-空白)×100%，以及IC50。選取半數IC50值作為干預濃度。

1.2.4.2流式細胞術檢測各組細胞的凋亡情況淚腺原代細胞接種于6孔板(10000cells/well)中，采用上述細胞模型建立的不同干預方式處理12h后，收集各組細胞，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書，使用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

圖1 兔淚腺上皮原代細胞提取與培養(yǎng) A：兔淚腺取材；B：兔淚腺上皮原代細胞鏡下觀察(×40)；C：兔淚腺上皮原代細胞鏡下觀察(×100)。

圖2 兔淚腺上皮原代細胞標志蛋白Pan-cytoeratin的表達(×200) A:合成B+C+D；B：FITC標記Pan-cytoeratin蛋白；C：DAPI標記細胞核；D：羅丹明標記細胞骨架。

圖3 LPS和TNF-α干預兔淚腺原代上皮細胞12h的IC50 A:LPS的IC50;B：TNF-α的IC50。

1.2.4.3 ELISA檢測各組細胞上清液中相關炎性因子的含量淚腺原代細胞接種于6孔板(8000cells/well)中，采用上述細胞模型建立的不同處理方法，收集各組細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書，測定白細胞介素1β(IL-1β)和白細胞介素6(IL-6)的含量。

2結果

2.1兔淚腺上皮原代細胞培養(yǎng)情況原代培養(yǎng)12h后細胞基本貼壁，48h可見細胞形態(tài)舒展，呈長三角形。待細胞增殖至覆蓋培養(yǎng)瓶70%～80%時進行胰蛋白酶消化傳代。用CCK-8法檢測細胞活性，達92%以上，見圖1。

2.2免疫熒光法檢測兔淚腺上皮原代細胞標志蛋白Pan-cytoeratin的表達免疫熒光結果顯示：兔淚腺上皮原代細胞標志角化蛋白(Pan-cytoeratin)主要表達在細胞質，且陽性率>90%，符合實驗要求,見圖2。

2.3 LPS和TNF-α的IC50結果CCK-8結果顯示：LPS和TNF-α干預兔淚腺上皮細胞12h的IC50分別為20μg/mL、4.996ng/mL，擬后續(xù)兩種方法制備兔干眼細胞模型時，選擇LPS的0.5倍，即10μg/mL和TNF-α的0.5倍IC50，即2.5ng/mL進行后續(xù)實驗，見表1,圖3。

表1 不同濃度LPS和TNF-α干預兔淚腺原代上皮細胞的抑制率

2.4流式細胞術檢測各組細胞的凋亡情況流式細胞術結果顯示：三組細胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=225.30，P<0.01)。LPS(10μg/mL)和TNF-α(2.5ng/mL)組細胞凋亡率明顯高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(t=12.34，P<0.01；t=16.53，P<0.01)。兩種造模干預組組間比較，TNF-α組細胞凋亡率高于LPS組，差異具有統(tǒng)計學意義(t=4.18，P<0.01)，提示TNF-α模擬干眼的炎癥反應效果優(yōu)于LPS，見表2，圖4。

圖4 兩種干預方式細胞凋亡情況的比較 A：空白對照組；B：LPS組；C：TNF-α組；D：各組凋亡率比較。b P<0.01 vs空白對照組;d P<0.01 vs LPS組。

表2 各組細胞凋亡率和細胞上清液中IL-1β、IL-6的含量比較

2.5 ELISA檢測各組細胞上清液中炎性因子的含量ELISA結果顯示：三組細胞上清液中IL-1β和IL-6的含量比較，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。LPS(10μg/mL)和TNF-α組(2.5ng/mL)細胞上清液中IL-1β和IL-6的含量均明顯高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。兩種造模干預組組間比較，TNF-α組IL-1β和IL-6的含量明顯高于LPS組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示TNF-α模擬干眼的炎癥反應效果優(yōu)于LPS，見表2。

3討論

干眼是眼表的一種多因子疾病，特征是淚膜穩(wěn)態(tài)的喪失并伴有眼表癥狀，其病因包括淚膜不穩(wěn)定、淚液高滲性、眼表炎癥與損傷和神經感覺異常，其中淚腺上皮炎癥浸潤和病變是干眼的重要病理生理過程[6-7]。近幾年有研究發(fā)現，眼表的慢性炎癥是干眼重要的病理機制[8]。人體內的炎癥因子如TNF-α具有免疫調節(jié)、參加炎癥反應的功能，生理狀態(tài)下炎癥因子表達較低[9],當分泌量加大時，能夠激活單核細胞和中性粒細胞，促進白細胞聚集，誘發(fā)機體產生一系列炎癥反應[10]。炎癥在延續(xù)和維持干眼中起著關鍵作用[11]。因此，通過離體兔淚腺并分離淚腺上皮細胞作為研究干眼的對象，有助于在體外模擬干眼。

本研究中兔淚腺上皮細胞的體外基礎培養(yǎng)基為DMEM/F12，含有更為豐富的營養(yǎng)成分和多種微量元素，并加以15%～20%的FBS，能盡可能模擬體內機體環(huán)境，有利于細胞的生長和代謝。本研究對獲取的兔淚腺上皮細胞進行活性和純度檢測結果顯示：兔淚腺上皮原代細胞標志角化蛋白(Pan-cytoeratin)主要表達在細胞質，且陽性率>90%，符合實驗要求。

目前研究表明，干眼發(fā)生的主要機制為炎癥反應、細胞凋亡等，眾多炎癥細胞因子、促炎因子的交互作用參與了干眼的發(fā)病過程[12-13]。常規(guī)細胞炎癥模型的干預方法以LPS刺激為主，LPS是革蘭氏陰性菌細胞外膜的主要成分，與其受體結合后啟動細胞內信號傳遞鏈，促使核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)活化，從而啟動炎癥介質、黏附分子等轉錄，介導炎癥反應[14]。而TNF-α是干眼炎癥反應中活躍的炎癥因子，通過激活NF-κB通路誘導炎癥介質的產生，介導細胞凋亡。我們前期研究也證實兔干眼動物模型血清和淚腺組織勻漿液中TNF-ɑ表達與正常組差異最為顯著，而且干眼患者淚液中TNF-α的含量與角膜上皮的損傷程度呈正相關[15]，由此可推測，在一定程度上TNF-α干預淚腺上皮細胞更具備干眼模型的特征。因此，本研究采用LPS和TNF-α構建干眼模型，并對兩者構建干眼模型的IC50，細胞凋亡和炎性因子分泌等進行檢測和比較，結果表明LPS和TNF-α干預兔淚腺上皮細胞12h的IC50分別為20μg/mL和4.996ng/mL，兩者的0.5倍IC50，即10μg/mL和2.5ng/mL干預下細胞凋亡和炎性因子分泌水平TNF-α高于LPS。由此可見，LPS和TNF-α皆可以構建干眼模型，但是在相同IC50的干預下，TNF-α的造模效果優(yōu)于LPS。

本研究成功建立了一種細胞純度較高、相對簡便、快速，模型穩(wěn)定的兔干眼細胞模型，為兔淚腺上皮細胞功能及干眼的基礎研究提供了更穩(wěn)定的體外實驗模型。