陳鳳,王曉雙,甘國渝,李燕麗,鄒家龍,李繼福

1.濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，荊州 434025； 2. 長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，荊州 434025；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部廢棄物肥料化利用重點實驗室，武漢 430070； 4. 荊州市荊州區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，荊州 434025

植物的生長發(fā)育需要各種營養(yǎng)元素，而磷素作為大量營養(yǎng)元素，對植物的生長和籽粒形成極為重要。由于土壤風(fēng)化強度大，南方稻田有效磷含量低，使得缺磷現(xiàn)象較為普遍[1]，因而磷肥投入就顯得尤為重要。隨著磷肥長期施用，土壤缺磷現(xiàn)象得到明顯遏制和改善。施用磷肥對農(nóng)作物的生長發(fā)育起著決定性作用。磷素通過復(fù)雜的地球生物化學(xué)過程，以各種形態(tài)存在于土壤顆粒和溶液中，磷的不同存在形態(tài)影響著土壤磷素的生物有效性[2]。土壤溶液中無機磷酸鹽可被植物根系直接吸收利用，而磷酸鐵鋁和閉蓄態(tài)磷難以被直接利用[3]。外源磷肥投入是影響土壤磷形態(tài)和轉(zhuǎn)化的重要驅(qū)動因子。黃晶[4]對長江流域水稻土磷素肥力與施用磷肥效果的研究發(fā)現(xiàn)長期施用磷肥后土壤全磷、有效磷含量呈增加趨勢。王海龍等[5]對小麥-玉米輪作7年連續(xù)觀測發(fā)現(xiàn)不施肥處理土壤全磷含量處于耗竭狀態(tài)，作物根系難以獲取足夠的磷素營養(yǎng)，隨著施磷量的增加，土壤全磷含量和有效磷含量顯著增加。同時，土壤類型差異也會對土壤磷含量和細菌群落多樣性產(chǎn)生影響[6]。此外，在林地方面的研究表明，海拔高度通過影響土壤有機質(zhì)含量顯著改變微生物的群落結(jié)構(gòu)，從而影響土壤磷的活化和循環(huán)[7]。

土壤磷組分含量不僅與土壤理化性質(zhì)有關(guān)，還受到土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的影響[8-9]。尤其是磷相關(guān)的土壤微生物參與各形態(tài)磷的生物地球化學(xué)演變，在維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性和多樣性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)前，施用磷肥對微生物群落組成結(jié)構(gòu)和多樣性影響的研究還沒有明確結(jié)論?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明增加磷肥投入可顯著提高土壤有效磷含量，進而改變土壤細菌和真菌群落組成，提高有益微生物的相對豐度并使其成為優(yōu)勢菌群[10]。Hu等[11]對砂壤土的研究表明，平衡施肥顯著提高土壤微生物生物量和功能多樣性。然而，Shi等[12]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過17 a梯度磷肥(0、17.5和35 kg/hm2)施用后，土壤細菌群落結(jié)構(gòu)并未發(fā)生顯著改變?？梢?，基于不同的試驗條件，獲得的研究結(jié)果也存在一定差異，其原因可能是土壤類型、施肥量，尤其土壤本底值(有效磷含量)不同所致。為此，本研究選擇低磷供應(yīng)水稻土為研究對象，探究低磷水平下，施用磷肥對土壤磷組分及其含量的影響，同時明確磷組分與微生物多樣性之間的關(guān)系，以期為水旱輪作區(qū)磷肥科學(xué)施用和土壤健康提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

