季 淮,韓建剛,李萍萍，朱詠莉,郭儼輝,郝達平,崔 皓

(1.南京林業(yè)大學生物與環(huán)境學院，江蘇 南京 210037；2.淮陰工學院生命科學與食品工程學院，江蘇 淮安 223003；3.南京林業(yè)大學，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；4.江蘇洪澤湖濕地生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站，江蘇 洪澤 223100；5.江蘇省水文水資源勘測局淮安分局，江蘇 淮安 223005)

濕地生態(tài)系統(tǒng)是生態(tài)系統(tǒng)中重要組成部分，水陸交界的環(huán)境促進各種元素快速循環(huán)轉(zhuǎn)化，尤其在全球碳循環(huán)中扮演重要角色[1-2]。濕地生態(tài)系統(tǒng)中土壤有機碳周轉(zhuǎn)變化引發(fā)碳源/匯的改變進而對全球氣候變化起重要影響[3],濕地植被類型對土壤有機碳周轉(zhuǎn)與穩(wěn)定的影響及其機制，已成為當前研究熱點[4-5]。土壤物理組分因其在外界環(huán)境變化中響應(yīng)明顯，且在表征土壤有機碳原狀結(jié)構(gòu)方面具有優(yōu)勢，被很多學者應(yīng)用于植被類型變化對土壤有機碳影響的研究中[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)，土壤小粒徑組分對有機碳的物理保護程度高于大粒徑土壤組分的，而土壤小粒徑組分中有機碳的化學結(jié)構(gòu)比大粒徑土壤組分的穩(wěn)定性更強[8]；當植被類型改變時會導致各粒徑組分土壤有機碳理化特征的變化[9-10]。另外，植被類型的變化同樣影響土壤內(nèi)微生物與環(huán)境間的物質(zhì)和能量交換，而研究微生物與土壤粒徑組分之間的關(guān)系，可以深入了解微生物在土壤有機碳變化過程中的作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，不同粒徑組分的化學組成與分解其中有機質(zhì)的微生物群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出顯著相關(guān)性[11]，而微生物既為土壤粒徑組分有機碳的聚合作用提供動力，又受土壤粒徑組分大小影響[12]。隨著高通量測序等基因技術(shù)在土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析中的運用，土壤樣品中微生物種群的差異可以進一步被揭示[13]。

目前，濕地自然植被與人工植被下各粒徑組分土壤有機碳含量與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)規(guī)律尚無定論[14]。洪澤湖是中國第四大淡水湖，淮河是其水量補給的主要來源[15]。洪澤湖與淮河交匯區(qū)位于暖溫帶與北亞熱帶的過渡地帶，有著特定的水文狀況和氣候條件，這對該區(qū)域濕地土壤的有機碳含量和組成及微生物群落結(jié)構(gòu)有一定影響。筆者研究該濕地不同植被覆蓋下土壤有機碳物理組分與微生物群落結(jié)構(gòu)的特征,分析植被覆蓋與土壤有機碳組成、微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系，為合理開發(fā)利用、恢復和保護濕地生態(tài)功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

洪澤湖位于江蘇省北部(118.453°～118.691°E,33.165°～33.187°N)，區(qū)域為季風氣候，日照率52%，年平均氣溫14.8 ℃，平均水溫15.6 ℃，年降水量926.7 mm。冬夏兩季水量變化大，變差系數(shù)達0.8。研究地點為洪澤湖河湖交匯區(qū)的淮河主河道入湖口，由于泥沙淤積，湖床不斷淤積抬高，形成了大面積的灘涂濕地[16]。研究區(qū)域灘涂濕地的植被類型(圖1)，由自然覆被類型的湖草(Carexspp.)灘、蘆葦(Phragmitescommunis)灘和人工柳樹(Salix×jangsuensis‘799’)林、歐美楊(Populuseuramevicana‘I -214’)林組成，其中楊樹、柳樹為當?shù)亓謭鲇?989—1991年將原來的自然覆被類型改造為模擬當?shù)氐湫椭脖挥珊騼?nèi)陸進行正向演替的人工林。

圖1 洪澤湖濕地植被類型下土壤的取樣位置Fig.1 The sampling location under different vegetation types in Hongze Lake Wetland

