沈萍萍 齊雨藻

(1. 煙臺(tái)大學(xué)海洋學(xué)院 煙臺(tái) 264005; 2. 暨南大學(xué)赤潮與海洋生物學(xué)研究中心 廣州 510632; 3. 水體富營(yíng)養(yǎng)化與赤潮防治廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510632)

棕囊藻(Phaeocystis)是全球海洋廣泛分布的有害藻華原因種, 也是海洋初級(jí)生產(chǎn)力的重要貢獻(xiàn)者, 在極地和近海地區(qū)的碳、硫元素的生物地球化學(xué)循環(huán)、食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)及全球氣候變化中都具有極其重要的作用(Verity et al, 2007)。多數(shù)棕囊藻具有復(fù)雜的異型生活史(heteromorphic life cycle, 亦稱多態(tài)生活史polymorphic life cycle), 兼有單細(xì)胞和囊體兩種形態(tài)(Rousseau et al, 2007)。在富營(yíng)養(yǎng)條件下, 棕囊藻能在短時(shí)間內(nèi)暴發(fā)性增殖形成藻華, 不僅能夠產(chǎn)生溶血性毒素、二甲基硫化物(DMSP/DMS)及硫丙酸等化合物影響海洋生物(van Rijssel et al, 2007), 囊體衰亡后還形成大量泡沫物質(zhì), 嚴(yán)重影響海洋生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能, 給漁業(yè)養(yǎng)殖造成巨大危害與損失(齊雨藻等, 2002; Schoemann et al, 2005)。棕囊藻藻華因其暴發(fā)規(guī)模大、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、危害嚴(yán)重, 一直受到高度關(guān)注, 是國(guó)際、國(guó)內(nèi)有害藻類研究的熱點(diǎn)之一(Qi et al, 2004; 沈萍萍等, 2018)。

1997 年10 月末中國(guó)東南沿海首次暴發(fā)了特大規(guī)模的棕囊藻藻華, 其原因種為我國(guó)一種藻華新記錄種——球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)(陳菊芳等, 1999; 陳月琴等, 2002)。此后, 陸續(xù)在廣東、福建、海南、廣西北部灣等海域都暴發(fā)了此種藻華。2004年渤海天津海域也首次錄得球形棕囊藻藻華的發(fā)生(曲凌云等, 2008)。截至2017 年底, 中國(guó)沿海已報(bào)道的棕囊藻藻華高達(dá)55 起, 發(fā)生面積超過14000 km2(沈萍萍等, 2018)。此種藻華能致養(yǎng)殖漁業(yè)遭受巨大損失, 如僅1997 年底廣東拓林灣的網(wǎng)箱養(yǎng)殖損失達(dá)9000 余萬(陳菊芳等, 1999)。從2014 年開始, 廣西北部灣海域大量棕囊藻囊體堵塞濱海核電站的冷源取水口, 嚴(yán)重影響核電運(yùn)行安全(曹西華等, 2017), 引起社會(huì)極大關(guān)注, 也為棕囊藻藻華的研究提出了新的挑戰(zhàn)與要求。

近二十年來我國(guó)學(xué)者針對(duì)棕囊藻進(jìn)行了諸多研究(沈萍萍等, 2018), 尤其是最近幾年取得了顯著的進(jìn)展(Wang et al, 2015; 梁大勇等, 2018; 胡曉坤等,2019; 胡章喜等, 2019; Zhang et al, 2020)。但是有關(guān)中國(guó)沿海棕囊藻形態(tài)及分類的研究卻一直較少(陳月琴等, 2002; 覃仙玲等, 2016; 胡章喜等, 2019), 目前報(bào)道的僅“球形棕囊藻” 1 種, 絕大多數(shù)報(bào)道主要依據(jù)藻華暴發(fā)時(shí)的“球形囊體”特征將其認(rèn)定為“球形棕囊藻”, 但不同地理株出現(xiàn)了明顯的分化(Shen et al,2011; Xu et al, 2017; 胡曉坤等, 2019), 有可能存在隱存種現(xiàn)象。此外, 過去我們關(guān)注到東海海域一直沒有球形棕囊藻及藻華的研究報(bào)道, 實(shí)際上卻有2 種新記錄種存在(即心形棕囊藻Phaeocystis cordata Zingone et Chrétiennot-Dinet 和楊棕囊藻P. jahnii Zingone), 且豐度較高有形成藻華的跡象(Lin et al, 2014)。這一現(xiàn)象表明, 中國(guó)沿海有關(guān)棕囊藻種類多樣性的研究比較匱乏, 而種類的分類與鑒定是所有研究的基礎(chǔ)和根本, 亟需填補(bǔ)。因此本文就全球范圍內(nèi)棕囊藻屬的分類及地理分布特征等研究進(jìn)展作一梳理與總結(jié),為厘清中國(guó)沿海棕囊藻的種類及遺傳多樣性現(xiàn)狀提供基礎(chǔ)資料。

