張 馨,馬苗苗,呂婉秋,LEE Joobin,楊靜莉

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040)

大青楊(Populusussuriensis)是我國(guó)東北地區(qū)營(yíng)造速生豐產(chǎn)林的主要樹(shù)種之一[1]。該樹(shù)種用途廣泛，其木材可供建筑、舟船、造紙業(yè)、家具用膠合板等使用，很多國(guó)家已將其列為重要工業(yè)用材樹(shù)種之一，并且大青楊也是恢復(fù)森林生態(tài)環(huán)境及短周期工業(yè)用材林最為理想的樹(shù)種[2]。該樹(shù)種喜光、耐寒、速生，且有極強(qiáng)的適應(yīng)能力，也因?yàn)槠淙菀壮苫畹忍攸c(diǎn)，被認(rèn)為是造林成效最顯著的樹(shù)種之一[3]。由于大青楊抗逆性強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快，木材積蓄積量大，所以是生產(chǎn)紙漿材的重要造林樹(shù)種[4]。近年來(lái)，由于氣候變化，干旱和高鹽等非生物脅迫已嚴(yán)重影響林木的生長(zhǎng)發(fā)育，其引起的林木死亡現(xiàn)象在世界各地頻繁發(fā)生[5]，所以提高樹(shù)木抗逆性相關(guān)問(wèn)題越來(lái)越受到人們的重視。目前，通過(guò)分子及基因組分析等方法已經(jīng)鑒定了很多植物響應(yīng)逆境脅迫的基因，包括調(diào)控脅迫誘導(dǎo)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TF)[6]。轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控下游復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)以響應(yīng)逆境脅迫的植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并從中發(fā)揮著重要作用[7]。

鋅指蛋白(zinc finger proteins，ZFP)是一類(lèi)含有鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白，是植物中最大的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族[8]。在真核生物中，鋅指蛋白屬于TF家族，具有高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)域[9]。ZFP可通過(guò)ZF結(jié)構(gòu)域與DNA、 RNA或其他調(diào)控元件相互作用[10]。根據(jù)半胱氨酸殘基和組氨酸殘基的數(shù)量和位置，鋅指蛋白可以分為C2H2、C2HC、C2HC5、C2C2、CCCH、C3HC4、C4、C4HC3、C6 和 C8等不同亞類(lèi)[11]。越來(lái)越多的研究表明，C2H2型鋅指蛋白在植物應(yīng)激反應(yīng)中起著非常重要的作用。很多與植物抗逆性相關(guān)的C2H2型鋅指蛋白已被鑒定[4]。目前，有關(guān)C2H2轉(zhuǎn)錄因子在植物中的功能研究主要局限于擬南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻(Oryzasativa)等模式植物中，在楊樹(shù)基因功能研究中鮮見(jiàn)。因此，后續(xù)的研究工作需進(jìn)一步探討ZFP基因家族在大青楊中的功能和作用機(jī)理。研究發(fā)現(xiàn)，矮牽牛 (Petuniahybrid) Zinc pyrithione Protein(ZPT)是植物界第一個(gè)被報(bào)道的C2H2型ZFP[12]。因此，C2H2型ZFP在植物中也被稱(chēng)為ZPT，通常有1～4個(gè)ZFs，而其含有2個(gè)C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域的ZPT2家族也可以說(shuō)是ZPT中最大的亞類(lèi)之一[13]。目前，很多研究已證實(shí)了ZPT2蛋白在植物響應(yīng)非生物脅迫的應(yīng)答過(guò)程中起至關(guān)重要的作用[14]。在不同的非生物脅迫處理下，水稻OsZFP182、OsZFP252、OsZFP245和OsZFP179等基因的表達(dá)水平都穩(wěn)定增加，這些基因的過(guò)表達(dá)也明顯改善了轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱性、耐寒性和耐鹽性[15]。其中OsZFP179參與植物體內(nèi)對(duì)鹽脅迫的應(yīng)答，OsZFP252響應(yīng)鹽和干旱，過(guò)表達(dá)OsZFP252可以提高水稻植株的脯氨酸和可溶性糖含量，而且鹽和干旱脅迫相關(guān)的應(yīng)答基因表達(dá)量都明顯上調(diào)[16]。甘薯(Dioscoreaesculenta)bZFP1基因通過(guò)參與調(diào)控ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脯氨酸合成及活性氧清除進(jìn)而增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)鹽脅迫與干旱脅迫的耐性[17]。目前研究最多的是屬C2H2 型鋅指蛋白，而C2H2 型鋅指家族的基因又可以分為Q、M、C和Z類(lèi)型[18-19]。其中，Q 型 C2H2 型鋅指家族的基因功能研究最多[20]。例如，ZFP245是水稻中Q型鋅指蛋白基因，過(guò)表達(dá)ZFP245通過(guò)調(diào)節(jié)脯氨酸含量和清除活性氧來(lái)提高水稻對(duì)低溫和干旱脅迫的耐受性[21]。ZFP179也屬于這類(lèi)基因，ZFP179的過(guò)表達(dá)顯著提高了水稻的耐鹽性[22]。以上研究表明，C2H2鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆性中起著重要作用，特別是在鹽脅迫和干旱脅迫下。本研究的PuZFP103屬于Q 型 C2H2 型鋅指家族的基因。