1.2 土樣采集與理化分析

于2018年12月25日(洪澤湖枯水期)進行采樣，在研究區(qū)域建立3個樣地，樣地之間相距5 km，每個樣地包括4種植被類型。每個植被類型均設(shè)大小為20 m×20 m 的樣方，各個樣方按照“S”形布點法，采用直徑50 mm柱狀土壤取樣器收集表層(0～20 cm)土壤，將樣本放入聚乙烯塑料袋中。取回的樣本當天盡快帶回實驗室，將土壤樣品置于 -80 ℃環(huán)境下保存。其后，各個樣方的樣本分別混合均勻，共得到12個樣品。每個樣品一部分用于化學指標測試和不同粒徑土壤組分的分離，并于室內(nèi)風干；還有一部分新鮮土壤保存于-80 ℃冰箱中用于土壤微生物DNA提取和微生物群落的測定。參照文獻[7]進行土壤理化指標測定，土壤總氮(TN)采用半微量凱氏定氮法[GB 7173—1987土壤全氮測定法(半微量開氏法)]測定，土壤有機碳(SOC)采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法(GB 9834—1988土壤有機質(zhì)測定法)測定；土壤pH采用電位法(HJ 962—2018土壤pH的測定電位法)測定；土壤電導率(EC)采用電極法(HJ 802—2016土壤電導率的測定電極法)測定；土壤含水量采用烘干法(NY/T52—1987土壤水分測定法)測定。

1.3 土壤粒徑組分分離及粒徑組分有機碳測定

不同粒徑土壤顆粒有機碳組分的分離，采用Stemmer等[17]的粒徑分離法。土壤粒徑組分主要根據(jù)土壤粒徑的大小按照< 2 μm、≥2～63 μm、≥63～200 μm、≥200～2 000 μm分組。稱取20 g風干土裝入100 mL干凈的離心管中，加80 mL超純水，充分混勻后靜置2 min，設(shè)重復5組。采用超聲波細胞粉碎儀將土壤不同粒徑分離，儀器參數(shù)設(shè)定為：超聲總時3 min，超聲1 s，間歇2 s，功率為45 W。待設(shè)定好參數(shù)，將變幅桿探頭(φ6)插入到懸濁液中，使探頭低于液面2 cm進行工作。土壤超聲粒徑分離完成后，將懸浮液過 200 μm 篩，用超純水沖洗留在篩面上的顆粒物，待過篩的沖洗液接近澄清，再將篩面上的土壤粒徑組分(≥200～2 000 μm)反沖洗到 1 L 的燒杯中。將反沖洗液移入100 mL 干凈離心管，離心轉(zhuǎn)速設(shè)置1 500 r/min共離心5 min，得到的土壤顆粒即為土壤粒徑≥200～2 000 μm 的組分。將剛過200 μm 篩面下的沖洗液繼續(xù)過63 μm篩，重復沖洗、反沖洗和離心等3個步驟，即可得到土壤粒徑 ≥63～200 μm 組分。再將剛過63 μm篩面下的沖洗液移入到100 mL 干凈離心管，離心轉(zhuǎn)速設(shè)置1 500 r/min離心5 min，離心得到的土壤顆粒即為土壤粒徑≥2～63 μm的組分。將離心后的懸浮液移入到新的離心管中，離心轉(zhuǎn)速設(shè)置5 000 r/min離心5 min，得到的土壤顆粒即為土壤粒徑< 2 μm的組分。分離出的組分經(jīng)過液氮冷凍干燥機冷凍貯存?zhèn)溆?。土壤不同粒徑組分有機碳的測定采用重鉻酸鉀滴定法(GB 9834—1988土壤有機質(zhì)測定法)。

1.4 細菌 16S rRNA、真菌ITS rRNA基因測序

從冰箱中取出10 g土壤樣品解凍，利用DNA提取試劑盒(D3096-01，Omega Inc.，USA)進行DNA提取。對16S RNA基因的V3-V4 高可變區(qū)片段和ITS rDNA基因序列的ITS1-ITS2片段進行 PCR擴增，引物序列分別為319F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)，806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)和fITS7(5′-GTGARTCATCGAATCTTTG-3′)，ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。每個樣本3個重復，同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測[18]。PCR產(chǎn)物送聯(lián)川生物技術(shù)公司進行測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013、SPSS 20.0、R for Window 3.5.1、MEV 2.0、CANOCO 5.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和多重比較(Duncan法，顯著性水平設(shè)置為0.05)比較不同數(shù)據(jù)組間的差異，采用聚類分析方法對微生物種間關(guān)系進行分析，采用冗余分析方法(redundancy analysis，RDA) 對微生物門類的豐度與各粒徑組分土壤有機碳分布及其他理化性質(zhì)之間的關(guān)系進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植被類型土壤性質(zhì)、有機碳含量及各粒徑組分有機碳分布特征