1 棕囊藻的分類及形態(tài)特征

棕囊藻屬(Phaeocystis)由Lagerheim 始建于1893年, 現(xiàn)隸屬于定鞭藻門(Haptophyta)定鞭藻綱(Haptophyceae)棕囊藻目(Phaeocystales)(見Algaebase條目), 是廣溫廣鹽性的海洋微藻, 廣泛分布于從極地到熱帶地區(qū)各大海洋中(Baumann et al, 1994)。此屬的主要特征是既有單細(xì)胞型又有群體型; 運(yùn)動(dòng)細(xì)胞＜ 10 μm 且具2 條長(zhǎng)鞭毛及1 條短直的定鞭毛; 有些種類具不動(dòng)細(xì)胞階段, 細(xì)胞單生或聚集成球形或不規(guī)則的囊體。由于棕囊藻細(xì)胞個(gè)體微小且多具有復(fù)雜的異型生活史, 具有單細(xì)胞和囊體兩種形態(tài), 因此棕囊藻屬種類的確定從一開始即頗多爭(zhēng)論(齊雨藻等,2001)。1892 年, Pouchet 首次報(bào)道了1882 年夏季發(fā)現(xiàn)于挪威海域的膠質(zhì)囊狀“棕囊藻”, 由于與綠藻四孢藻屬(Tetraspora)的Tetraspora giraudyi Derbès & Solier(1851)的膠質(zhì)囊很像而被命名為Tetraspora poucheti Hariot (Pouchet, 1892)。1893 年Lagerheim 在瑞典Koster 群島海域發(fā)現(xiàn)相似種類并質(zhì)疑這兩個(gè)海洋棕色藻類不該屬于淡水綠藻四孢藻屬, 他因此建立新屬棕囊藻屬(Phaeocystis Lagerheim), 將 Tetraspora poucheti Hariot 重新命名為波切棕囊藻[Phaeocystis pouchetii (Hariot) Lagerheim]并以此為棕囊藻屬模式種。原屬四孢藻屬的淡水綠藻T. fuscescens Braun ex Kützing 與T. giraudyi (Derbès & Solier)也被相繼歸于棕囊藻屬, 即 P. fuscescens (Braun) De Toni 與 P.giraudyi (Derbès and Solier) Hamel。

隨后, 球形棕囊藻(Phaeocystis globosa Scherffel,1899)和南極棕囊藻(P. antarctica Karsten, 1905)分別在德國(guó)北海及南極海域被發(fā)現(xiàn), Scherffel (1900)在球形棕囊藻中首次詳細(xì)描述了棕囊藻的第三根鞭毛“定鞭體(haptonema)”。1911 年, Büttner 從德國(guó)Kiel 港又分離鑒定 2 個(gè)種 P. sphaeroides Büttner 和 P.amoeboidea Büttner, 這2 個(gè)種具有肉眼可見的棕色囊體, 細(xì)胞內(nèi)具1 個(gè)黃棕色葉綠體且運(yùn)動(dòng)細(xì)胞具2 條等長(zhǎng)的鞭毛, 卻因細(xì)胞內(nèi)僅有1 個(gè)葉綠體而受到質(zhì)疑(Medlin et al, 2007)。1922 年, 在南極洲又發(fā)現(xiàn)一新種Phaeocystis brucei Mangin, 細(xì)胞大小為5—6 μm, 每個(gè)細(xì)胞含有2 個(gè)金黃色葉綠體, 囊體直徑1—2 mm,此種囊體與球形棕囊藻和南極棕囊藻的囊體具有明顯的差別在于存在一些與囊體通過黏液小徑相連的獨(dú)立細(xì)胞簇。早期由于受光學(xué)顯微觀察技術(shù)的限制,很難獲得單細(xì)胞的詳細(xì)形態(tài)結(jié)構(gòu), 因此主要基于囊體形態(tài)與地理分布差異將不同棕囊藻種分開。1955年Kornmann (1955)詳細(xì)比較了球形棕囊藻和波切棕囊藻的囊體形成過程, 發(fā)現(xiàn)兩個(gè)種的囊體發(fā)展過程很相似, 大約在16 細(xì)胞時(shí)期才出現(xiàn)不同, 因此他認(rèn)為球形棕囊藻是波切棕囊藻的幼體形式, 囊體形態(tài)特征從此后成為一個(gè)不太可靠的分類標(biāo)準(zhǔn)。

時(shí)隔多年直到1979 年, Moestrup (1979)綜合利用電子掃描及透射顯微鏡在新西蘭海域發(fā)現(xiàn)了只有單細(xì)胞形態(tài)的新種P. scrobiculata Moestrup (蜂窩狀棕囊藻), 至此已被描述的棕囊藻共有9 種。Sournia (1988)將從建屬以來發(fā)表過的這9 種棕囊藻重新審訂, 發(fā)現(xiàn)大多數(shù)種的鑒定不充分, 囊體特征易發(fā)生變異, 而單細(xì)胞缺乏必要的亞顯微結(jié)構(gòu)特征描述如鞭毛長(zhǎng)度、體表鱗片、附屬物等特征, 他剔除了明顯不符合棕囊藻屬特征的兩個(gè)淡水種P. fuscescens 與P. giraudyi, 還有3 個(gè)種如P. amoeboidea、P. brucei 及P. sphaeroides等種類自首次描述過后一直沒有獲得純培養(yǎng)而無法深入鑒定, 而對(duì)于兩個(gè)常見種類P. pouchetii 和 P.globosa 進(jìn)行細(xì)致研究后卻沒有將二者區(qū)分開, 因此Sournia 認(rèn)為確定的只有兩個(gè)種: 一是僅發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞形態(tài)的蜂窩狀棕囊藻(P. scrobiculata Moestrup), 二是能夠形成囊體的波切棕囊藻[P. pouchetii (Hariot)Lagerheim, 包括球形棕囊藻在內(nèi)]。為避免混淆, 1990年代中期前大多數(shù)海洋生態(tài)學(xué)家遵從Sournia 的“兩大類”建議來報(bào)道棕囊藻。有學(xué)者認(rèn)為這一分類過于簡(jiǎn)化, 如Baumann 等(1994)依據(jù)地理分布、溫度和光的耐性、囊體形態(tài)等特征將棕囊藻細(xì)分為4 個(gè)不同的種: 即蜂窩狀棕囊藻、球形棕囊藻、波切棕囊藻及南極棕囊藻。

