李司棋，楊秋紅，何緒剛，劉永濤，董靖，楊移斌，胥寧，艾曉輝，劉紹春

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所/湖北省水產(chǎn)品質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢430223；3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100141；4.岳陽(yáng)漁美康生物科技有限公司，岳陽(yáng) 414000

吡蟲啉是國(guó)內(nèi)近年發(fā)展最快的新煙堿類(neonicotinoid)殺蟲劑，可防治多種抗性害蟲，作用效果持久高效，殺蟲譜廣，毒性低，殘留少，尤其對(duì)刺吸式口器害蟲具有特殊作用，并具有很大的發(fā)展?jié)摿1]。新煙堿類殺蟲劑是除擬除蟲菊酯以外市場(chǎng)占有率增長(zhǎng)最快的殺蟲劑[2]。研究表明，只有約1%的農(nóng)藥作用于目標(biāo)生物。其余的一部分殘留在土壤中，和土壤形成結(jié)合殘留態(tài)，結(jié)合殘留量一般占使用量的20%～70%[3]，還有一部分間接進(jìn)入水環(huán)境，進(jìn)而影響土壤生物和水生生物[4]。

農(nóng)藥給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)危害的事件屢見(jiàn)不鮮。1962年在日本北海道，由于在稻田中使用五氯酚鈉，一次有超過(guò)9萬(wàn)t的魚被毒死[5]。在中國(guó)，也發(fā)生過(guò)由于飛機(jī)噴藥不當(dāng)，大量魚蝦類死亡的事故。此外，相關(guān)研究也證實(shí)了吡蟲啉對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物生理生化和抗氧化系統(tǒng)具有潛在的危害，如熱帶魚類條紋鯪脂鯉(Prochiloduslineatus)在吡蟲啉質(zhì)量濃度為1 250 μg/L暴露120 h抗氧化酶會(huì)產(chǎn)生反應(yīng)，出現(xiàn)血糖降低和DNA損傷[6]；稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)暴露在2.0 mg/L吡蟲啉中也出現(xiàn)了氧化應(yīng)激和遺傳損傷，紅細(xì)胞發(fā)生明顯變化，免疫應(yīng)答降低[7]。吡蟲啉對(duì)沼蝦48 h LC50<1.0 mg/L，參照農(nóng)藥對(duì)魚類的毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，吡蟲啉對(duì)蝦類屬于高毒農(nóng)藥[8]。隨著克氏原鰲蝦產(chǎn)業(yè)的火熱升溫和稻漁綜合種養(yǎng)模式的推廣[9]，農(nóng)藥在稻漁綜合種養(yǎng)模式下使用頻率的增加，水-底泥-克氏原螯蝦中的殘留問(wèn)題也越來(lái)越多地引起關(guān)注[10]。筆者通過(guò)室內(nèi)暴露試驗(yàn)以及室外田間殘留消除試驗(yàn)，研究吡蟲啉在克氏原鰲蝦中的富集和殘留消除情況，以期評(píng)價(jià)吡蟲啉對(duì)克氏原鰲蝦的安全性，為制定合理的農(nóng)藥控制技術(shù)提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試 劑

60%吡蟲啉懸浮劑(有效成分為300 g/L，中國(guó)農(nóng)科院植保所廊坊農(nóng)藥中試廠)；吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.8%)(德國(guó) Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司)；乙酸、乙腈、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯(色譜純；美國(guó)CNW公司)；C18粉、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、石墨化炭黑粉(GCB) (博納艾杰爾科技公司)；超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm，美國(guó)Millipore公司)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)所用的克氏原鰲蝦(Procambarusclarkii)購(gòu)于湖北省荊州市沙市農(nóng)場(chǎng)洪塘分場(chǎng)，體質(zhì)量(17.31±0.89) g，在試驗(yàn)前，將其置于玻璃水族箱中馴養(yǎng)一段時(shí)間，試驗(yàn)用水為充分曝氣的自來(lái)水，并持續(xù)供氧，水溫(19.7±0.24) ℃，溶氧為(7.22±0.11) mg/L，每天換水并投喂飼料。選擇健康完整的克氏原螯蝦進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)前1 d停止喂食，試驗(yàn)過(guò)程中不再喂食。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與采樣

