張麗芬，張盼盼，潘潤森，陳復生，劉東紅，賴少娟

(1.河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450052；2.河南省南街村(集團)有限公司，河南 漯河 462600；3.浙江大學 生物系統(tǒng)工程與食品科學學院/智能食品加工技術與裝備國家地方聯合工程實驗室/浙江省農產品加工技術研究重點實驗室/浙江省健康食品制造與品質控制國際合作基地，浙江 杭州 310058)

櫻桃番茄(LycopersiconesculentumMill.)營養(yǎng)豐富，可作為蔬菜、水果鮮食，亦可加工成果脯、果酒等食品。櫻桃番茄中富含的番茄紅素是強有效的抗氧化物質，具有淬滅活性氧、消除體內自由基、減緩動脈粥樣硬化、預防多種癌癥和保護心血管等多種生理功能，其清除單線態(tài)氧的能力是β-胡蘿卜素的2倍以上，是維生素E的100倍[1]。櫻桃番茄皮薄汁多，運輸過程中極易發(fā)生機械損傷、失水萎蔫，繼而出現霉變腐爛，造成大量損耗。

目前，櫻桃番茄采后貯藏保鮮方法主要有冷藏、氣調、熱處理、超聲波和化學保鮮劑處理等[2]。研究表明，通過冷藏、氣調和浸漬等保鮮方法均能降低果實呼吸強度，延緩各營養(yǎng)成分的變化，從而保持果實較好的營養(yǎng)品質[2-4]；但是，不適宜的冷藏溫度易引起果實冷害[3]，氣調保鮮投資大，成本較高，且熱處理易造成果蔬的熱傷害和風味改變。

超聲波(ultrasound，U)作為一種非熱物理加工技術，近年來在食品行業(yè)發(fā)展迅速。超聲空化效應產生的瞬時高溫高壓能夠有效殺死果實表面的微生物，維持果蔬營養(yǎng)品質。研究發(fā)現，番茄果實經超聲處理后，風味、營養(yǎng)品質、番茄紅素含量和抗氧化能力均得到提高[5-6]。超聲波與其他保鮮技術聯合使用可起到更佳保鮮效果。浸漬保鮮技術在維持果蔬品質特性方面同樣具有獨特優(yōu)勢，常用的浸漬液主要有鹽酸、水楊酸以及鈣溶液等，其中鈣在調節(jié)果蔬采后生理功能過程中起著關鍵作用。研究表明，鈣浸漬能夠維持果實顏色的穩(wěn)定，延緩果實成熟，并抑制病原菌生長，維持較高的果實品質[7-9]。鈣浸漬成本低、操作簡易，既能維持果實更好的營養(yǎng)品質，滿足人們的消費需求，又能提高果實中鈣含量，滿足人們的健康需求。超聲波協同鈣浸漬技術對櫻桃番茄中番茄紅素影響方面的研究鮮見報道，因此，探索櫻桃番茄的超聲協同鈣浸漬保鮮方法具有現實意義。

本研究擬以櫻桃番茄為原料，研究超聲協同鈣浸漬對櫻桃番茄貯藏過程中理化品質和番茄紅素的影響，希望通過對番茄紅素結構特性的分析，揭示超聲協同鈣浸漬提高櫻桃番茄品質的機理。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

櫻桃番茄(圣女1416)，采摘于河南省安陽市種植園。

食品級乳酸鈣(純度≥98%)，購自洛陽昊華化學試劑有限公司；番茄紅素標品、氘代氯仿(色譜純)，購自上海麥克林生化科技有限公司；甲酸、乙醇和乙腈(色譜純)，購自美國CBS公司。

1.2 儀器與設備

SBL-10DT型恒溫超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；GL-10000C型高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；Waters 1525型HPLC色譜儀，美國Waters 公司；Bruker AVANCE III HD 400型超導核磁共振波譜儀，德國Bruker公司；CR-410型色差計，日本柯尼卡美能達有限公司；TA-XT2i型物性分析儀，英國Stable Micro Systems公司。