其后隨著觀察技術(shù)的發(fā)展和研究的深入, 棕囊藻的分類特征有了新的補(bǔ)充, 運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的特征如細(xì)胞大小、鞭毛及定鞭體的長(zhǎng)短、星形線狀分泌物以及體表鱗片等成為重要的分類標(biāo)準(zhǔn)(Parke et al, 1971;Zingone et al, 1999; Peperzak et al, 2000; Jacobsen,2002)。特別是星形線物質(zhì)特征, 即運(yùn)動(dòng)細(xì)胞產(chǎn)生并釋放一種纖維狀的幾丁類物質(zhì), 能夠形成五角星形或九角星形的模式(圖1), 這個(gè)特征成為棕囊藻屬一個(gè)重要且特有的分類標(biāo)準(zhǔn)(Chrétiennot-Dinet et al, 1997),用來鑒定不同棕囊藻運(yùn)動(dòng)單細(xì)胞的種類, 如波切棕囊藻、球形棕囊藻及南極棕囊藻(P. antarctica Karsten)細(xì)胞分泌物質(zhì)的特征為五角星形, 而蜂窩狀棕囊藻的分泌物質(zhì)特征卻是九角星形。

后來隨著分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用, Medlin 等(1994)利用18S rRNA 基因序列對(duì)上述分類結(jié)果進(jìn)行了遺傳水平的確定, 首次從分子水平上將球形棕囊藻與波切棕囊藻兩個(gè)種區(qū)分開。1999 年Zingone 等(1999)又根據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)和核糖體SSU rRNA 分子特征分析在地中海海域發(fā)現(xiàn)2 個(gè)新種, 即P. cordata (心形棕囊藻)和P. jahnii (揚(yáng)棕囊藻)?；谛螒B(tài)學(xué)及分子生物學(xué)分析, Medlin 等(2007)認(rèn)為已有的對(duì)棕嚢藻的形態(tài)學(xué)分類研究不足以界定本屬, 應(yīng)予修正。為此, 她們對(duì)棕嚢藻屬做了如下界定:

棕嚢藻(Phaeocystis Lagerheim 1893, Medlin &Zingone emended)

運(yùn)動(dòng)細(xì)胞具兩條等長(zhǎng)或不等長(zhǎng)鞭毛及一條短直定鞭體; 葉綠體1—4 個(gè)側(cè)生; 細(xì)胞常為2 種不同大小的平滑鱗片覆蓋。某些種類具有射出的細(xì)胞器。生活史復(fù)雜, 包括形成不動(dòng)細(xì)胞的階段, 但此種狀況不是所有種類皆如此。不動(dòng)細(xì)胞通常無附屬物及鱗片, 細(xì)胞單生或排列成球形、有裂瓣的、具色鞘或不規(guī)則的膠質(zhì)囊體; 如有附屬物, 通常短而不完整。

最近, Andersen 等(2015)從阿拉伯海域發(fā)現(xiàn)了1種新的單細(xì)胞種類——冠狀棕囊藻(Phaeocystis rex),此種僅觀察到單細(xì)胞形態(tài)存在, 其細(xì)胞個(gè)體較大, 直徑6—10 μm, 長(zhǎng)8—15 μm, 尤其外被的多層不定形有機(jī)鱗片和指狀突起的葉綠體特征, 較其他棕囊藻種有顯著的差別, 與Medlin 等(2007)所界定的棕囊藻屬的基本特征亦不完全吻合, 但系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果卻顯示冠狀棕囊藻是介于單細(xì)胞種類和群體型種類的中間進(jìn)化類型。

圖1 棕囊藻的星形線分泌物特征Fig.1 The star-like filaments of Phaeocystis

至此已被描述的棕囊藻有 10 個(gè)種, 分別是:Phaeocystis amoeboidea Büttner 變形蟲狀棕囊藻、P.antarctica Karsten 南極棕囊藻、P. brucei Mangin 布魯斯棕囊藻、P. cordata Zingone et Chrétiennot-Dinet 心形棕囊藻、P. globosa Scherffel 球形棕囊藻、P. jahnii Zingone 揚(yáng)棕嚢藻、P. pouchetii (Hariot) Lagerheim 波切棕囊藻、P. rex Andersen, Bailey, Decelle & Probert冠狀棕囊藻、P. scrobiculata Moestrup 蜂窩狀棕囊藻、P. sphaeroides Büttner 圓形棕囊藻等。其中7 個(gè)種已經(jīng)過DNA 分子鑒定或電鏡形態(tài)特征檢驗(yàn), 而剩余P.amoeboidea (1910) 、 P. sphaeroides (1911) 及 P.brucei (1922) 3 個(gè)種類由于在原文無明確的附圖及可疑性狀(如只有1 個(gè)葉綠體及無定鞭毛), 在此后的文獻(xiàn)中再也沒有被論及, 故本文按照“棕囊藻屬種的檢索表”介紹7 種確定棕嚢藻的綜合形態(tài)特征(Medlin et al, 2007; Rousseau et al, 2007)(圖2, 3, 4):