長期定位田間試驗地位于湖北省荊州市荊州區(qū)川店鎮(zhèn)李場村(30°33′24″N，112°4′56″E，海拔52 m)，為河流沖積物發(fā)育形成的水稻土。2011年水稻季開始進行肥效田間試驗，采用一年兩熟的水稻-冬油菜輪作制度。試驗前，耕層(0～20 cm)土壤基本理化性質(zhì)為pH 6.4、全氮含量0.6 g/kg、堿解氮含量275.3 mg/kg、有機質(zhì)含量28.8 g/kg、有效磷含量4.44 mg/kg、速效鉀含量96.6 mg/kg和緩效鉀含量為528.2 mg/kg[13]。本研究設(shè)置2個處理，即﹙1﹚NK(-P)和(2)NPK(+P)處理，各處理3次重復(fù)，小區(qū)面積20 m2，采用完全隨機區(qū)組排列。除處理(1)不施磷肥外，作物每季養(yǎng)分施用量均按當(dāng)?shù)赝扑]用量，即：N 180 kg/hm2、P2O590 kg/hm2和K2O 120 kg/hm2，其中油菜季補施硼肥15 kg/hm2。肥料種類為尿素(46% N)、過磷酸鈣(12% P2O5)、氯化鉀(60% K2O)和硼砂(11% B)。具體用量和施用方法為：水稻季分3次施用氮肥，比例為基肥∶蘗肥∶穗肥=2∶1∶1；磷肥和鉀肥在水稻移栽前一次性基施。冬油菜季分3次施用氮肥，比例為基肥∶越冬肥∶蕾薹肥=3∶1∶1；磷肥、鉀肥和硼肥在油菜移栽前一次性基施[14]，其他田間管理均按當(dāng)?shù)刈顑?yōu)方式進行。

1.2 土壤磷組分劃分與測定

2019年5月冬油菜收獲后，按照S型采樣法采集各小區(qū)0～10、10～20、20～30和30～40 cm土層樣品，混勻后按“四分法”取1 kg帶回實驗室，風(fēng)干備用。土壤有效磷、全磷、有機磷按常規(guī)分析方法進行測定；采用化學(xué)連續(xù)提取法測定土壤樣品中各種形態(tài)無機磷含量[15]，土壤無機磷分鋁磷(Al-P)、鐵磷(Fe-P)、閉蓄態(tài)磷(O-P)和鈣磷(Ca-P)4組。

1.3 土壤DNA提取及高通量測序

油菜收獲時，采用強力土壤DNA分離試劑盒(MoBio Laboratories，Carlsbad，CA，USA)對表層(0～10 cm)鮮土進行DNA的提取。先將表層3 cm土壤剔除避免腐解物、雜質(zhì)等干擾，然后采集3～10 cm土樣，每個樣品做3次重復(fù)。采用1.2%瓊脂糖凝膠檢測樣品DNA的長度和完整性，利用NanoDrop紫外分光光度計(Thermo Scientific，NC2000)檢測DNA的濃度和純度。用無菌水將DNA稀釋至1 ng/μL，以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物對細菌16S rRNA V3-V4和真菌18S rRNA ITS1區(qū)域進行擴增。對應(yīng)引物：16S V3-V4區(qū)引物(338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′；806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)和18S ITS1區(qū)引物(1737F：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′；2043R：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。目標條帶膠回收純化后進行文庫構(gòu)建，利用Illumina-MiSeqPE 250二代測序平臺(上海派諾森生物科技股份有限公司)進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測序原始數(shù)據(jù)去除引物接頭序列及各樣本低質(zhì)量的堿基后進行拼接處理，得到每個樣本的有效序列數(shù)據(jù)庫。之后，以97%為劃定閾值，對16S和18S序列進行可操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)劃分。采用QIIME軟件，調(diào)用UCLUST序列比對工具按97%的序列相似度進行聚類，并選取每個OTU度最高的序列作為該OUT的代表序列。針對細菌16S rRNA和真菌18S rRNA分別采用Greengenes數(shù)據(jù)庫和Silva數(shù)據(jù)庫作為OUT分類地位鑒定的模板序列。

試驗數(shù)據(jù)均采用MS Excel 2016進行處理和作圖，LSD法檢驗P=0.05水平的差異顯著性。利用R軟件vegan工具包以主要優(yōu)勢微生物群落相對豐度作為響應(yīng)變量、土壤0～10 cm土層磷形態(tài)及無機磷組分含量作為解釋變量進行冗余分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 施用磷肥對土壤磷形態(tài)的影響