1.3 實驗方法

1.3.1櫻桃番茄預處理

櫻桃番茄采摘后即刻送往實驗室，挑選大小均勻、無病害的果實分組進行實驗，每組樣品個數為350個。實驗共分為4組：對照組(CK，未進行任何處理)；超聲組(U，15 ℃、20 W/L超聲處理15 min)；鈣浸漬組(Ca，15 ℃、用質量分數為2%的乳酸鈣浸漬處理15 min)；超聲協同鈣浸漬組(U+Ca，15 ℃、2%乳酸鈣浸漬，同時20 W/L超聲處理15 min)。處理后的樣品裝入帶孔PVC保鮮盒，4 ℃貯藏。每次隨機取出20個樣品進行測定。

1.3.2櫻桃番茄硬度的測定

采用物性分析儀測定番茄硬度，探頭直徑為35 mm，預壓速度3.0 mm/s，測試速度1.0 mm/s，壓后上行速度1.0 mm/s，觸發(fā)力10 g，下壓距離為3 mm，每組樣品測試20個櫻桃番茄。

1.3.3櫻桃番茄色澤的測定

采用色差計測定番茄色澤，在果實上隨機選取3個不同的點進行測量，記錄L*、a*和b*的值，每組測定20個果實，結果用褐變指數(browning index，BI)表示[10]。

1.3.4櫻桃番茄失重率和腐爛率的測定

失重率和腐爛率測定時各處理組均分為3個平行組，30顆果實為一組，共360顆果實。失重率參考Zhang等的方法測定[11]，用電子天平稱量貯藏前(m0)和貯藏后(m1)每組果實質量，計算方法如式(1)。

腐爛率采用統(tǒng)計法[12]計算。腐爛級別：0級，無腐爛；1級，腐爛面積小于整個果實的10%；2級，腐爛面積占整個果實面積的10%～30%；3級，腐爛面積占果實面積的30%～50%。計算方法如式(2)。

(1)

(2)

式(1)中：m0為果實貯藏前質量，g；m1為果實貯藏后質量。g。

1.3.5櫻桃番茄可滴定酸和維生素C的測定

可滴定酸(TA)含量采用氫氧化鈉滴定法測定[13]。稱取混合均勻的果肉10.0 g，研磨并轉移至50 mL容量瓶中，定容、搖勻，靜置30 min后真空抽濾。取濾液20 mL，用NaOH標準溶液滴定。計算方法如式(3)。

(3)

式(3)中：V：樣品提取液總體積，mL；Vs：滴定時所取濾液體積，mL；c：NaOH滴定液濃度，mol/L；V1：滴定濾液消耗的NaOH體積，mL；V0：滴定蒸餾水消耗的NaOH體積，mL；m：樣品質量，g；f：折算系數，g/mmol。

維生素C含量參考Spinola等[14]方法測定。稱取10.0 g果肉，加入少量質量分數為2%的鹽酸溶液，冰浴下研磨成漿，轉入25 mL容量瓶中，定容、搖勻，提取10 min后過濾。分別取0.5 mL 10 g/L KI溶液，2.0 mL 5 g/L淀粉溶液，5.0 mL提取液和2.5 mL蒸餾水于三角瓶中，用KIO3溶液滴定，至微藍色不褪為終點。記錄所用KIO3溶液體積，重復3次。用5.0 mL 2%鹽酸溶液做空白。維生素C含量以100 g樣品(鮮重)中含有的抗壞血酸的質量表示，即mg/100 g。計算方法如式(4)。

(4)

式(4)中：V1為樣品滴定消耗的KIO3溶液的體積，mL；V0為空白滴定消耗的KIO3溶液的體積，mL；0.088為1 mL 1 mmol/L KIO3溶液相當的抗壞血酸的質量，mg；Vs為滴定時所取樣品的體積，mL；V為樣品提取液總體積，mL；m為樣品質量，g。