棕嚢藻屬種的檢索表

(一) 群體型:

(1) 波切棕嚢藻

Phaeocystis pouchetii (Hariot in Pouchet)Lagerheim (Pouchet, 1892) (模式種)(圖2a, 3a)

囊體呈裂瓣?duì)? 囊體內(nèi)細(xì)胞往往4 個(gè)聚堆。具鞭毛階段的細(xì)胞為球形, 平均直徑5 μm, 2 條鞭毛等長(zhǎng)約11 μm, 定鞭體很短1—2 μm。細(xì)胞外有2 類鱗片:一種為環(huán)片狀0.24 μm×0.25 μm; 另一種為卵圓形且邊緣微卷曲的鱗片0.9 μm×0.15 μm, 覆蓋于大鱗片之下層。細(xì)胞核后位, 葉綠體2 塊且內(nèi)生蛋白核, 高爾基體居二者其間。

(2) 球形棕嚢藻

Phaeocystis globosa Scherffel (Scherffel, 1900)(圖2b, 3b, 3c)

囊體呈球形, 囊體內(nèi)細(xì)胞均勻分布。具鞭毛階段的細(xì)胞大小3—6 μm。2 條鞭毛等長(zhǎng), 長(zhǎng)度為體長(zhǎng)1.5倍。定鞭體的長(zhǎng)度是鞭毛的1/4 至1/3。體表鱗片有2類: 環(huán)片狀(0.18 μm×0.19 μm)及小形底墊的卵圓狀鱗片(0.10 μm×0.13 μm)。具2 片葉綠體, 細(xì)胞核后位, 具高爾基體及多數(shù)簇生潴泡(cisternae)。

圖2 群體型棕囊藻囊體的光學(xué)形態(tài)特征(引自Medlin et al, 2007)Fig.2 Light microscopic micrographs of colony stages of Phaeocystis (from Medlin et al, 2007)

(3) 南極棕囊藻

Phaeocystis antarctica Karsten (1905)(圖2c, 2d, 3d)

囊體為圓形囊狀, 細(xì)胞散布在近囊體表層, 囊體會(huì)隨年齡增長(zhǎng)而變成扭曲狀或伸長(zhǎng)。囊體內(nèi)細(xì)胞呈圓形或稍近四邊形, 直徑4—6 μm, 通常具有2 個(gè)或罕見有4 個(gè)拉長(zhǎng)的金棕色葉綠體, 每個(gè)含1 個(gè)紡錘狀蛋白核, 高爾基體位于兩個(gè)葉綠體之間。具鞭毛階段細(xì)胞大小及形狀變化較多, 小的圓形細(xì)胞大小約4 μm長(zhǎng), 而大的卵圓形或梨形細(xì)胞長(zhǎng)約6 μm; 具2 條明顯不等長(zhǎng)且尖頭的鞭毛(分別長(zhǎng)7—12 μm 及12—18 μm),定鞭體長(zhǎng)3—4.5 μm 且末段未見凸脹。大部分時(shí)間鞭毛細(xì)胞表面無鱗片覆蓋, 并且無觀察到星形線分泌物。若有鱗片覆蓋, 為圓形(直徑0.20 μm)(Zingone et al, 2011); 或大小不同的卵圓形分別為 0.27 μm×0.19 μm 及0.18 μm×0.14 μm。有鱗片覆蓋的細(xì)胞同時(shí)能形成五角星形線結(jié)構(gòu)(中心0.8 μm 寬)。

(4) 揚(yáng)棕囊藻

Phaeocystis jahnii Zingone (Zingone et al, 1999)(圖2e, 3e)

囊體為不定形囊狀, 囊體內(nèi)細(xì)胞疏松排布(亦有認(rèn)為此種屬單細(xì)胞類型), 大小約為 6—8.5 μm, 具2—4 個(gè)葉綠體。鞭毛細(xì)胞近圓形, 直徑3.5—5 μm, 具有2 條不等長(zhǎng)的鞭毛(長(zhǎng)8.5—12 μm 及5.5—6.5 μm),鞭毛末端凸脹不明顯。外覆細(xì)胞鱗片, 其表面上的放射紋很不明顯。藻體呈桔黃色。

(二) 單細(xì)胞型:

(5) 心形棕囊藻

Phaeocystis cordata Zingone &Chrétiennot-Dinet (Zingone et al, 1999)(圖3h, 3i, 3j)

單細(xì)胞三角形、心形或橢圓形, 間或扁平, 末端微尖, 細(xì)胞大小平均為3—3.5 μm 長(zhǎng), 3—4 μm 寬, 厚度約為2.5 μm。具2 條稍不等長(zhǎng)鞭毛, 其長(zhǎng)度分別為5.5—7.5 μm 及 4.5—6 μm, 定 鞭 體 很 短 長(zhǎng) 度 為2.2—2.5 μm。外覆鱗片卵圓形, 大鱗片 0.25 μm×0.18 μm, 小鱗片為0.18 μm×0.13 μm。

(6) 蜂窩狀棕囊藻

Phaeocystis scrobiculata Moestrup (Moestrup,1979)(圖4a, 4b)

藻體單細(xì)胞直徑約為8 μm。具2 種鱗片, 大小分別為0.6 μm×0.45 μm 及0.19 μm×0.21 μm, 2 根鞭毛及1 根定鞭體都較球形棕囊藻的長(zhǎng)一倍。