經(jīng)測定，洪澤湖濕地各植被類型下淺表層(0～10 cm)土壤基本理化性質(zhì)見表1。楊樹林和柳樹林土壤總有機碳、總氮含量均顯著高于湖草灘和蘆葦灘的(P<0.05)，楊樹林和柳樹林土壤含水率顯著低于湖草灘的(P<0.05)。

表1 洪澤湖濕地各植被類型下土壤(0～10 cm)理化性質(zhì)

不同植被類型下的土壤粒徑組分分布情況見表2?？梢钥闯?，各樣地土壤粒徑≥200～2 000 μm組分質(zhì)量分布最少(2.40%～5.34%)。土壤粒徑≥2～63 μm和≥63～200 μm組分質(zhì)量分布(分別為30.07%～41.47%，24.95%～46.77%)顯著高于其他粒徑組分。蘆葦灘土壤粒徑<2 μm組分質(zhì)量分布最少(15.64%)， 但土壤粒徑≥63～200 μm組分質(zhì)量分布(46.77%)顯著高于其他樣地?？傮w上，各樣地的土壤粒徑質(zhì)量分布的數(shù)值呈現(xiàn)兩頭小中間大趨勢。

經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)(圖2)，除土壤粒徑≥2～63 μm組分外，各植被類型下其他粒徑組分的有機碳含量大小順序基本為柳樹林>楊樹林>湖草灘>蘆葦灘(圖2A)。不同植被類型土壤總有機碳含量，楊樹林的(10.22 g/kg)和柳樹林的(10.05 g/kg)差異不顯著，但顯著高于湖草灘的(7.63 g/kg)和蘆葦灘的(4.64 g/kg)(表1)。土壤粒徑≥200～2 000 μm和<2 μm組分的有機碳含量(13.56～28.75 g/kg和11.46～25.84 g/kg)顯著高于土壤粒徑≥2～63 μm和≥63～200 μm的(3.12～6.00 g/kg和1.16～3.81 g/kg)。不同植被類型土壤粒徑組分有機碳的分布比例見圖2B,可以看出，粒徑<2 μm組分土壤有機碳的分布比例(48.95%～57.95%)顯著高于其他粒徑組分的。粒徑≥200～2 000 μm組分土壤有機碳的分布比例(8.76%～18.43%)低于其他粒徑組分的。楊樹林和柳樹林中粒徑<2 μm組分土壤有機碳分布比例均顯著高于湖草灘和蘆葦灘中的?？傮w來說，不同粒徑組分中有機碳分布比例隨粒徑的增加而降低。

表2 洪澤湖濕地各植被類型的各土壤粒徑組分質(zhì)量分布

不同大寫字母表示相同土壤粒徑組分不同植被類型比較差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示相同植被類型下不同土壤粒徑組分比較差異顯著(P<0.05)。Different uppercase letters indicate significant differences among soil particle size fractions under different vegetation types (P<0.05), and different lowercase letters indicate significant differences among different soil particle size fractions under the same vegetation type (P<0.05).圖2 洪澤湖濕地不同植被類型各粒徑組分土壤有機碳含量和分布Fig.2 The content and distribution of soil organic carbon in different particle-size fractions under different vegetation types in Hongze Lake Wetland

2.2 不同植被類型土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征

Alpha多樣性可以表示樣本中含有的物種數(shù)和物種多樣性，其中，Observed species 指數(shù)表示樣品中物種數(shù)量；Shannon 指數(shù)表示物種 Alpha多樣性，Shannon 值越大，說明樣本物種多樣性越高；Chaol 指數(shù)用于估算樣本中所含有的OTU 總數(shù)，反映了菌群豐度，Chaol越大說明物種越多。對不同植被類型測定發(fā)現(xiàn)(表3)，濕地土壤細菌群落的Observed species、Shannon和 Chaol指數(shù)大小均為：蘆葦灘>湖草灘>柳樹林>楊樹林。真菌群落中，湖草灘、蘆葦灘的Observed species和 Chaol指數(shù)顯著高于柳樹林、楊樹林的， Shannon指數(shù)大小為：蘆葦灘>湖草灘>柳樹林>楊樹林。