1.3.6櫻桃番茄鈣含量的測定

鈣含量采用原子吸收分光光度法檢測[15]。稱取20～25 g果肉于培養(yǎng)皿中，在105 ℃烘箱中烘至恒重，研磨，稱取干物質0.50 g左右，加混合酸[m(硝酸)∶m(高氯酸)=4∶1]消化液20 mL。在調溫電爐上加熱消解至透明或略帶黃色，并蒸發(fā)至冒濃白煙，冷卻至室溫，用20 g/L氧化鑭溶液轉移至25 mL容量瓶中，定容至刻度。計算方法如式(5)。

(5)

式(5)中：w(Ca)為試樣中鈣質量分數，mg/100g；ρ(Ca)為測定用試樣液中鈣質量濃度，μg/mL；ρ0為試劑空白液中元素質量濃度，μg/mL；V為試樣定容體積，mL；f為稀釋倍數；m為試樣質量，g。

1.3.7番茄紅素的提取

番茄紅素含量參考Fish等[16]的方法測定。稱取2.0 g勻漿的番茄果肉置于用鋁箔包裝的錐形瓶中，加入25 mL含0.125 g二丁基羥基甲苯(BHT)的丙酮溶液，25 mL、95%的乙醇溶液，50 mL正己烷，避光振蕩1 h后，加入3 mL預冷的去離子水，繼續(xù)振蕩5 min。室溫下靜置5 min，分層后，取上清液干燥備用。

1.3.8番茄紅素的HPLC分析

標準曲線繪制：將番茄紅素標準樣品配制成10、20、40、60、80、100 μg/mL的梯度標準工作液，過0.22 μm濾膜。按色譜條件測定，以峰面積為橫坐標，以標準溶液質量濃度為縱坐標繪制標準曲線。

色譜條件：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，柱溫40 ℃，進樣量20 μL，流速1 mL/min；流動相A為乙腈，流動相B為乙醇；檢測波長450 nm和475 nm；等度洗脫，流動相A和B的體積比為3∶2。

取1 mg凍干的番茄紅素樣品，溶于1 mL流動相中，樣品過0.22 μm濾膜。測定條件同標準樣品。

1.3.9番茄紅素的核磁共振分析

取適量番茄紅素樣品用2 mL CDCl3溶解，避光攪拌均勻后離心(10 000 r/min，5 min，4 ℃)，重復2次，收集離心管中紅色疏水液體，過0.22 μm濾膜后立即進行核磁共振(NMR)分析[17]。

1.4 數據處理

實驗數據用Excel 2010，SPSS 20和GraphPad Prism 5軟件進行處理，結果表示為平均值±標準偏差。

2 結果與分析

2.1 超聲協同鈣浸漬對櫻桃番茄貯藏過程中理化品質的影響

超聲協同鈣浸漬對貯藏期間櫻桃番茄理化品質的影響情況見圖1。由圖1(a)可知，貯藏過程中，果實硬度呈現逐漸降低趨勢，且U+Ca組櫻桃番茄的硬度顯著高于CK組。貯藏第30天，U+Ca組櫻桃番茄的硬度(7.89 N)顯著高于CK(6.45 N)、U(6.83 N)和Ca組(7.48 N)。結果表明，超聲協同鈣浸漬技術能夠有效抑制貯藏期間果實硬度下降。超聲作用使得更多的Ca2+浸入到櫻桃番茄果肉組織中，Ca2+與細胞壁中的果膠發(fā)生交聯形成果膠酸鈣，強化了果實細胞壁結構[18]。圖1(b)結果顯示：U+Ca組褐變指數(BI)顯著低于CK和U組(25 d除外)，且在貯藏后期各處理組果實BI趨于穩(wěn)定。超聲協同鈣浸漬處理能夠有效抑制果實顏色變化，維持果實貯藏期間色澤穩(wěn)定。