1)室內(nèi)暴露試驗(yàn)。選取吡蟲啉質(zhì)量濃度0.2 mg/L(參考鄭嵐等[11]施藥的推薦劑量)為試驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)置空白組。試驗(yàn)過(guò)程采用靜水藥浴的方法，吡蟲啉質(zhì)量濃度由60%吡蟲啉懸浮劑(有效成分為300 g/L)稀釋配制而成。空白組分別采集肌肉、血淋巴、鰓組織、腸道、肝胰臟等組織測(cè)定吡蟲啉的含量，檢測(cè)值均為空白，之后開始暴露試驗(yàn)。暴露試驗(yàn)在50 cm×35 cm×30 cm水族箱中進(jìn)行，每箱放10只克氏原鰲蝦，設(shè)置水溫在(20±1) ℃，測(cè)得水體pH 6.68±0.18，溶氧為(7.32±0.21) mg/L。

暴露后的第2、4、6、8、12、24、48、72、96、120、144小時(shí)分別從試驗(yàn)組隨機(jī)取18只克氏原鰲蝦，6只為1個(gè)平行，先用純凈水沖洗蝦體表面殘余藥物，再用干凈的紗布吸取蝦體表面水分，采集肌肉、血淋巴、鰓組織、腸道、肝胰臟等組織測(cè)定吡蟲啉的含量。肌肉、肝胰臟、血淋巴取樣方法參考岳剛毅[12]的方法，腸道從尾部抽出[13]，取出適量鰓組織，剔除附著物，用濾紙吸干表面水分。樣品在正式處理之前都置于-20 ℃冰箱保存。同時(shí)在0、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120、144 h從試驗(yàn)組采集水樣500 mL進(jìn)行前處理。

2)田間殘留消除試驗(yàn)。 試驗(yàn)地點(diǎn)在湖北省應(yīng)城市稻蝦養(yǎng)殖示范基地，圍取長(zhǎng)寬高5 m×4 m×0.2 m種植水草的水田，四周壘梗作為試驗(yàn)區(qū)域。60%吡蟲啉懸浮劑以0.2 mg/L(參考鄭嵐等[11]施藥的推薦劑量)用量均勻噴霧，分別于施藥后0.083、0.5、1、2、3、4、5、6、7、14、21、28 d采集樣品，克氏原鰲蝦樣品采集方法和采集組織同本文材料與方法“1.3”中“1)”。同時(shí)采集水樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)平行，每個(gè)水樣不少于500 mL，裝入棕色樣品瓶中，-4 ℃保存。底泥按照上述時(shí)間點(diǎn)采集，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)平行，每個(gè)樣品不少于200 g，貯于-20 ℃低溫冰柜內(nèi)保存。試驗(yàn)期間水溫在8～26 ℃，水體pH 7.28±0.20，溶氧為(7.13±0.18) mg/L。

1.4 液相色譜-質(zhì)譜條件

液相色譜柱：Symmetry C18柱(100 mm×2.1 mm×3.5 μm，美國(guó)Waters公司)；柱溫：40 ℃；流速為300 μL/min；流動(dòng)相A：80%甲醇，B：20%水，進(jìn)樣量為10 μL。

質(zhì)譜離子源：加熱大氣壓電噴霧HESI；離子化模式：正離子模式；掃描方式：選擇離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(SRM)；噴霧電壓：3 500 V；蒸發(fā)氣溫度：200 ℃；鞘氣和輔助氣均為高純氮?dú)?，壓力均?00 kPa；碰撞氣為高純氬氣，200 Pa；離子傳輸毛細(xì)管溫度：350 ℃；一級(jí)質(zhì)譜掃描(Q1 )半峰寬： 0.7 ku，三級(jí)質(zhì)譜掃描(Q3 )半峰寬： 0.7 ku。

1.5 樣品提取和凈化

克氏原鰲蝦組織、水樣、底泥樣品的前處理方法參考筆者所在研究室已發(fā)表文獻(xiàn)[10]。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解制得質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，避光貯存在4 ℃冰箱；根據(jù)需要用流動(dòng)相稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、2.0、5.0、10.0 μg/L的一系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

取空白克氏原螯蝦樣品按照本文“1.5”進(jìn)行處理，定容得到空白樣品溶液，然后用空白樣品溶液稀釋吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制吡蟲啉質(zhì)量濃度為0.2～50.0 μg/L一系列范圍的空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍和檢出限