本種首先在新西蘭發(fā)現(xiàn), 目前已在多個(gè)海域有分布記錄。

(7) 冠狀棕囊藻

Phaeocystis rex Andersen, Bailey, Decelle &Probert (Andersen et al, 2015)(圖4c, 4d)

藻體單細(xì)胞, 直徑6—10 μm, 長(zhǎng)8—15 μm, 外周由多層不定形的有機(jī)磷片包被。細(xì)胞末端有時(shí)有疣狀突起, 細(xì)胞具有2 個(gè)葉綠體, 每個(gè)葉綠體呈前伸手指狀突起, 內(nèi)有1 蛋白核。不動(dòng)細(xì)胞及運(yùn)動(dòng)細(xì)胞都具有2條較短的鞭毛及1 條定鞭體。模式樣本來自阿拉伯海。

(三) 未確定種類及形態(tài)(Undescribed species/morphotype)

近年來有更多的棕囊藻新種或新形態(tài)被發(fā)現(xiàn)(Medlin et al, 2007; Doan-Nhu et al, 2010a; Rousseau et al, 2013; Novarino, 2014; Andersen et al, 2015)。Medlin 等(2007)報(bào)告了地中海海域分離的3 個(gè)未確定種: Phaeocystis sp.1 (PML559)(圖5), Phaeocystis sp.2(圖2f), Phaeocystis sp.3 (圖3g)。其中Phaeocystis sp.1和Phaeocystis sp.3 為單細(xì)胞種類, 而Phaeocystis sp.2能夠形成囊體, 其運(yùn)動(dòng)細(xì)胞形狀不規(guī)則, 2 條鞭毛明顯不等長(zhǎng)且定鞭體無凸脹末端; 細(xì)胞表面無鱗片及纖維(圖2f); 雖然18S rDNA 序列分析表明其屬于球形棕囊藻分支, 但是ITS rDNA 序列分析卻無法與其他球形棕囊藻株系聚類。Doan-Nhu 等(2010a)曾描述過越南沿海及南海廣泛分布的一種棕囊藻單細(xì)胞形態(tài)(Phaeocystis spp.), 細(xì)胞近圓形, 大小約3 μm, 2 條鞭毛可能等長(zhǎng), 定鞭體不清楚, 能夠形成五角星形結(jié)構(gòu), 具有2 種大小不同的圓形平坦的鱗片且與已知棕囊藻種類皆不同, 但由于原文及照片描述比較模糊無法進(jìn)一步確定。

Novarino(2014)報(bào)道了地中海西部海域6 種棕囊藻單細(xì)胞形態(tài)(Morphotype 1—6), 其中Morphotype 1—3 分別對(duì)應(yīng)了波切棕囊藻、球形棕囊藻及蜂窩狀棕囊藻的運(yùn)動(dòng)細(xì)胞形態(tài), 而其余3 種(Morphotype 4—6)與已知的棕囊藻種類皆不相符(圖6—8)。其中Morphotype 4 為此海域中繼Morphotype 2(即球形棕囊藻)之后的第二高豐度的細(xì)胞形態(tài)(圖6), 其細(xì)胞大小為3—3.5 μm, 具不等長(zhǎng)鞭毛, 沒有定鞭體?；诒廾拈L(zhǎng)度, 此類細(xì)胞分為兩種類型, 類型1(Form-1)細(xì)胞鞭毛分別長(zhǎng)為7—8 μm 和5—6 μm 并能觀察到五角星形線(圖6a), 類型2(Form-2)細(xì)胞鞭毛長(zhǎng)15—20 μm和10—12 μm 但未觀察到星形線結(jié)構(gòu)(圖6e); 細(xì)胞表面覆蓋2 種鱗片, 大的橢圓形為0.44 μm×0.31 μm 和小的圓形鱗片平均直徑為0.13 μm (圖6b—6d), 此種最有可能為棕囊藻新物種(Novarino, 2014)。Morphotype 5 在地中海的分布及數(shù)量稀少, 大多數(shù)為3—4 μm細(xì)胞, 具有 2 條不等長(zhǎng)鞭毛分別為 20—30 μm 和15—22 μm 長(zhǎng)(圖7)。五角星形線結(jié)構(gòu)中間部分無孔,被纖維物質(zhì)緊密圍繞。細(xì)胞表面的橢圓形鱗片非常類似波切棕囊藻, 但是大小有較大差別。此形態(tài)與波切棕囊藻經(jīng)常同時(shí)出現(xiàn), 因此推測(cè)很可能是波切棕囊藻的某個(gè)生活史階段(Novarino, 2014)。Morphotype 6僅觀察到一個(gè)樣品, 其直徑約3 μm, 2 條不等長(zhǎng)鞭毛分別長(zhǎng)5 和3.5 μm(圖8)。細(xì)胞被10 個(gè)未完全展開的纖維絲包所包圍, 未見五角星形或九角星形結(jié)構(gòu)(如果這些纖維絲能夠完全展開, 可能會(huì)形成類似五角星線結(jié)構(gòu))。外覆鱗片只有1 種類型大小約0.60 μm×0.51 μm, 鱗片大小及外形類似蜂窩狀棕囊藻, 但沒有觀察到其特征性的九角星形線形結(jié)構(gòu)。目前一個(gè)共性問題是尚不能確定這些細(xì)胞型能否代表生物學(xué)上獨(dú)立的棕囊藻種類, 還是同一個(gè)種不同生活史階段的細(xì)胞形態(tài), 需要進(jìn)一步結(jié)合分子遺傳信息、生活史研究及傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)觀察來綜合確定。