本試驗(yàn)以大青楊為材料克隆出PuZFP103基因，對(duì)其氨基酸序、保守結(jié)構(gòu)域等進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并利用(real time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)分析了PuZFP103在NaCl、PEG6000及脫落酸(abscisic acid,ABA)非生物脅迫處理下的表達(dá)特性，為進(jìn)一步明確PuZFP103響應(yīng)逆境的生物學(xué)功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗(yàn)材料取自東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的野生型大青楊，均采集于東北林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)。用升汞(HgCl2)和次氯酸鈉(NaClO)進(jìn)行消毒和擴(kuò)繁，并由植物組織培養(yǎng)獲得無(wú)菌大青楊，置于25 ℃組培室培養(yǎng)，培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基，光周期為16 h光照/8 h黑暗，待植株長(zhǎng)到8～10 cm選取同一無(wú)性系大青楊植株，用于以下試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大青楊RNA的提取及cDNA的合成

采用CTAB法提取3 周大的無(wú)菌大青楊的總RNA，使用南京諾唯贊生物生產(chǎn)的HiScript?Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) (www.vazyme.com)按照說(shuō)明書(shū)將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄成功的cDNA置于-20 ℃保存待用。

1.2.2 大青楊PuZFP103基因的克隆

本試驗(yàn)參照毛果楊(P.trichocarpa)基因組(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)序列對(duì)其中同源的一個(gè)成員進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)分析，并將其命名為PuZFP103。引物設(shè)計(jì)應(yīng)用NCBI引物設(shè)計(jì)在線(xiàn)網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nil.gov/tools/primer-blast)和Primer Premier 5.0軟件。在PuZFP103基因CDS序列兩端分別設(shè)計(jì)引物(正向引物為5′-ATGGATTTCCAACCAAACAC-3′以及反向引物為5′-AAGCCTTAAAGACAAATCTA-3′)，本試驗(yàn)所涉及的引物及測(cè)序均由哈爾濱擎科生物公司(www.tsinke.com)合成。以合成的cDNA為模板，使用北京全式金生物技術(shù)有限公司(www.transgen.com.cn)2×EasyTaqPCR SuperMix 克隆試劑盒進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系為：cDNA模版1 μL、正反向引物各1 μL、2×EasyTaqPCR SuperMix 10 μL、去離子水7 μL，反應(yīng)體系為20 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸2 min。該基因全長(zhǎng)共507 bp，經(jīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，將其產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將得到的目的條帶與DL 2000 DNA Marker對(duì)比，條帶單一，大小符合，為目的條帶。接下來(lái)使用購(gòu)自O(shè)MEGA公司(www.omegabiotek.com.cn)快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的條帶。將膠回收產(chǎn)物連接到PEASY-T1載體購(gòu)自中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司(taihegene.com)，置于恒溫培養(yǎng)箱25 ℃(購(gòu)自上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)，5 min連接，使用購(gòu)自O(shè)MEGA公司(www.omegabiotek.com.cn)核酸純化試劑盒將其純化。純化產(chǎn)物利用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，轉(zhuǎn)化完畢的菌液涂至含有濃度卡那霉素(Kan, Kanamyceticus)的LB固體培養(yǎng)基平板，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱恒溫過(guò)夜培養(yǎng)。第2 天早上挑取單克隆，用1 mL不加卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基搖菌后送到測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。保存測(cè)序成功的菌液并搖菌進(jìn)一步提取質(zhì)粒待用。