以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定結(jié)果表明，吡蟲啉在質(zhì)量濃度為0.2～50.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)≥0.990 4。以信噪比S/N=3確定方法的檢出限、信噪比S/N=10確定方法的定量限具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 吡蟲啉的檢出限、定量限、線性范圍和線性方程 Table 1 Linear range,regression equation,limit of detection(LOD) and limit of quantification(LOQ) of imidacloprid

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

通過(guò)比較基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率值來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，比值越接近1，基質(zhì)效應(yīng)越小，比值越遠(yuǎn)離1，基質(zhì)效應(yīng)越大?；|(zhì)效應(yīng)小，溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線可直接用于定量分析；基質(zhì)效應(yīng)較大，為了消除基質(zhì)效應(yīng)，采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。試驗(yàn)結(jié)果表明，吡蟲啉在克氏原螯蝦肌肉、血淋巴、鰓組織、腸道、肝胰臟的基質(zhì)比率分別為0.42、1.07、1.01、1.03、0.67，其中肌肉和肝胰臟基質(zhì)效應(yīng)較大。

2.3 回收率的測(cè)定

取已制備好的克氏原螯蝦、水樣和底泥的空白樣品，分別在樣品中添加低、中、高濃度的吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品各5份，按本文“1.5”方法進(jìn)行樣品提取和凈化，測(cè)定樣品回收率。結(jié)果表明，吡蟲啉在克氏原鰲蝦樣品中的平均添加回收率為62.64%～104.79%，變異系數(shù)為1.15%～11.93%，吡蟲啉在水樣中的平均添加回收率為88.29%～110.42%，變異系數(shù)為2.16%～3.25%，吡蟲啉在底泥中的平均添加回收率為89.38%～116.60%，變異系數(shù)為2.05%～7.51%，表明該方法的準(zhǔn)確度和精確度能滿足農(nóng)藥殘留測(cè)定的要求。

2.4 吡蟲啉在室內(nèi)試驗(yàn)下的富集情況

1) 吡蟲啉在克氏原鰲蝦體內(nèi)的富集情況。由表2可知，吡蟲啉在推薦使用的質(zhì)量濃度下，肌肉的富集曲線呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在推薦使用質(zhì)量濃度下暴露的前6 h中，吡蟲啉的累積含量上升速率較平緩，然后呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并在24 h達(dá)到最大累積量101.09 μg/kg。肝胰臟的富集曲線與肌肉相似，推薦使用濃度下暴露12 h之前，吡蟲啉在肝胰臟的富集量都呈現(xiàn)平穩(wěn)上升狀態(tài)，72 h達(dá)到最大累積量36.00 μg/kg，然后下降?？耸显椢r的鰓組織對(duì)吡蟲啉的富集與其他組織相比要迅速很多，最大累積時(shí)間較其他器官提前許多，并且累積量也高出許多。這是因?yàn)轹w是克氏原鰲蝦的重要呼吸器官，是與外界進(jìn)行氣體交換的重要器官。鰓組織在第2小時(shí)吡蟲啉的含量為37.20 μg/kg，后面呈現(xiàn)階梯式上升，并在48 h達(dá)到最大值110.97 μg/kg，隨后又下降穩(wěn)定在一定濃度水平。腸道和血淋巴的富集曲線較簡(jiǎn)單，暴露農(nóng)藥的前24 h，都呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，腸道和血淋巴在24 h吡蟲啉的累積量達(dá)到最大，分別是80.72 、81.43 μg/kg。但不同的是，24 h之后，吡蟲啉在腸道中吡蟲啉的含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)，而考慮到血淋巴和腸道分別作為克氏原鰲蝦的循環(huán)和消化器官，腸道能將部分毒物排出，而血淋巴可將部分毒物隨血液流動(dòng)緩慢釋放到機(jī)體其他組織。吡蟲啉在克氏原鰲蝦中的累積量表現(xiàn)為鰓組織>肌肉>血淋巴>腸道>肝胰臟。

表2 吡蟲啉在克氏原鰲蝦體內(nèi)各組織的富集情況 Table 2 Enrichment of imidacloprid in various tissues of Procambarus clarkii

2) 吡蟲啉在水體中的富集消除情況。在推薦使用濃度下，水體中吡蟲啉的含量隨著時(shí)間的推移，呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)，暴露144 h，水體中吡蟲啉的含量下降到103.42 μg/L。