表1顯示長期施用磷肥可不同程度地改變土壤各形態(tài)磷含量。對照(-P)0～10、10～20、20～30和30～40 cm土層的總磷含量分別為593.4、495.8、406.1和272.8 mg/kg，施用磷肥(+P)后，各土層總磷含量分別增加213.1、206.0、34.6和15.4 mg/kg，增幅依次分別為35.9%、41.5%、8.5%和5.6%。同樣，對于土壤無機磷含量，對照組0～10、10～20、20～30和30～40 cm土層無機磷含量分別為439.8、385.7、310.9和245.2 mg/kg；施用磷肥后各土層無機磷含量分別增加209.9、183.2、35.1和11.3 mg/kg，增幅分別為47.7%、47.5%、11.3%和4.6%。對照組0～10、10～20、20～30和30～40 cm土層有效磷含量分別為3.7、2.9、3.7和3.3 mg/kg，長期施入含磷肥料后，各土層有效磷含量分別增加3.3、3.1、1.6和1.7 mg/kg，增幅分別為90.3%、107.4%、44.4%和50.1%。對土壤有機磷含量進行分析發(fā)現(xiàn)，對照組0～10、10～20、20～30和30～40 cm土層有機磷含量分別為153.6、110.1、95.2和27.6 mg/kg，通過施用磷肥后，各土層有機磷含量分別增加3.3、22.8、-0.5和4.2 mg/kg，增幅為2.2%、20.7%、-0.5%和14.9%，表明長期施用磷肥下各土層有機磷變化規(guī)律不明顯，且20～30 cm土層有機磷含量有減少趨勢。

從表1可知，對照組和處理組中各磷形態(tài)變化明顯。土壤各形態(tài)磷含量不僅受到施肥影響還與耕作深度有關(guān)。長期施用磷肥可顯著提高0～10 cm和10～20 cm土層磷含量，對20～30 cm和30～40 cm底層處理間影響差異不明顯。

表1 不同處理有機磷、無機磷、總磷和有效磷含量 Table 1 Contents of organic P,inorganic P,total P and available P with different treatments

2.2 施用磷肥對土壤無機磷組分的影響

長期施用含磷肥料，土壤無機磷各組分含量均發(fā)生變化(表2)。耕層土壤各組分磷含量測定結(jié)果顯示，變幅較大的是鐵磷和閉蓄態(tài)磷含量，而鋁磷和鈣磷變化較??；對底層土壤各組分磷含量分析發(fā)現(xiàn)，施用磷肥對土壤中各無機磷組分含量的影響不大。對照組0～10、10～20、20～30和30～40 cm的Ca-P(鈣磷)含量分別為17.0、12.1、8.9和6.0 mg/kg，施磷后各土層Ca-P含量分別增加3.3、3.9、0.8和1.3 mg/kg，增幅分別為19.2%、32.7%、8.5%和21.5%。同樣，對照組0～10、10～20、20～30和30～40 cm的Fe-P(鐵磷)含量分別為34.0、32.8、30.2和27.6 mg/kg，施用磷肥后各土層Fe-P含量分別增加72.9、45.8、21.5和0.6 mg/kg，增幅分別為214.4%、139.7%、70.8%和2.3%。對照組0～10、10～20、20～30和30～40 cm的Al-P含量分別為2.9、1.2、1.7和2.7 mg/kg，而長期向土壤施用磷肥后，各土層Al-P含量分別增加4.9、2.3、2.2和0.2 mg/kg，增幅為164.5%、188.8%、129.9%和6.2%。與對照相比，施用磷肥后各土層O-P含量分別增加128.8、131.1、10.7和9.2 mg/kg，增幅分別為33.4%、38.6%、4.0%和4.4%。

不同施肥處理下無機磷組分占無機磷總量的相對含量見表3，從表3可知，長期施用磷肥使耕層土壤無機磷組分中Fe-P和Al-P比例增加，而使Ca-P和O-P相對相對含量減少。對照組耕層0～10 cm和10～20 cm的無機磷組分中Fe-P占比為7.7%和8.5%，而施用磷肥后，各土層的Fe-P比例分別提高112.7%和62.5%。對照組0～10 cm和10～20 cm耕層的無機磷組分中Al-P相對含量分別為0.7%和0.3%，施用磷肥后，各土層的Al-P相對含量分別增加了0.5%和0.3%，增幅為79.1%和95.8%。對照組0～10 cm和10～20 cm耕層的無機磷組分中Ca-P比例分別為3.9%和3.1%，施用磷肥后，各土層Ca-P相對量分別減少0.7%和0.3%，減幅為19.3%和10.0%。對照組0～10 cm和10～20 cm耕層無機磷組分中O-P相對量分別為87.7%和88.1%，施用磷肥后，各土層Ca-P相對量分別減少8.5%和5.4%，減幅為9.7%和6.1%。因此，在4種不同無機磷組分中閉蓄態(tài)磷占比最高，其次是鐵磷和鈣磷，而鋁磷占比最低。