1.2.3 植物表達(dá)載體pBI121-PuZFP103-GFP的構(gòu)建

1)設(shè)計(jì)載體的雙酶切引物。通過(guò)分析楊樹(shù)PuZFP103基因全長(zhǎng)序列及pBI121-GFP載體圖譜設(shè)計(jì)本基因可用的雙酶切引物，筆者找到pBI121-GFP(載體來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室保存)載體圖譜的多克隆位點(diǎn)，從中找出該載體可用的全部酶切位點(diǎn)，再將楊樹(shù)PuZFP103基因全長(zhǎng)CDS序列輸入到BioEdit軟件中，找出不能用于該基因的酶切位點(diǎn)，最后排除兩者共有的酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切引物的設(shè)計(jì)。根據(jù)以上的設(shè)計(jì)原則本試驗(yàn)選取了兩個(gè)酶切位點(diǎn)分別是XbaI和SpeI酶切位點(diǎn)，正向雙酶切引物為5′-GCTCTAGAATGGATTTCCAACCAAACAC-3′;反向雙酶切引物為5′-GCACTAGTAAGCCTTAAAGACAAATCTA-3′。

2)目的基因PCR擴(kuò)增及膠回收。酶切引物合成后，以連接PEASY-T1-PuZFP103陽(yáng)性質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用2×EasyTaqPCR SuperMix 克隆試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸7 min。在120 V電壓下，電泳檢測(cè)目的條帶是否正確，若條帶正確則使用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)其進(jìn)行膠回收。

3)pBI121-GFP載體質(zhì)粒的提取。在無(wú)菌的150 mL小瓶中加入20 mL含50 mg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，再加入15 μL含pBI121-GFP質(zhì)粒的大腸桿菌菌液，放置于37 ℃搖床(購(gòu)自太倉(cāng)華利達(dá)，HZ9210K)上160 r/min震蕩培養(yǎng)12 h，使用購(gòu)自O(shè)MEGA公司(www.omegabiotek.com.cn)的質(zhì)粒小提試劑盒提取pBI121-GFP載體質(zhì)粒。

4)目的基因與載體的雙酶切反應(yīng)，純化及連接。將所要的膠回收產(chǎn)物和pBI121-GFP質(zhì)粒同時(shí)在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(購(gòu)自太倉(cāng)華利達(dá)，HZ9210K)內(nèi)進(jìn)行XbaI和SpeI雙酶切，內(nèi)切酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司(www.transgen.com.cn)，酶切體系如下: pBI121-GFP載體質(zhì)粒100 μL、PuZFP103膠回收產(chǎn)物(小于2 000 ng)、10×FlyCutBuffer 20 μL、XbaI 2 μL、SpeI 2 μL、ddH2O；共200 μL體系。雙酶切反應(yīng)條件為37 ℃，酶切反應(yīng)時(shí)間為3 h。最后使用核酸純化試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司(www.omegabiotek.com.cn)進(jìn)行純化。使用T4連接酶北京全式金生物技術(shù)有限公司(www.transgen.com.cn)將目的基因與載體在16 ℃恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜連接，連接體系為10 μL體系：PuZFP103基因XμL，pBI121-GFP載體(10-X) μL，5×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL、T4 DNA Ligase 1 μL、ddH2O；X滿(mǎn)足公式3×C1×X=C2×(10-X)，其中C1為pBI121-GFP質(zhì)粒純化后濃度，C2為目的片段純化后的濃度。