表3 洪澤湖濕地各植被類型土壤細菌/真菌Alpha多樣性

經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)，4個樣地土壤細菌分屬48個菌門，在樣品中所占比例大于1%的菌門共14個(圖3A)，除了楊樹土壤樣品，其他3個土壤樣品中細菌的變形菌門(Proteobacteria)是優(yōu)勢門類(31.72%～52.11%)。楊樹的酸桿菌門(Acidobacteria)在樣品中占更大比例，并成為優(yōu)勢門(35.99%)。蘆葦土壤樣品的酸桿菌門(Acidobacteria)(9.81%)明顯少于其他樣地的酸桿菌門。4個樣地土壤樣品中真菌樣品分屬10個門，常見真菌門(在樣品所占比例大于1%的真菌)共6個(圖3B)。其中，子囊菌門(Ascomycota)為絕對優(yōu)勢菌群(55.00%～57.30%)。擔子菌門(Basidiomycota)在湖草灘和蘆葦灘土壤中相對豐度分別為11.00%、18.80%，在柳樹林和楊樹林土壤中相對豐度分別為40.2%、39.35%，沿湖面至坡地呈增大趨勢。壺菌門(Chytridiomycota)在各植被類型的相對豐度依次為湖草灘(13.8%)，蘆葦灘(9.1%)，柳樹林(6.0%)和楊樹林(0.2%)，沿湖面至坡地呈現(xiàn)減少趨勢。壺菌門沿生態(tài)演替的趨勢從水到陸比例呈現(xiàn)從多到少的趨勢(1.1%～13.8%)。

圖3 洪澤湖濕地各植被類型土壤細菌/真菌群落門水平上的相對豐度Fig.3 The relative abundance of bacterial communities and fungal communities at Phylum levels underdifferent vegetation types in Hongze Lake Wetland

根據(jù)細菌、真菌樣本的菌門相對豐度表，將各分類水平相對豐度(>1%)的群落組成數(shù)據(jù)根據(jù)分類單元的豐度分布或樣本間的相似程度加以聚類，根據(jù)聚類結(jié)果對分類單元和樣本分別排序，并通過熱圖加以呈現(xiàn)。通過聚類，可以將高豐度和低豐度的分類單元加以區(qū)分，并以顏色梯度及相似程度來反映多個樣品在各分類水平上組成的相似性和差異性，結(jié)果如圖4所示。土壤細菌群落相似性系數(shù)最高的是湖草灘和蘆葦灘，與楊樹林細菌群落土壤細菌群落相似性較遠。真菌樣本的OTU通過聚類，結(jié)果顯示不同樣地土壤群落主要被分為兩大族群：湖草灘和蘆葦灘真菌群落自成一族群；楊樹林和柳樹林真菌群落聚為另一族群。說明與湖草灘和蘆葦灘土壤真菌群落相比，楊樹林和柳樹林土壤真菌群落結(jié)構(gòu)更為相似。

圖4 洪澤湖濕地各植被類型土壤細菌/真菌群落門水平上的聚類熱圖Fig.4 The heatmap of bacterial communities and fungal communities at Phylum levels under different vegetation types in Hongze Lake Wetland

2.3 不同植被類型土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)關(guān)系

為揭示洪澤湖濕地土壤微生物群落的影響因子,對洪澤湖濕地土壤微生物群落及土壤環(huán)境因子進行 RDA 排序分析，結(jié)果見圖5。細菌群落結(jié)構(gòu)及土壤環(huán)境因子的冗余分析(RDA)見圖5A，第1軸和第2軸分別解釋細菌群落結(jié)構(gòu)變異的81.9%和14.5%，兩軸累計解釋量達96.4%。結(jié)果表明，檢測的土壤環(huán)境因子能夠很好解釋土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的變化。Monte Carlo 檢驗分析發(fā)現(xiàn)，土壤粒徑<2 μm、≥2～63 μm、≥63～200 μm組分有機碳分布與細菌群落結(jié)構(gòu)分布呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與土壤含水率呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。圖5B顯示酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)主要受粒徑土壤<2 μm、≥2～63 μm、≥63～200 μm組分有機碳影響，受到土壤含水率負影響。豐度較高的變形菌門(Proteobacteria)受到土壤粒徑≥200～2 000 μm組分有機碳在全土中含量影響較大。

< 2 μm、 ≥2～63 μm、≥63～200 μm、≥200～2 000 μm代表各粒徑組分土壤有機碳分布。< 2 μm，≥2-63 μm，≥63-200 μm，≥200-2 000 μm indicate the distribution of soil organic carbon in different particle-size fraction.圖5 洪澤湖濕地土壤理化性質(zhì)與細菌群落結(jié)構(gòu)/真菌群落結(jié)構(gòu)的冗余分析Fig.5 The redundancy analysis between bacterial communities and fungal communities at Phylum levels and soil physicochemical property in Hongze Lake Wetland