表3 吡蟲啉在水體中的富集消除情況 Table 3 Enrichment and elimination of imidacloprid in water

2.5 吡蟲啉在稻蝦綜合種養(yǎng)模式下的殘留消除情況

1) 吡蟲啉在克氏原鰲蝦中的殘留消除情況。如表4所示，按推薦使用濃度施藥吡蟲啉之后，吡蟲啉在肌肉中的消解動(dòng)態(tài)呈現(xiàn)波動(dòng)式的下降趨勢(shì)，施藥后的2、14 d，吡蟲啉在肌肉中達(dá)到了較高的累積量(84.93、74.81 μg/kg)。14 d之后隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì)，28 d降至20.44 μg/kg。吡蟲啉在鰓組織的消解動(dòng)態(tài)，整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，28 d降至1.28 μg/kg。吡蟲啉在血淋巴和腸道中的消解動(dòng)態(tài)相似，施藥后都呈現(xiàn)波動(dòng)式的上升趨勢(shì)，分別在6 d和4 d達(dá)到最大累積量27.64、33.13 μg/kg，之后逐步下降。而吡蟲啉在肝胰臟中的累積含量一直不高，呈現(xiàn)波動(dòng)式的輕微增長(zhǎng)，施藥28 d后肝臟中吡蟲啉的含量?jī)H為0.75 μg/kg。吡蟲啉在克氏原鰲蝦中的累積量表現(xiàn)為肌肉>腸道>鰓組織>血淋巴>肝胰臟。

2) 吡蟲啉在稻田底泥和水中的殘留消除情況。如表5所示，吡蟲啉在稻田底泥中的降解呈現(xiàn)梯度式的下降趨勢(shì)，在施藥后的第28天，降到10.94 μg/kg。吡蟲啉在稻田水中呈現(xiàn)逐步消解的趨勢(shì)，吡蟲啉在水中的降解速度較快，施藥后28 d，吡蟲啉降解率為97.54%。

表4 吡蟲啉在克氏原鰲蝦中的殘留消除情況 Table 4 Elimination of imidacloprid residues in Procambarus clarki

表5 吡蟲啉在稻田底泥和水中的殘留消除情況 Table 5 Elimination of imidacloprid residues in paddy mud and water

3 討 論

室內(nèi)暴露試驗(yàn)結(jié)果表明，克氏原鰲蝦暴露在推薦使用濃度下，吡蟲啉的濃度在水溶液中緩慢下降，而吡蟲啉在克氏原鰲蝦各組織的累積量表現(xiàn)為鰓組織>肌肉>血淋巴>腸道>肝胰臟，這與趙冬冬[14]的研究不同，其試驗(yàn)結(jié)果顯示氯氰菊酯在鯽體內(nèi)的生物富集系數(shù)為鰓>肝臟>肌肉，而有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱在魚、蟹組織器官中富集，富集量表現(xiàn)為肝臟>鰓>肌肉[15]。魚類富集有機(jī)氯農(nóng)藥的主要途徑之一是通過(guò)鰓膜從水中吸收[16]，另一種是通過(guò)腸道攝食富集[17]。本試驗(yàn)證實(shí)了鰓富集途徑，克氏原鰲蝦的鰓組織直接暴露在水體，沒(méi)有途徑或方式對(duì)吡蟲啉進(jìn)行排泄和轉(zhuǎn)化，而且密切接觸農(nóng)藥，所以對(duì)吡蟲啉的累積量最大。肝胰臟和肌肉組織表現(xiàn)出相似的累積趨勢(shì)，是因?yàn)楦闻K具有代謝功能，能夠?qū)w內(nèi)外各種藥物、毒物和體內(nèi)某些代謝產(chǎn)物等非營(yíng)養(yǎng)性物質(zhì)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。毒物經(jīng)過(guò)生物轉(zhuǎn)化和新陳代謝，可以轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)毒或毒性較小易于排泄的物質(zhì)排出體外。而肌肉里面含有一些種類的代謝相關(guān)酶，當(dāng)吡蟲啉剛剛進(jìn)入肌肉組織時(shí)，就產(chǎn)生應(yīng)激脅迫，會(huì)將吡蟲啉分解為小分子物質(zhì)或者低毒的其他代謝物。大量試驗(yàn)證明，當(dāng)蝦類暴露在毒液中一段時(shí)間后，對(duì)肝胰臟、鰓組織、腸道、肌肉等實(shí)質(zhì)性器官都會(huì)產(chǎn)生毒性作用[18]。肝臟通常是受影響最大、最嚴(yán)重的器官；鰓則因其表面積大且與外界直接接觸，易受到有毒物質(zhì)的侵入和攻擊，損傷的鰓組織會(huì)破壞離子調(diào)節(jié)功能，從而降低氣體交換效率。所以，本試驗(yàn)通過(guò)室內(nèi)暴露試驗(yàn)研究吡蟲啉在克氏原鰲蝦各組織的累積情況，為吡蟲啉田間試驗(yàn)做了一定的鋪墊。