5)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化及PCR檢測(cè)。取過(guò)夜連接的連接產(chǎn)物通過(guò)熱激轉(zhuǎn)化法，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中(菌株來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室保存)，吸取500 μL無(wú)抗生素LB液體培養(yǎng)基于滅菌的1.5 mL的無(wú)菌離心管中，并置于37 ℃恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)1 h，1 h后將菌液置于離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf超高速冷凍離心機(jī))5 000 r/min，離心5 min，離心后棄去上清液，留取大約120 μL上清進(jìn)行菌體重懸，然后將菌液涂到含有50 mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板中，將燒過(guò)的無(wú)菌涂棒放涼后將菌液涂至平板。在37 ℃搖床中倒置過(guò)夜培養(yǎng)后，用無(wú)菌的鑷子夾取無(wú)菌的小槍頭挑取單克隆菌落至無(wú)抗液體LB中搖菌3 h，然后吸取菌液進(jìn)行菌液PCR及電泳檢測(cè)，并抽取500 μL陽(yáng)性菌液送去公司進(jìn)行測(cè)序，將剩余菌液中加入50%甘油按體積比1∶1充分混勻后放入液氮迅速冷凍后置于-80 ℃冰箱保存。測(cè)序比對(duì)正確后的菌液使用高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取PuZFP103-pBI121-GFP質(zhì)粒。

1.2.4PuZFP103基因生物信息學(xué)分析

利用ExPASy服務(wù)器中的Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)工具分析蛋白的理化性質(zhì)；通過(guò)軟件 Predictprotein (https://www.predictprotein.org/)預(yù)測(cè)C2H2編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用網(wǎng)站 Phyre 2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)對(duì)PuZFP103基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；根據(jù)ExPASy服務(wù)器中的ProtScale程序分析大青楊PubZFP103蛋白的疏水性；通過(guò)TMHMM Server v.2.0對(duì)蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析；使用SignalP 3.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)對(duì)蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；使用COILS Server(https://embnet.vital-it.ch/software/COILS_form.html)對(duì)蛋白卷曲螺旋預(yù)測(cè)分析；通過(guò)http://www.bio-soft.net/sms/index.html查詢(xún)?cè)摶虻耐春塑账峒鞍被嵝蛄?；NCBI在線(xiàn)預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域；通過(guò)http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)；通過(guò)http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl網(wǎng)址進(jìn)行氨基酸結(jié)構(gòu)比對(duì)；使用 BLAST軟件對(duì)氨基酸進(jìn)行同源性分析，以ZFP蛋白的氨基酸序列為基礎(chǔ)，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到具有較高大青楊ZFP同源性的其他物種的氨基酸序列進(jìn)行比較，然后使用MEGA 5.05軟件通過(guò)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.5 亞細(xì)胞定位

提取上述構(gòu)建好的瞬時(shí)表達(dá)載體pBI121-PuZFP103-GFP及對(duì)照載體pBI121-GFP質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒包裹金粉制備成pBI121-PuZFP103-GFP的DNA微彈及對(duì)照載體pBI121-GFP的DNA微彈。取新鮮洋蔥的倒數(shù)第2～4層鱗莖內(nèi)表皮，用干凈的手術(shù)刀切下面積為2 cm2的洋蔥塊，小心撕取其內(nèi)表皮，平鋪到MS培養(yǎng)基上，然后用基因槍(PDS-1000/He Particle Delivery)利用氮?dú)鈱?duì)洋蔥受體進(jìn)行轟擊。將轟擊后的洋蔥受體密封置于常溫暗處培養(yǎng)24 h，然后使用激光共聚焦微鏡(OlympusFV1000MPE)觀(guān)察亞細(xì)胞定位情況。

1.2.6 非生物脅迫處理取材

選取在無(wú)菌的1/2 MS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)3周，生長(zhǎng)良好且狀態(tài)一致的大青楊幼苗為研究對(duì)象，將其連根整株插入到添加200 mmol/L NaCl、200 μmol/L ABA及質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的聚乙二醇PEG6000的1/2 MS培養(yǎng)基條件下分別進(jìn)行脅迫處理3、6、12、24、48、72 h。處理后用液氮速凍材料并于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 RT-qPCR分析基因的表達(dá)模式