不同大寫字母表示同一處理組在不同貯藏時間存在顯著差異(P<0.05)；不同小寫字母表示同一貯藏時間不同處理組之間存在顯著差異(P<0.05)。

由圖1(c)可見，櫻桃番茄貯藏期間失重率呈現上升趨勢，U+Ca組失重率顯著低于CK組。研究表明，Ca2+有助于維持細胞壁與細胞膜的完整性，同時鈣的浸入減小細胞間隙，增加水分遷移阻力，從而減緩水分損失[19]。由圖1(d)可見，櫻桃番茄從貯藏第10天開始腐爛，并在第30天腐爛率超過50%。從貯藏第15天開始，U+Ca組櫻桃番茄的腐爛率顯著低于CK、U和Ca組，主要由于超聲空化作用可殺滅果實表面的微生物，且乳酸鈣具有抑制病菌等微生物活性的作用[20-21]。

由圖1(e)可知，櫻桃番茄的可滴定酸(TA)在貯藏期間呈現先增加后降低的趨勢。儲藏前期(0～10 d)，果實應對環(huán)境變化進行無氧呼吸產生乳酸導致可滴定酸含量增加；中后期(15～30 d)，果實內有機酸作為呼吸底物被消耗，可滴定酸含量降低；貯藏末期(30 d)，U+Ca組櫻桃番茄TA含量(4.64%)顯著高于CK 和U組(3.94%和4.05%)。超聲協同鈣浸漬處理有效延緩了貯藏過程中TA含量的下降。對櫻桃番茄貯藏過程中維生素C[圖1(f)]含量的研究結果顯示：貯藏第30天，U+Ca組櫻桃番茄維生素C質量分數(2.85 mg/100g)顯著高于CK組(2.32 mg/100g)；與新鮮果實(CK0，4.24 mg/100g)相比，U+Ca組和CK組櫻桃番茄的維生素C保存率分別為67.21%和54.72%。

2.2 超聲協同鈣浸漬對櫻桃番茄貯藏過程中鈣含量的影響

超聲協同鈣浸漬技術對櫻桃番茄貯藏過程中鈣含量的影響，實驗結果如圖2。貯藏第0天，U+Ca組櫻桃番茄果實中鈣質量分數(184.36 mg/100g)顯著高于Ca、U和CK組(176.25、155.32 mg/100g和156.96 mg/100g)，超聲處理可以顯著促進鈣向果實內部的滲透。貯藏期間，各處理組果實鈣含量變化不顯著，但U+Ca和Ca組果實鈣含量顯著高于U和CK組，并對應于較高的果實硬度[圖1(a)]。在超聲作用下，更多的鈣離子滲透到果實組織，與果膠鏈中半乳糖醛酸上的羧基結合形成網絡結構，增加果膠穩(wěn)定性，維持和提高細胞壁的完整性和機械性能，進而抑制硬度的下降[22]。超聲協同鈣浸漬可以降低櫻桃番茄貯藏過程中細胞壁分解程度，較好保持細胞膜完整性，維持果實硬度。