表2 不同施肥處理無機磷組分含量 Table 2 Contents of various inorganic P fraction with P fertilizer application mg/kg

表3 不同施肥處理無機磷組分相對含量 Table 3 Proportions of various inorganic P fraction with P fertilizer application %

2.3 施用磷肥對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

1)OTU劃分和分類地位鑒定。由圖1可知，對于細菌和真菌而言，對照樣本中門(Phylum)、綱(Class)、目(Order)、科(Family)、屬(Genus)和種(Species)各分類水平的OTU數(shù)均高于長期施用磷肥樣本。對于細菌，對照樣本門、綱、目、科、屬和種的OTU數(shù)量分別為3 291、3 180、2 326、1 451、908和112，而長期施用磷肥樣本OTU數(shù)則分別減少171、182、267、305、206和20，減幅分別為5.2%、5.7%、11.5%、21.0%、22.7%和17.9%。對于真菌，對照樣本門、綱、目、科、屬和種各分類水平的OTU數(shù)量分別為383、346、343、256、271和211，長期施用磷肥樣本中OTU數(shù)量分別減少46、47、52、26、35和32，減幅分別為12.0%、13.6%、15.2%、10.2%、12.9%和15.2%。這表明與對照相比，長期施用磷肥會降低細菌和真菌的群落數(shù)量。

圖1 OTU劃分和分類地位鑒定

2)土壤微生物群落豐富度及Alpha多樣性分析。稀釋曲線能反映樣品文庫測序數(shù)據(jù)量的合理性。由圖2可知對照組和處理組的稀釋曲線均平緩，表明當(dāng)前測序深度已足夠反映樣本所包含微生物多樣性，繼續(xù)增加測序深度只會檢測到少量的新OTUs，對結(jié)果沒有顯著影響，說明測序數(shù)據(jù)量合理、可用。

Chao1和ACE指數(shù)更加能夠體現(xiàn)微生物的群落豐富度，而Shannon和Simpson指數(shù)更加能夠體現(xiàn)微生物的群落多樣性。長期施用磷肥會使土壤細菌和真菌群落豐富度和多樣性降低(表4)。其中，施用磷肥對土壤細菌Chao1和Shannon影響最為顯著(3 687.7、3 571.7和10.27、9.95)，降幅分別為3.1%和3.1%；對土壤真菌Chao1和ACE影響最為顯著(492.8、435.7和495.1、442.1)，降幅分別為11.6%和10.7%。

圖2 OTUs稀疏曲線

表4 菌群Alpha多樣性指數(shù) Table 4 Alpha diversity of soil samples

3)土壤微生物群落組成特征。試驗結(jié)果(圖3)顯示，相比施用磷肥，長期磷素缺乏引起耕層細菌和真菌物種數(shù)量在各分類單元顯著增加。細菌群落中屬、科、目水平的微生物類群和豐富度較高。真菌群落中種、屬、科水平的微生物類群和豐富度較高。對照組細菌群落中門、綱、目、科、屬和種水平的微生物類群數(shù)量分別為35、89、151、187、237和51。而長期施用磷肥，細菌群落中門、綱、目、科、屬和種水平的微生物種群減少3、10、9、22、53和5，降幅為8.6%、11.2%、6.0%、11.8%、22.4%和9.8%。同樣地，對照組真菌群落中綱、目、科、屬和種水平的微生物種群分別為26、64、99、127和122；而長期施用磷肥后，真菌群落中綱、目、科、屬和種水平微生物種群量分別減少2、6、10、4和7，降幅依次為7.7%、9.4%、10.1%、3.1%和5.7%。