圖4 單細(xì)胞型棕囊藻(蜂窩狀棕囊藻和冠狀棕囊藻)的細(xì)胞形態(tài)特征(引自Moestrup, 1979; Andersen et al, 2015)Fig.4 Microscopy of solitary Phaeocystis (from Moestrup, 1979;Andersen et al, 2015)

雖然未確定的棕囊藻種類或形態(tài)較多, 僅從地中海海域就描述了6 種未定種(株)(不包括已確定的5種: 波切棕囊藻、球形棕囊藻、蜂窩狀棕囊藻、心形棕囊藻及楊棕囊藻), 但是它們是否屬于表型、生理、基因抑或生態(tài)的多態(tài)性還不能確定。棕囊藻復(fù)雜的生活史是理解問題的關(guān)鍵所在。在所有棕囊藻種類中,有7 種已確定具有多個(gè)形態(tài)迥異的生活史階段, 除了能夠形成囊體的波切棕囊藻、南極棕囊藻和球形棕囊藻, 還包括楊棕囊藻、心型棕囊藻、蜂窩狀棕囊藻及冠狀棕囊藻(Vaulot et al, 1994; Peperzak et al, 2000;Rousseau et al, 2007; G?bler-Schwarz et al, 2013;Andersen et al, 2015)。因此考慮到種內(nèi)多態(tài)性的存在,這些未確定種類及形態(tài)必須要在明確其生活史的基礎(chǔ)上才能得以確定。再者由于獲得信息不對(duì)稱, 如早期的種類描述中只有囊體形態(tài)而沒有細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及鱗片等電鏡觀察特征, 后來的研究中有些種類不能分離培養(yǎng)而無法獲得其DNA 序列信息, 加之棕囊藻本身復(fù)雜的異型生活史, 增加了太多的不確定性,使得棕囊藻種類的鑒定變得更為錯(cuò)綜復(fù)雜。

但不管怎樣, 不論從形態(tài)學(xué)還是分子遺傳信息來講, 目前棕囊藻屬的種類多樣性被低估是毋庸置疑的(Medlin et al, 2007)。越來越多的超微型真核生物研究表明, 定鞭藻類是熱帶、亞熱帶海洋生態(tài)系統(tǒng)中重要的初級(jí)生產(chǎn)者, 是2—8 μm 真核生物類群的優(yōu)勢(shì)種, 但對(duì)于其種類組成還遠(yuǎn)不了解, 大部分種類以“類群”和“未培養(yǎng)克隆(Uncultured clone)”的形式出現(xiàn)(Liu et al, 2009; Masquelier et al, 2011; Lin et al, 2014;Shih et al, 2019)。因此棕囊藻屬可能遠(yuǎn)不止目前已描述的10 種, 一方面由于棕囊藻單細(xì)胞個(gè)體微小, 在常規(guī)顯微檢測(cè)中很容易被忽略; 另一方面由于棕囊藻具有較強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性, 它們的分布極其廣泛, 但目前調(diào)查取樣的范圍與樣品還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠, 尤其是基因庫(kù)中大量“未培養(yǎng)克隆”種類的存在, 表明全球范圍內(nèi)棕囊藻種類多樣性的工作還有很大的研究空白,有待于結(jié)合實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察及分子鑒定等技術(shù)手段進(jìn)行深入探索與發(fā)現(xiàn)。

2 棕囊藻的系統(tǒng)進(jìn)化及地理分布

棕囊藻是對(duì)溫度和鹽度適應(yīng)性非常廣的海洋微藻,生境多樣, 從南北極到赤道的沿海及大洋生態(tài)系統(tǒng)中皆有分布(Schoemann et al, 2005; Verity et al, 2007)。

圖5 地中海海域報(bào)道的未定種棕囊藻鞭毛藻細(xì)胞特征 [Phaeocystis sp. 1 (PML 559), 引自 Medlin et al, 2007]Fig. 5 LM, TEM and SEM micrographs of flagellated stages of Phaeocystis sp. 1 (PML 559, from Medlin et al, 2007)

圖7 地中海海域棕囊藻鞭毛藻細(xì)胞形態(tài)5 (Morphotype 5)(引自Novarino, 2014)Fig.7 Phaeocystis morphotype 5 from Mediterranean Sea (from Novarino, 2014)

圖8 地中海海域棕囊藻鞭毛藻細(xì)胞形態(tài)6 (Morphotype 6)(引自Novarino, 2014)Fig.8 Phaeocystis morphotype 6 from Mediterranean Sea (from Novarino, 2014)