利用CTAB法分別提取脅迫處理前后的大青楊葉和根部位的總RNA，使用南京諾唯贊生物生產(chǎn)的HiScript?Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) 反轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模版，放置在-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｃ總€(gè)處理組均有0 h空白對(duì)照，F(xiàn)2R2為熒光定量引物F2：(5′-3′)ATCCTCTTCTTCTTCATCATC，R2；(5′-3′)GACGATCCTGACCGTGGG)；PtrActin-F PtrActin-R為內(nèi)參引物[PtrActin-F(5′-3′)：TGTTGCCCTTGACTATGAGCAGGA ;PtrActin-R(5′-3′)：CGGAATCTCTCAGCTCCAATGGT]。通過(guò)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)使用南京諾唯贊生物公司生產(chǎn)的ChamQTM Universal SYBR? qPCR Master Mix進(jìn)行RT-qPCR分析，每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)，用 2-ΔΔCt計(jì)算法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。RT-qPCR總反應(yīng)體系為20 μL： cDNA模版1 μL、正反向引物各1 μL、2×EasyTaqPCR SuperMix酶10 μL、去離子水7 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃，30 s，共45個(gè)循環(huán)；55～99 ℃每隔0.5 ℃讀板1次，持續(xù)1 s。

2 結(jié)果與分析

2.1 大青楊PuZFP103基因的克隆

以生長(zhǎng)3 周大的無(wú)菌大青楊為材料分別提取根和葉的總RNA。利用總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以2 000 marker為對(duì)照，擴(kuò)增該基因的CDS序列，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為504 bp(圖1)，片段大小與預(yù)期符合。

M．DNA marker DL 2000；1～3.PuZFP103克隆產(chǎn)物 PCR production of PuZFP103。圖1 PuZFP103基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The PCR amplication results of PuZFP103

2.2 大青楊PuZFP103基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 大青楊PuZFP103基因的DNA、蛋白序列分析及蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

通過(guò)在線(xiàn)查詢(xún)得知大青楊PuZFP103基因共編碼168 個(gè)氨基酸(圖2A)。利用ExPASy服務(wù)器中的Protparam工具分析蛋白的理化性質(zhì)，分析結(jié)果氨基酸的數(shù)量為168，分子質(zhì)量為18 673.64 u，理論等電子點(diǎn)為8.53，總原子數(shù)2 559，分子式為C800H1247N249O256S7。在組成蛋白的20種氨基酸中，絲氨酸(Ser)所占比例最高，占18.50%;色氨酸(Trp)所占比例最低，占0.60%，不包括含硒半胱氨酸(Sec)和吡咯賴(lài)氨酸(Pyl)。蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為69.35，不穩(wěn)定蛋白脂肪指數(shù)為59.23，總平均親水性為-0.531。正電荷殘基數(shù) (天冬氨酸Asp+谷氨酸Glu)為16。負(fù)電荷殘基數(shù) (精氨酸Arg+賴(lài)氨酸Lys)為18。此蛋白的親和性的平均水平 (GRAVY)為-0.756。利用Smart軟件對(duì)序列進(jìn)行分析(圖2B)，發(fā)現(xiàn)PuZFP103具有1個(gè)ZnF-C2H2結(jié)構(gòu)域，位于該氨基酸序列的43～65位，隸屬于C2H2家族。

圖2 PuZFP103基因序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列 (A)和PuZFP103蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)(B)Fig.2 Nucleotide and deduced polypeptide sequences of PuZFP103 (A)and conserverd domain prediction of PuZFP103 coded protein(B)