真菌群落結(jié)構(gòu)及土壤環(huán)境因子的冗余分析(RDA)見圖5B。第1軸和第2軸分別解釋細菌群落結(jié)構(gòu)變異的89.4%和8.9%，兩軸累計解釋量達98.3%。結(jié)果表明，檢測的土壤環(huán)境因子能夠很好解釋土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的變化。Monte Carlo 檢驗分析發(fā)現(xiàn)，土壤粒徑<2 μm、≥2～63 μm、≥63～200 μm組分有機碳在全土中含量與真菌群落結(jié)構(gòu)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與土壤含水率呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。圖5B顯示擔子菌門(Basidiomycota)受到土壤粒徑<2 μm、≥2～63 μm、≥63～200 μm組分有機碳含量的影響較大，受土壤含水率負影響。

3 討 論

洪澤湖濕地湖草灘和蘆葦灘植被多為草本植物，根系分布在土壤表層，和草原比較相近，這與前人研究發(fā)現(xiàn)森林土壤通常含有比草原更豐富的土壤有機碳(SOC)的結(jié)論一致[19]。Jobbágy等[20]認為,根系分布會影響有機碳在土壤中的地下垂直分布，而地上的凋落物會最終影響土壤表面和表層有機碳的相對量。從洪澤湖濕地研究區(qū)立地條件來看，由于湖草灘和蘆葦灘受到水位波動的影響，草本植物凋落物被湖水沖走；楊樹與柳樹地表部分的凋落物高程相對高一些，所以凋落物不易被湖水沖走。這可能解釋了柳樹林和楊樹林中的表層土壤(0～20 cm)的有機碳含量比湖草灘和蘆葦灘土壤的更大的原因。一般情況下,有機碳將優(yōu)先向細顆粒中積累,當土壤中黏粒含量相對較低,且有機碳源又較豐富時,黏粒結(jié)合的有機碳的量達到飽和后,有機碳開始向較大顆粒中的積累增多[8,21]。這與前人的研究結(jié)論相似[22-23]。從成土過程來看，土地植被類型的改變在提高土壤有機碳含量同時,也改變了土壤有機碳在不同粒徑組分中的分布,這一結(jié)果可能導致楊樹林和柳樹林土壤不同粒徑組分質(zhì)量分布的變化[24]。

土壤豐富的有機碳可能促進幾種特定微生物的生長，這些特定微生物的大量生長將限制其他微生物的生長，導致了有機碳豐富的土壤中微生物的種類卻不一定多，物種多樣性較低[25]。還有研究表明有機碳資源的利用在微生物競爭狀態(tài)下，有機碳的增加更有利于對有機碳利用能力強的微生物種[26]。同時，土壤有機碳的積累，主要來自于難分解有機碳，可能是因為所積累的難分解有機碳很難被微生物所利用，而易分解有機碳引起微生物之間的競爭，而導致微生物多樣性降低[27]。由此推斷，有機碳含量并不是限制微生物群落多樣性的直接影響因素，而有機碳組分含量可能是微生物多樣性的限制因子。以往研究發(fā)現(xiàn)土壤含水量和有機碳含量是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因子[28-30]，許多研究均有類似的結(jié)果[25，31-32]。微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤含水率呈顯著負相關(guān)，分析其原因可能是樣地土壤含水量越大，其通透性越差，從而導致土壤微生物豐度降低[33]。Li等[34]研究發(fā)現(xiàn)當添加新的有機碳源時,酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)中微生物組群與有機碳含量有很好的關(guān)聯(lián)性，也可以解釋兩個菌門和<200 μm粒徑組分土壤有機碳正相關(guān)這一現(xiàn)象。在土壤含水量相對較低的情況下，土壤真菌數(shù)量會隨著土壤有機碳含量的增加而增加；當土壤含水率較高或淹水條件時，土壤含水率的增加才會抑制真菌的生長和繁殖[35-37]，可以解釋柳樹林、楊樹林的真菌中擔子菌門(Basidiomycota)豐度高于湖草灘和蘆葦灘的現(xiàn)象。從以上分析可以看出，粒徑<200 μm組分土壤有機碳可能對特定的優(yōu)勢微生物類群分布影響較大。

洪澤湖河湖交匯區(qū)經(jīng)過近30年的人工林種植，有機碳含量增加明顯，說明土地利用類型的改變對有機碳含量有較大影響。微生物的種類和多樣性并沒有隨著有機碳的增加而增多，由此可知，增加的有機碳只是增加了特定門類微生物的數(shù)量而未增加微生物門類。因此，今后還需要進一步研究各粒徑組分土壤有機碳含量及其有效性與粒徑組分上特定微生物類群的分布關(guān)系，深入分析濕地的植被變化對土壤有機碳的影響。