而室外殘留消除試驗(yàn)結(jié)果表明，吡蟲啉在克氏原鰲蝦中的累積量表現(xiàn)為肌肉>腸道>鰓組織>血淋巴>肝胰臟。吡蟲啉在肌肉中的總累積量最大，這與室內(nèi)的暴露試驗(yàn)結(jié)果有一定差異，一方面田間試驗(yàn)處于室外的大環(huán)境下，受天氣溫度影響比較大，另外一方面室外試驗(yàn)與室內(nèi)試驗(yàn)的模擬環(huán)境不同，室外有水草底泥作為克氏原鰲蝦的依附，室內(nèi)試驗(yàn)克氏原螯蝦完全暴露在吡蟲啉毒液中。以推薦使用的質(zhì)量濃度施灑吡蟲啉后，第28天克氏原鰲蝦中肌肉的殘留量為20.44 μg/kg，低于美國(guó)規(guī)定吡蟲啉在魚類等水產(chǎn)品中的最大殘留限量(0.05 mg/kg)[19]。日本規(guī)定吡蟲啉在雞、牛、豬等哺乳動(dòng)物的最高殘留限量為0.02～0.3 mg/kg，但是大量文獻(xiàn)表明吡蟲啉對(duì)哺乳動(dòng)物低毒，而對(duì)水產(chǎn)品毒性較大[20-21]。所以，應(yīng)當(dāng)制定吡蟲啉在水產(chǎn)品中更加嚴(yán)格的最高殘留限量。本試驗(yàn)施藥后，第28天在稻田水中吡蟲啉降解率為97.54%，而鄭嵐等[11]的試驗(yàn)結(jié)果表明稻田水中的降解速度較快，施藥后21 d，吡蟲啉降解率為93.66%。施藥28 d后，吡蟲啉在底泥中的殘留量為10.94 μg/kg。但是吳聲敢等[22]的試驗(yàn)結(jié)果顯示，10%吡蟲啉可濕性粉劑在土壤中的半衰期高達(dá)5.6～15.3 d。雖然吡蟲啉在田水和底泥中降解較快，但是在克氏原鰲蝦組織中代謝較慢，尤其是在可食組織肌肉中。

稻蝦綜合種養(yǎng)模式是稻漁綜合種養(yǎng)中的新興模式。與傳統(tǒng)的克氏原螯蝦養(yǎng)殖模式相比，蝦蟹套養(yǎng)效益不高、池塘精養(yǎng)模式高溫季節(jié)起捕困難，而稻蝦綜合種養(yǎng)模式的成本投入很低，但養(yǎng)殖效益卻與池塘精養(yǎng)模式不相上下[23]。但值得注意的是，稻蝦綜合種養(yǎng)也比較容易受到農(nóng)藥污染影響，一是稻田施藥過(guò)程中對(duì)水體的污染，二是稻田施藥后殘留的農(nóng)藥污染。但是在現(xiàn)行的評(píng)估體系中，農(nóng)藥對(duì)水產(chǎn)品的危害評(píng)價(jià)并沒(méi)有明確。

根據(jù)以上研究結(jié)果，為了避免對(duì)非靶標(biāo)生物水產(chǎn)品-克氏原螯蝦產(chǎn)生危害，建議適當(dāng)延長(zhǎng)吡蟲啉在稻田中的施藥間隔期，在靠近養(yǎng)殖水體的稻田尤其是在稻蝦綜合種養(yǎng)模式下應(yīng)謹(jǐn)慎施藥或建議使用其他替代藥物。