2.2.2 編碼蛋白的二三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

通過(guò)軟件 Predictprotein (https://www.predictprotein.org/)預(yù)測(cè)C2H2編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。經(jīng)網(wǎng)站分析該蛋白包含3種結(jié)構(gòu)分別為螺旋(helix)、折疊(strand)和無(wú)規(guī)則卷曲(loop)，分別占總氨基酸的 8.33%、5.95%和 85.71%(圖 3A)。利用網(wǎng)站 Phyre 2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)對(duì)PuZFP103基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，如圖(圖3B)所示PuZFP103基因編碼的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)與預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)相符，N端區(qū)域主要由α-螺旋和β-折疊組成，C端區(qū)域主要由無(wú)規(guī)則卷曲組成。

圖3 PuZFP103蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)(A)和 三級(jí)結(jié)構(gòu)(B)預(yù)測(cè)Fig.3 Protein secondary stucture (A) and tertiary structure (B)prediction of PuZFP103 protein

2.3 大青楊PuZFP103基因的理化特性

2.3.1 大青楊PuZFP103基因編碼的蛋白疏水性

大青楊PuZFP103基因編碼的蛋白疏水性根據(jù)ExPASy服務(wù)器中的ProtScale程序分析，計(jì)算基于K-D法的蛋白質(zhì)疏水性。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第145 位的氨基酸為絲氨酸，疏水性最大，分值為0.944；第87位的氨基酸為精氨酸，親水性最大，分值為-2.356。根據(jù)圖4中數(shù)據(jù)可以看出，負(fù)分?jǐn)?shù)的氨基酸數(shù)大于正分?jǐn)?shù)的氨基酸數(shù)，這說(shuō)明該蛋白的親水性大于疏水性，推測(cè)該蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)。

圖4 PuZFP103蛋白的疏水性預(yù)測(cè)Fig.4 Hydrophobicity analysis prediction PuZFP103protein

2.3.2 蛋白跨膜區(qū)分析

通過(guò)TMHMM Server v.2.0對(duì)蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析 (圖5)。發(fā)現(xiàn)該蛋白不存在跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)，并沒(méi)有典型的跨膜螺旋區(qū)，也沒(méi)有氨基酸位于細(xì)胞膜內(nèi)，參考該蛋白的疏水性區(qū)域分析結(jié)果，表明該蛋白并不是一個(gè)與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的膜受體蛋白。

圖5 PuZFP103蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)Fig.5 Protein transmembrane structure diagrams ofPuZFP103 protein

2.3.3 蛋白信號(hào)肽及蛋白卷曲螺旋預(yù)測(cè)分析

使用SignalP 3.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)對(duì)蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)N端沒(méi)有信號(hào)肽，預(yù)測(cè)為Non-secretory蛋白質(zhì)。該蛋白不存在信號(hào)肽序列，可以高效表達(dá)。使用COILS Server對(duì)蛋白卷曲螺旋預(yù)測(cè)分析，結(jié)果 (圖6)表明，3條曲線(xiàn)分別代表窗口系數(shù)(window width)為14、21、28時(shí)預(yù)測(cè)卷曲螺旋的位置。該軟件預(yù)測(cè)出1個(gè)卷曲螺旋。因?yàn)榫砬菪话阌?個(gè)氨基酸構(gòu)成，所以該選項(xiàng)都是7 的倍數(shù)。

圖6 PuZFP103蛋白的卷曲螺旋預(yù)測(cè)Fig.6 Coiled coils prediction of PuZFP103 protein

2.3.4 氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

通過(guò)在線(xiàn)比對(duì)氨基酸序列，將大青楊PuZFP103基因編碼的氨基酸序列與其他植物同源基因的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)(圖7)，結(jié)果顯示，大青楊PuZFP103與毛果楊、胡楊(P.euphratica)、毛白楊(P.tomentosa)和番木瓜(Caricapapaya)有較近的遺傳距離，所以預(yù)測(cè)他們有更近的親緣關(guān)系。而與可可(Theobromacacao)、錦葵(Malvacathagensis)、榴蓮(Duriozibethinus)遺傳距離較遠(yuǎn)，因此預(yù)測(cè)他們親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖7 大青楊PuZFP103基因與其他物種直系同源蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.7 The phylogenetic tree analysis of PuZFP103 gene in P. ussuriensis and homologous proteins inother species