圖3 各分類水平上微生物種類分布

圖4結(jié)果顯示，從門分類水平上，兩處理細菌中綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)相對豐度最高，屬優(yōu)勢菌群，平均占總量的32.4%、27.7%和17.0%，其次是Patescibacteria、己科河菌門(Rokubacterial)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、放線菌門(Actinobacterial)和疣微菌門(Verrucomicrobia)等相對豐度較高，平均占比為4.0%、3.5%、3.0%、2.5%和2.3%；真菌中子囊菌門(Ascomycota)、Rozellomycota和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)相對豐度最高，屬優(yōu)勢菌群，平均占比為58.2%、14.3%和6.7%。與對照相比，施用磷肥后細菌中綠彎菌門、酸桿菌門、己科河菌門、Latescibacteria和硝化螺旋菌門(Nitrospirae)相對豐度增加，而其他菌群相對豐度減少；真菌中子囊菌門、Mucoromycota和Basidiobolomycota相對豐度減少，而其他菌群相對豐度增加?？傊?，長期施用磷肥會顯著改變門分類水平下土壤中細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)分布和豐度。

圖4 細菌和真菌門水平上的相對豐度

圖5結(jié)果顯示，從屬水平上看各菌群相對豐度均較低。細菌和真菌群落中，對照和處理中Unidentified(未鑒定物種)和Others(其他物種)相對豐度均最高，這表明細菌和真菌屬中還未鑒定和分類的菌群數(shù)較多。對照組細菌屬中CandidatusUdaeobacter、CandidatusSolibacter和芽單胞菌屬(Gemmatimonas)相對豐度較高，占比分別為2.1%、1.5%和1.2%；長期施用磷肥后，其相對豐度分別降至0.7%、1.4%和0.7%。對照組真菌屬中支頂孢屬(Acremonium)、Cookeina和Camarophyllus相對豐度較高，占比分別為17.8%、7.7%和1.5%，而施用磷肥后，各屬相對豐度依次分別降至0.4%、0.3%和0.1%。這表明長期施用磷肥會使土壤中細菌和真菌在屬分類水平上的豐度有不同程度的改變。

2.4 土壤菌群群落與土壤磷組分之間的關(guān)系

選擇冗余分析(RDA)考察不同處理微生物群落豐度與土壤磷組分之間的相關(guān)性。從圖6可以看出，對照和施磷土壤主要微生物菌群在二維排序中彼此分離明顯，說明施磷造成土壤主要微生物群落的分化(蒙特卡羅檢驗P=0.016*)。無機磷組分中Ca-P與細菌群落分布相關(guān)性最大，其次是O-P、Fe-P和Al-P；Fe-P與真菌群落分布相關(guān)性最大，其次是O-P、Ca-P和Al-P。對于各形態(tài)磷來說，有機磷和總磷與細菌群落分布相關(guān)性最大，其次是有機磷和有效磷。有效磷與真菌群落分布相關(guān)性最大，其次是無機磷、總磷和有機磷。

無機磷組分與優(yōu)勢細菌群落相關(guān)性結(jié)果顯示，硝化螺旋菌門與Al-P、Fe-P、O-P和Ca-P之間呈正相關(guān)，且相關(guān)性依此減小。綠彎菌門、酸桿菌門與Ca-P、O-P、Fe-P和Al-P之間呈正相關(guān)，且相關(guān)性依此減小。Gem、Ver、Act、Pat和Pro均與Ca-P、O-P、Fe-P和Al-P之間呈負相關(guān)。各形態(tài)磷含量與優(yōu)勢細菌群落相關(guān)性表明，硝化螺旋菌門、綠彎菌門和酸桿菌門與有效磷、總磷、無機磷及有機磷含量均呈正相關(guān)。Gem、Ver、Act、Pat和Pro與有機磷正相關(guān)，與無機磷、總磷及有效磷呈負相關(guān)。無機磷與優(yōu)勢真菌群落相關(guān)性結(jié)果顯示，Asc與Ca-P、O-P、Fe-P和Al-P呈負相關(guān)；Roz、Olp、Bas、Mor、Muc和Zoo與Ca-P、O-P、Fe-P和Al-P呈正相關(guān)。各形態(tài)磷含量與優(yōu)勢真菌群落相關(guān)結(jié)果顯示，Asc與有效磷、總磷、無機磷及有機磷呈負相關(guān)；而Roz、Olp、Bas、Mor、Muc和Zoo與有效磷、總磷、無機磷及有機磷呈正相關(guān)。