不同大寫字母表示同一處理組在不同貯藏時間存在顯著差異(P<0.05)；不同小寫字母表示同一貯藏時間不同處理組之間存在顯著差異(P<0.05)。

2.3 超聲協同鈣浸漬對櫻桃番茄貯藏過程中番茄紅素含量的影響

超聲協同鈣浸漬對櫻桃番茄貯藏過程中番茄紅素含量的影響，實驗結果如圖3。由圖3可知，各處理組果實番茄紅素和全反式番茄紅素含量在貯藏第15天時均達到最大值。貯藏第0～5天，番茄紅素作為一種抗氧化劑，抵御果肉組織因冷藏產生的氧化應激，從而其含量下降；貯藏第10～15天，番茄紅素合成速率大于消耗速率，積累至最高水平；貯藏后期(15～30 d)，番茄紅素合成酶活性降低，組織內呼吸產生的活性氧不斷積累，使得番茄紅素不斷被消耗，導致其含量降低[23]。貯藏第20天起，CK 和U 組番茄紅素質量分數(0.87、1.40 mg/100g)顯著高于U+Ca和Ca組(0.76、0.67 mg/100g)。這可能是由于超聲協同鈣處理降低了與番茄紅素正相關的酶活性。全反式番茄紅素含量變化趨勢與總番茄紅素一致[圖3(b)]。超聲協同鈣浸漬處理對貯藏期間全反式番茄紅素含量無顯著影響。

不同大寫字母表示同一處理組在不同貯藏時間存在顯著差異(P<0.05)；不同小寫字母表示同一貯藏時間不同處理組之間存在顯著差異(P<0.05)。

2.4 超聲協同鈣浸漬對櫻桃番茄貯藏過程中番茄紅素結構特性的影響

櫻桃番茄貯藏前后番茄紅素1H NMR分析結果如圖4。由圖4(a)可知，番茄紅素標準品的碳碳雙鍵H原子化學位移主要在5.9～6.7，1.61～1.97，2.11和5.11處，分別是—CH3、—CH2和—CH的吸收峰[24-27]。H-8(5)與H-18(5)、H-10(9)與H-19(9)、H-12(13)與H-20(13)分別是5-順式番茄紅素、9-順式番茄紅素和13-順式番茄紅素特征化學鍵對應的H原子，可用于鑒別相對應的番茄紅素存在情況[25,28]。圖5為全反式番茄紅素、5-順式番茄紅素和9-順式番茄紅素的結構示意圖。由圖4(c)至圖4(f)可知，貯藏末期(第30天)，各處理組櫻桃番茄中，番茄紅素在化學位移為3.81和4.15處均出現較高的峰，3.81處是—OCH3的吸收峰，4.15處是—OH的吸收峰[24]。CK和U組[圖4(c)和圖4(d)]中無H-18、H-18(5)和H-10(9)的吸收峰。結果表明，貯藏末期(第30天)櫻桃番茄果實中的番茄紅素可能被氧化，產生新的氧化產物。貯藏第30天，U+Ca和Ca組存在H-18、H-18(5)和H-10(9)的吸收峰[圖4(e)和圖4(f)]，這可能與果實中保留較多的維生素C有關，維生素C清除部分游離羥自由基OH·，從而減輕番茄紅素氧化程度。

圖4 櫻桃番茄貯藏前后番茄紅素1H NMR譜

圖5 番茄紅素結構示意圖[25，27]

櫻桃番茄的番茄紅素1H NMR位移分析結果如表1。氫位移分析結果表明，番茄紅素標準品中含有全反式番茄紅素、5-順式番茄紅素和9-順式番茄紅素。櫻桃番茄新鮮樣品及貯藏第30天CK、U、Ca和U+Ca組番茄均含有全反式番茄紅素、5-順式番茄紅素和9-順式番茄紅素。貯藏第30天，CK和U組無H-18、H-18(5)和H-10(9)的化學位移，Ca和U+Ca組的化學位移完整，表明CK和U組中部分全反式番茄紅素、5-順式番茄紅素和9-順式番茄紅素被氧化，而U+Ca和Ca組中全反式番茄紅素、5-順式番茄紅素和9-順式番茄紅素的氧化程度較輕。研究結果表明，超聲波協同鈣浸漬技術能夠有效抑制番茄紅素及其異構體的氧化程度，維持其結構完整性。