2.4 大青楊PuZFP103基因的亞細(xì)胞定位

利用基因槍分別將金粉包裹的pBI121-PuZFP103-GFPDNA微彈質(zhì)粒和對(duì)照pBI121-GFPDNA微彈質(zhì)粒通過(guò)基因槍轟擊洋蔥內(nèi)表皮，使用激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察(圖8)。從圖8中可以看到對(duì)照組pBI121-GFP空載體在整個(gè)洋蔥細(xì)胞內(nèi)均能發(fā)綠色熒光，為組成型表達(dá)；pBI121-PuZFP103-GFP的融合表達(dá)載體在35S啟動(dòng)下PuZFP103-GFP只在細(xì)胞核中有熒光，這進(jìn)一步證明PuZFP103定位在細(xì)胞核中，具有轉(zhuǎn)錄因子的一般特征。

圖8 PuZFP103基因的亞細(xì)胞定位Fig.8 The subcellular localization analysis of the PuZFP103 gene

2.5 大青楊PuZFP103基因的表達(dá)模式分析

觀(guān)察在非生物脅迫下其不同時(shí)間和不同部位的PuZFP103基因表達(dá)量情況。在 NaCl、ABA和PEG 6000脅迫條件下，基因PuZFP103的表達(dá)量在根和葉中都較為明顯，結(jié)果如圖9所示。NaCl脅迫后PuZFP103基因在大青楊葉片中的表達(dá)量逐漸升高，脅迫6 h時(shí)的表達(dá)量最高，之后逐漸下降，在48 h又升高。而在大青楊根中表達(dá)量呈明顯的上升趨勢(shì)，脅迫3 h和24 h的表達(dá)量都很高(圖9A)，所以預(yù)測(cè)其可能在根中發(fā)揮作用。ABA脅迫后，PuZFP103基因在大青楊葉中的表達(dá)量在6 h之前是下降的，在12 h后逐漸升高，72 h時(shí)又降低，而在大青楊根中表達(dá)量只有在6 h時(shí)表達(dá)量最高，在其他時(shí)間點(diǎn)都是下調(diào)(圖9B)，因此預(yù)測(cè)ABA可能發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，有待進(jìn)一步研究確定該結(jié)果。PEG 6000脅迫后PuZFP103基因在大青楊的葉中的表達(dá)量在3 h之前的表達(dá)量是微微下調(diào)的，在6 h后逐漸升高，在24 h時(shí)表達(dá)量最高，而在根中表達(dá)量都比0 h高，在6 h時(shí)表達(dá)量升高近4.5 倍(圖9C)。

圖9 大青楊PuZFP103基因在NaCl ABA和PEG 6000處理下的表達(dá)量的分析Fig.9 The RT-qPCR analysis of the expression pattern of PuZFP103 gene in P. ussuriensisunder treatment of NaCl，ABA and PEG 6000

3 討 論

C2H2型鋅指蛋白是最常見(jiàn)的鋅指蛋白之一，在真核生物的生長(zhǎng)發(fā)育及應(yīng)對(duì)脅迫的響應(yīng)中起重要作用[23]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)植物C2H2型鋅指蛋白的研究明顯增多，發(fā)現(xiàn)了多種與植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆性相關(guān)的C2H2鋅指蛋白[24]。筆者從大青楊中克隆出PuZFP103基因，利用生物信息軟件對(duì)其進(jìn)行基因組分析以及基因功能的研究。分析結(jié)果表明，該基因包括有504 bp的CDS序列，共編碼168 個(gè)氨基酸。通過(guò)對(duì)PuZFP103氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該蛋白包括C2H2鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，預(yù)測(cè)該蛋白為親水性蛋白。對(duì)蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)N端沒(méi)有信號(hào)肽，為Non-secretory蛋白質(zhì)，該蛋白不存在信號(hào)肽序列，可以高效表達(dá)。同時(shí)對(duì)蛋白卷曲螺旋預(yù)測(cè)分析，檢測(cè)到1個(gè)卷曲螺旋。預(yù)測(cè)C2H2編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示螺旋結(jié)構(gòu)(helix)、折疊(strand)和無(wú)規(guī)則卷曲(loop)分別占總氨基酸的 8.33%、 5.95%和85.71%。此外，基于系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果，推測(cè)PuZFP103基因可能參與大青楊生長(zhǎng)發(fā)育與逆境響應(yīng)過(guò)程。因?yàn)橛醒芯勘砻?，與生長(zhǎng)發(fā)育或脅迫相關(guān)的ZFP蛋白物種在進(jìn)化樹(shù)分類(lèi)中能夠與大青楊聚為一個(gè)亞類(lèi)[25]。通過(guò)亞細(xì)胞定位分析，證明該基因位于細(xì)胞核中。這些生物信息學(xué)分析結(jié)果將為深入探究PuZFP103基因在大青楊中的功能奠定一定的理論基礎(chǔ)。