3 討 論

3.1 長期施用磷肥對土壤各形態(tài)磷含量的影響

磷是植株生長必需的大量元素之一，主要來自土壤磷和磷肥。土壤磷素可分為有機磷和無機磷，其中無機磷占土壤磷總量的60%～80%[16]，是植物磷素吸收的主要來源。磷肥施入農(nóng)田后易被土壤中的Fe、Ca等元素固定，因此，磷肥的當(dāng)季利用率一般僅為10%～25%[17]。土壤中磷素形態(tài)決定磷素的生物有效性[18]，而土壤中不同形態(tài)無機磷對植物有效性存在差異。已有研究表明長期施用磷肥，土壤全磷、無機磷均有不同程度的累積，而不施用磷肥土壤全磷、無機磷處于耗竭狀態(tài)，二者趨勢一致[19]。本研究中，長期施用磷肥與對照土壤中各形態(tài)磷含量有明顯差異。對照土壤的全磷、無機磷及有效磷含量顯著低于施磷處理，這在其他長期定位試驗中也得到相似結(jié)論[20-21]。有研究表明，施磷可顯著增加土壤有效磷含量，這是由于施用磷肥時，土壤中所含總磷增加，雖然大部分磷肥會經(jīng)過轉(zhuǎn)化變成不能被植物吸收利用的難溶磷形態(tài)，但仍會有部分磷素本身具有有效性，易溶或者微溶于土壤溶液中，這一部分就會被作物直接吸收利用[22]。施磷對土壤有機磷含量影響不顯著，除10～20 cm土層有機磷含量提高20.7%，這可能與微生物總量及其固定的磷有關(guān)。長期施用磷肥不僅會影響土壤磷素形態(tài)和含量變化，也會影響土壤中磷的垂直分布。對土壤剖面研究發(fā)現(xiàn)底層土壤磷素含量低于表層土壤，表現(xiàn)為磷素含量隨土層的增加而逐漸降低。長期施用磷肥可顯著提高0～10 cm和10～20 cm土層磷含量，對于底層20～30 cm和30～40 cm處理間差異不明顯。單艷紅等[23]研究發(fā)現(xiàn)水稻田施用磷肥會導(dǎo)致0～25 cm土層無機磷含量顯著增加。楊學(xué)云等[24]在西北地區(qū)的長期(12 a)定位試驗也表明施肥顯著提高了0～20 cm土層全磷和速效磷含量。

圖5 細菌和真菌屬水平上的相對豐度

Chl： 綠彎菌門 Chloroflexi； Aci：酸桿菌門 Acidobacteria； Pro：變形菌門 Proteobacteria； Pat：Patescibacteria； Ver：疣微菌門 Verrucomicrobia； Gem：芽單胞菌門 Gemmatimonadetes； Act：放線菌門 Actinobacteria； Nit：硝化螺旋菌門 Nitrospirae； Asc：子囊菌門 Ascomycota； Roz：Rozellomycota； Olp：Olpidiomycota； Bas：擔(dān)子菌門 Basidiomycota；Mor：Mortierellomycota； Zoo：Zoopagomycota； Muc：Mucoromycota．

此外，本研究發(fā)現(xiàn)長期施用磷肥對土壤無機磷組分有顯著影響。各處理中O-P占比最高，約為79.2%～88.1%。其次是Fe-P、Ca-P，而Al-P相對含量最小，僅占0.3%～1.2%。土壤磷組分之間存在一定程度的相互制約，土壤有效磷含量取決于無機磷組分的分布規(guī)律和轉(zhuǎn)化特征。本研究結(jié)果顯示，土壤無機磷組分含量由高到低順序為O-P> Fe-P>Ca-P>Al-P。長期施用磷肥后無機磷各組分含量均有所增加，尤其對耕層鐵磷和閉蓄態(tài)磷含量影響最為顯著，其次是鋁磷和鈣磷。施用磷肥對底層土壤中各無機磷組分含量影響不明顯。施用磷肥使Fe-P和Al-P相對含量增加，而Ca-P和O-P相對含量減少。原因可能是施用肥料后作物長勢較好，將會從土壤中吸收更多有效磷，而無機磷中Ca-P是最易被作物吸收的組分；肥料中會有一些Fe、Al等金屬離子或者有機螯合物，會將土壤中相對有效的磷素(Ca2-P和Ca8-P)吸附。所以，土壤中Fe-P和A1-P會隨著施用磷肥而顯著增加。閉蓄態(tài)磷是由鐵、鋁氧化物膠膜所包裹的磷酸鐵和磷酸鋁，主要存在于高度分化的強酸性和酸性土壤中，占土壤無機磷的80%以上；而在北方黃土中僅占10%～20%，可見，對于南方稻田土壤，如何提高閉蓄態(tài)磷的生物有效性是今后提高土壤供磷水平的主要研究方向之一[25]。