表1 櫻桃番茄中番茄紅素1H NMR位移

櫻桃番茄番茄紅素13C NMR分析結果如圖6。番茄紅素的共軛雙鍵C原子化學位移在123.93～139.53，12.80～25.72處的吸收峰來自—CH3，26.67和40.23處的吸收峰來自番茄紅素中兩種不同環(huán)境的—CH2[24-27,29]。圖6(c)中，67.13處的峰對應的是—OCH2的吸收峰，圖6(d)、(e)、(f)中具有同樣的吸收峰，且無C-8、C-18和C-20吸收峰。結合1H NMR譜圖[圖4(c)至圖4(f)]，推測番茄紅素中C-8、C-18和C-20被氧化。本研究結果顯示，貯藏末期(第30天)櫻桃番茄果實中的番茄紅素部分被氧化，結構發(fā)生變化。

圖6 櫻桃番茄貯藏前后番茄紅素13C NMR譜

櫻桃番茄番茄紅素13C NMR位移分析結果如表2。C-8(5)與C-18(5)、C-10(9)與C-19(9)、C-12(13)與C-20(13)分別是5-順式番茄紅素、9-順式番茄紅素、13-順式番茄紅素的特征化學鍵對應的C原子[25,27]。不同于全反式番茄紅素，5-順式番茄紅素的C-8的位移向高場移動，C-18的位移向低場移動；9-順式番茄紅素的C-10的位移向高場移動，C-19的位移向低場移動。貯藏第30天，各處理組全反式番茄紅素C原子化學位移對應不完整，且13C NMR譜圖中出現含氧基團吸收峰[圖6(c)至圖6(f)]，但U+Ca和Ca組全反式番茄紅素H原子化學位移對應完整(表1)，且C-8和C-18、C-10和C-19符合移動規(guī)律。本研究表明，CK和U組中部分全反式番茄紅素、5-順式番茄紅素和9-順式番茄紅素受到氧化，而U+Ca和Ca組中全反式番茄紅素、5-順式番茄紅素和9-順式番茄紅素的氧化程度較輕，結構保留較完整。

表2 櫻桃番茄中番茄紅素13C NMR位移

貯藏初期，新鮮櫻桃番茄和各處理組櫻桃番茄中均含有全反式番茄紅素、5-順式番茄紅素和9-順式番茄紅素。貯藏過程中，櫻桃番茄發(fā)生一系列生理生化反應，番茄紅素的含量與結構也隨之變化。貯藏末期，CK和U組中番茄紅素被氧化，導致果實失去鮮艷色澤，褐變程度加深(圖1)。Ca和U+Ca組中番茄紅素氧化程度較低，U+Ca組保留了較多的維生素C(圖1)，有助于保護番茄紅素不被氧化；因此，U+Ca組番茄紅素氧化程度較低，結構保存較完整。本研究表明，超聲協同鈣浸漬能夠較好地保留櫻桃番茄全反式番茄紅素及其順式異構體的完整結構，抑制番茄紅素的氧化，從而維持櫻桃番茄品質。

3 結 論

超聲協同鈣浸漬處理可有效延緩櫻桃番茄貯藏期間硬度的下降，促進鈣離子向果實內部的滲透；同時可維持果實較高的可滴定酸和維生素C含量，并可抑制果實褐變指數、失重率和腐爛率的上升。與對照組相比，超聲協同鈣浸漬處理對櫻桃番茄全反式番茄紅素含量無顯著性影響。超聲協同鈣浸漬有效抑制了櫻桃番茄貯藏期間番茄紅素的氧化，可較好地維持全反式番茄紅素、5-順式番茄紅素和9-順式番茄紅素的結構完整性。超聲協同鈣浸漬技術可有效維持櫻桃番茄貯藏期間良好的品質特性。超聲協同鈣浸漬技術作為一種非熱果蔬保鮮技術，既具備安全、高效和節(jié)能等優(yōu)點，又對人體營養(yǎng)健康有增益作用。該技術是否適合除櫻桃番茄以外的水果，并大規(guī)模應用于實際的果蔬產業(yè)中有待進一步研究。