本研究對(duì)生長(zhǎng)狀態(tài)一致的大青楊分別進(jìn)行NaCl、PEG 6000及ABA非生物脅迫處理，探究其在不同組織和不同非生物脅迫下的表達(dá)特性。在激素與非生物脅迫應(yīng)答分析中， NaCl和PEG處理后，PuZFP103在葉片和根表達(dá)量主要呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，說(shuō)明該基因?qū)aCl和PEG 6000信號(hào)途徑主要呈現(xiàn)正響應(yīng)模式。通過(guò)ABA處理后，PuZFP103的根在6 h時(shí)基因表達(dá)量上調(diào)，其他時(shí)間點(diǎn)都下調(diào)的趨勢(shì)，在葉片中的表達(dá)量變化也不明顯，這說(shuō)明PuZFP103基因?qū)BA產(chǎn)生了應(yīng)答?？梢酝茰y(cè)，PuZFP103基因可能在大青楊適應(yīng)這3 種非生物脅迫因子過(guò)程中起重要作用。表明PuZFP103基因可能參與了大青楊對(duì)滲透脅迫的信號(hào)傳導(dǎo)，屬于逆境脅迫下的調(diào)控因子。大量研究表明，ZFP蛋白參與植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)過(guò)程[26]。甘薯中ZFP1經(jīng)ABA、PEG 6000和NaCl處理后表達(dá)量提高[27]。大豆(Glycinemax)中GsZFP1的表達(dá)在鹽、冷脅迫和ABA脅迫下在葉片中被誘導(dǎo)表達(dá)，在干旱、ABA和冷脅迫下在根部被誘導(dǎo)表達(dá)[28]。研究證明，馬鈴薯(Solanumtuberosum)的StZFP1可能通過(guò)ABA依賴(lài)途徑響應(yīng)鹽和干旱的脅迫，在擬南芥中 C2H2 型鋅指蛋白ZFP6通過(guò)整合植物激素信號(hào)從而調(diào)節(jié)毛狀體的初始化[29]。

筆者從大青楊中克隆出PuZFP103基因，并通過(guò)生物信息學(xué)、不同脅迫下的組織特異性及表達(dá)模式等分析預(yù)測(cè)基因結(jié)構(gòu)和功能。生物信息學(xué)和RT-qPCR分析結(jié)果初步證明PuZFP103基因可能在大青楊響應(yīng)脅迫過(guò)程中扮演重要角色，明確了其保守結(jié)構(gòu)域?yàn)閆nF C2H2，進(jìn)而明確了PuZFP103基因?qū)儆贑2H2家族亞類(lèi)基因，在激素與非生物脅迫應(yīng)答分析中，ZFP103基因均呈現(xiàn)出表達(dá)量的變化，說(shuō)明該基因可能參與了植物激素的應(yīng)答與脅迫響應(yīng)的過(guò)程。具有一定的抗旱和耐鹽等能力，但是關(guān)于其信號(hào)傳導(dǎo)與調(diào)控機(jī)制的研究需進(jìn)一步的研究。本研究可為大青楊ZFP103基因的功能研究及抗逆機(jī)制的深入研究提供理論基礎(chǔ)。