群體型棕囊藻由于能夠形成肉眼可見的囊體且能引發(fā)大規(guī)模藻華而備受關(guān)注, 其豐度極高(發(fā)生藻華時(shí)細(xì)胞豐度可達(dá)106—108cells/L), 其中經(jīng)常發(fā)生藻華的種類有南極棕囊藻、波切棕囊藻及球形棕囊藻,并且具有特定的地理分布范圍: 南極棕囊藻主要分布在南極周邊海域; 波切棕囊藻分布在北半球高緯度的北冰洋、北大西洋海域; 球形棕囊藻主要分布在北大西洋、北海沿海等溫帶海域及熱帶、亞熱帶海域。這些群體型棕囊藻特定的地理分布特征具有其生理學(xué)基礎(chǔ), 野外觀察和實(shí)驗(yàn)室研究表明南極棕囊藻的溫度耐受范圍介于＜-2—14°C, 最適生長(zhǎng)溫度為4.5°C; 波切棕囊藻溫度耐受范圍介于＜-2—14°C, 其最適生長(zhǎng)溫度為 8°C; 而球形棕囊藻耐受范圍為＜-0.6—22°C, 最適生長(zhǎng)溫度為16°C, 后者的溫度范圍及最適生長(zhǎng)溫度(尚未包括熱帶亞熱帶海域球形棕囊藻株系)明顯高于前兩者(Jahnke et al, 1987; Jahnke,1989; Medlin et al, 1994)。尤其是隨著海域富營(yíng)養(yǎng)化的加劇以及全球氣候的異常, 球形棕囊藻藻華的發(fā)生范圍不斷擴(kuò)大, 逐漸覆蓋熱帶、亞熱帶海域。1990年夏季在科威特灣首次發(fā)生棕囊藻藻華(Al-Hasan et al, 1990); 1996 年夏季在阿拉伯海外海又暴發(fā)了球形棕囊藻藻華(Madhupratap et al, 2000); 1997 年10 月中國(guó)東南沿海首次暴發(fā)球形棕囊藻藻華后在南海沿海迅速擴(kuò)展, 其藻株耐受水溫高達(dá)30°C 以上, 最適溫度為25°C, 明顯高于北溫帶海域的球形棕囊藻株系(Shen et al, 2011; Xu et al, 2017); 越南沿海從2002—2008 年幾乎年年都暴發(fā)大規(guī)模的球形棕囊藻藻華(Doan-Nhu et al, 2010b); 南海沿海球形棕囊藻藻株由于形成的囊體巨大(直徑超過3 cm)且能耐受高溫,形成了非常獨(dú)特的球形棕囊藻分支(王小冬等, 2012;Medlin et al, 2007; Smith et al, 2014; Liu et al, 2015)。

相對(duì)于群體型種類, 單細(xì)胞種類棕囊藻發(fā)現(xiàn)較晚, 第一種即蜂窩狀棕囊藻于1979 年才在新西蘭海域發(fā)現(xiàn)(Moestrup, 1979), 但這并非表明單細(xì)胞棕囊藻的細(xì)胞豐度低, 實(shí)際上這些種類的細(xì)胞豐度亦較高, 如心形棕囊藻在地中海海域細(xì)胞豐度最高可達(dá)105cells/L (Zingone et al, 1999), 而中國(guó)東海北部海域心形棕囊藻和楊棕囊藻的混合豐度超過107cells/L(Lin et al, 2014)。由于棕囊藻單細(xì)胞個(gè)體微小, 而且常規(guī)固定方法很容易引起細(xì)胞變形, 同時(shí)又需要專門的研究工具才能準(zhǔn)確鑒定, 因此單細(xì)胞種類的研究相對(duì)較少, 其地理分布記錄零星而分散: 如之前蜂窩狀棕囊藻只在新西蘭有記錄, 揚(yáng)棕囊藻及心形棕囊藻僅在地中海中部海域發(fā)現(xiàn)(圖9a, Schoemann et al,2005), 新種冠狀棕囊藻僅在阿拉伯海域有記錄。但隨著研究的發(fā)展, 近年來單細(xì)胞種類的分布記錄不斷增加: 蜂窩狀棕囊藻陸續(xù)在越南沿海及南海(Doan-Nhu et al, 2010a)、澳大利亞(Hallegraeff, 1983)、熱帶大西洋(Estep et al, 1984)、北太平洋(Baumann et al, 1994)、格陵蘭島(Moestrup et al, 2003)、巴西(Bergesch et al, 2008)、地中海西部(Novarino, 2014)等海域被發(fā)現(xiàn), 遍布南北半球的熱帶、溫帶及寒帶海洋, 表明此種應(yīng)該是世界廣布性種類; 心型棕囊藻和楊棕囊藻在中國(guó)東海及南海海域(Lin et al, 2014; Wu et al, 2015)、斯堪的納維亞沿海(Guiry et al, 2020)、新西蘭(Guiry et al, 2020)、北太平洋、印度洋、紅海等(Decelle et al, 2012)均有報(bào)道并且豐度較高, 分布范圍涵蓋了赤道到溫帶的廣闊海域, 亦驗(yàn)證了“全球廣泛分布種”的推測(cè)(Zingone et al, 1999)。

除此以外, 尚有大量的“未確定種類”存在并且遍布全球各大海洋(圖9a, Schoemann et al, 2005), 如前述地中海海域就有多種未確定種類或細(xì)胞形態(tài), 還有很多“未培養(yǎng)克隆”棕囊藻種類的存在, 不僅分布極其廣泛, 而且豐度較高(Lin et al, 2014; Wu et al, 2015)。有些棕囊藻還以共生的形式存在(Decelle et al, 2012),研究表明這些棕囊藻與放射蟲共生, 分布廣泛且豐度極高, 遍布全球開闊大洋, 包括太平洋、印度洋、紅海、地中海、英吉利海峽、南大西洋和南極洲。其中在亞熱帶太平洋、熱帶印度洋及地中海海域發(fā)現(xiàn)的幾種未確定種棕囊藻(Phaeo1, Phaeo2), 其進(jìn)化地位位于棕囊藻系統(tǒng)進(jìn)化的最基部分支(早于心形棕囊藻和楊棕囊藻分化), 可為棕囊藻暖水起源的重要佐證(Decelle et al, 2012)。而且地中海海域出現(xiàn)的未確定種(Phaeo1, Phaeo2)能否與前面所描述的未確定種(Phaeocystis sp.1—sp.3)及形態(tài)(Morphotype 4—6)相對(duì)應(yīng)起來尚不得而知, 后續(xù)可以通過建立藻類純培養(yǎng)將分子克隆信息與細(xì)胞形態(tài)特征有機(jī)結(jié)合起來進(jìn)行研究。