3.2 長期施用磷肥對土壤微生物多樣性的影響

土壤磷組分含量與土壤本底微生物群落和代謝功能密切相關(guān)[8-9]。目前，關(guān)于長期施肥對微生物群落影響的研究不太多，報道的結(jié)果也不盡一致。以往有研究表明，長期施用磷肥導(dǎo)致土壤細菌多樣性升高[26-27]，原因是施用磷肥會提高土壤有效磷含量，一方面可以直接提供微生物磷營養(yǎng)，另一方面促進植物生長，增加根系分泌物，進而提高根際土壤微生物的豐度和多樣性。本研究結(jié)果與之有些差別，本研究中細菌群落的α-多樣性隨著磷肥的施入而呈降低趨勢，造成這種現(xiàn)象的原因可能是本試驗地的本底全氮含量較低，施加磷肥后土壤N/P比例的下降造成微生物生物量減少，從而使細菌多樣性降低[28]。Islam等[29]對長期施肥(53 a)水稻土的研究結(jié)果表明，增施NPK肥對微生物活性影響較小，NPK處理的生物多樣性指數(shù)也較小，這可能與該試驗田耕作歷史悠久，本底土壤肥力較高有關(guān)。真菌α-多樣性變化與細菌相似，He等[30]發(fā)現(xiàn)在我國西南高原草甸土中連續(xù)施用磷肥后，真菌群落的α-多樣性指標顯著降低。同時，Liu等[31]通過研究發(fā)現(xiàn)紅壤中施用磷肥后真菌群落的α-多樣性指標顯著降低?？梢?，施用磷肥改變了土壤有效磷含量，進而影響到真菌α-多樣性。

磷肥施入改變了細菌和真菌的群落組成和結(jié)構(gòu)。在細菌門水平上，綠彎菌門、酸桿菌門和硝化螺旋菌門相對豐度隨著磷肥施入而逐漸升高；而變形菌門、芽單胞菌門、放線菌門和疣微菌門相對豐度則隨著磷肥施入有所降低。綠彎菌門相對豐度增加和Francioli等[32]的研究一致。酸桿細菌通常被歸類為緩慢生長的寡養(yǎng)生物[33]，長期[34]和短期[35]研究均發(fā)現(xiàn)，它們的豐度隨著施氮量的增加而顯著下降。疣微菌門為寡營養(yǎng)型細菌，適宜在養(yǎng)分有效性低的環(huán)境中生長。富營養(yǎng)型的變形菌門[36]在施用磷肥后相對豐度降低，這和馬壘等[37]的研究一致，未施磷肥土壤中低的pH可能更適宜變形菌門生長。放線菌門含量降低，這和張煥軍等[38]研究一致，這可能與土壤類型和種植方式有關(guān)，使得微生物對施肥的響應(yīng)不同。

在真菌門水平上，擔(dān)子菌門和子囊菌門為優(yōu)勢菌門，子囊菌門是真核生物中最多樣化和最普遍的門之一，它們是有機基質(zhì)(如木材、落葉和糞便)的重要分解者。已有研究顯示子囊菌門是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中主要的真菌門類[39]。然而，擔(dān)子菌門在森林中降解高木質(zhì)素含量的植物凋落物方面特別重要，但它們在農(nóng)業(yè)種植系統(tǒng)中的豐度可能較低。此外，從本研究結(jié)果可以看出，細菌和真菌相對豐度高的屬多與總磷、有效磷、無機磷呈負相關(guān)，而與有機磷含量呈正相關(guān)，這表明缺磷有助于提高土壤微生物多樣性和物種數(shù)量；而磷肥供應(yīng)充足后，有機磷含量則可能是土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的主要限制因子，這方面的研究還有待進一步深入和證實。