綜上所述, 棕囊藻屬的全球分布范圍尤其是新種的分布, 需要進(jìn)一步重新審視, 我們?cè)赟choemann等(2005)的基礎(chǔ)上將至今發(fā)表的相關(guān)信息進(jìn)行了補(bǔ)充與更新(圖9b; 主要參考Guiry et al, 2020)。前后對(duì)比發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)特點(diǎn), 一是種類分布上, 球形棕囊藻、心型棕囊藻及蜂窩狀棕囊藻的地理分布范圍有顯著的增加, 尤其是心型棕囊藻和蜂窩狀棕囊藻, 已被證實(shí)為全球廣泛分布種, 因此預(yù)計(jì)其地理分布記錄會(huì)越來越多; 二是分布范圍上顯示了 3 個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域(Hotspot), 1 個(gè)位于地中海海域, 1 個(gè)在中國(guó)南海海域及其鄰近太平洋海區(qū), 1 個(gè)位于印度洋阿拉伯海域,這幾個(gè)熱點(diǎn)位于低緯度熱帶、亞熱帶及其鄰近海區(qū),種類多樣性較高, 尤其是地中海海域是浮游植物多樣性極高的地區(qū)(López, 1994), 推測(cè)極有可能還存在其他棕囊藻種或新種, 與前述的地中海海域出現(xiàn)多種未確定種(株)的現(xiàn)象相呼應(yīng)。

圖9 棕囊藻的地理分布比較圖(改自Schoemann et al, 2005)Fig.9 Geographical distribution of the genus Phaeocystis(modified from Schoemann et al, 2005)

圖10 基于18S rDNA 序列構(gòu)建的17 個(gè)棕囊藻種(株)和其他定鞭藻類的最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹(fastDNAml)(Medlin et al,2007)Fig.10 Maximum-likelihood phylogeny (fastDNAml) of 17 Phaeocystis species/strains and other prymnesiophytes inferred from 18S rDNA (Medlin et al, 2007)

Lange 等(2002)利用18S rDNA 及ITS1 rDNA 基因序列對(duì)全球分布的22 株棕囊藻進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析, 發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞類型地中海楊棕囊藻(P. jahnii)和心形棕囊藻(P. cordata)位于系統(tǒng)進(jìn)化樹的基部分支, 分化時(shí)間較早, 應(yīng)該為全球廣泛分布種(圖10)。而群體型種類分化時(shí)間較晚, 又各自演化為一冷水型復(fù)合種(北極的波切棕嚢藻和南極的南極棕嚢藻)和一暖水型復(fù)合種(包含球形棕嚢藻在內(nèi))。地中海區(qū)域的楊棕囊藻和心形棕囊藻可能是約500 萬年前大西洋海水灌入干涸的地中海盆地而引入的(Hsü et al, 1977)。而南極棕囊藻和波切棕囊藻雖然分布在地球兩極, 地理分布距離最遠(yuǎn), 但親緣關(guān)系最近, 位于進(jìn)化樹的同一分支, 由共同的祖先進(jìn)化而來(圖10, Medlin et al,2007)?？梢哉f, 前面所觀察到所有形態(tài)及生理上的變異皆具有其堅(jiān)實(shí)的遺傳基礎(chǔ), 證實(shí)源于不同氣候區(qū)(即北極、南極和溫帶/熱帶地區(qū))的群體型棕囊藻的種水平上的分離。相反, ITS1 表現(xiàn)出大量的種內(nèi)及種間遺傳分化, 除南極棕囊藻外, 其他棕囊藻種不同地理株ITS1 存在多重拷貝, 尤其球形棕囊藻可能是包括至少三個(gè)種(亞種)在內(nèi)的復(fù)合種(Medlin et al, 2007),這也可以解釋為什么球形棕囊藻的分布范圍能夠跨越不同的氣候區(qū)(溫帶、亞熱帶、熱帶等)而南極棕囊藻只局限于南極附近海域。

Medlin 等(1994)以rRNA 基因?yàn)榉肿又笜?biāo)同時(shí)結(jié)合Ochman (1987) rRNA 分子鐘概念對(duì)定鞭藻類進(jìn)行了研究分析, 提出棕囊藻為一種暖水起源的全球性分布藻類, 隨著地球氣候變化逐漸分化出冷水種。之后Medlin 等(1997)又根據(jù)球石藻化石記錄對(duì)定鞭藻綱分子鐘進(jìn)行了校正, 將棕囊藻起源估算至7500萬年前。隨后全球氣溫驟降, 出現(xiàn)不同溫度水團(tuán), 冷水種得以分化。根據(jù)校正后的定鞭藻分子鐘推斷冷水種從暖水種中分化時(shí)間約在6000 萬年前, 南極德雷克海峽的形成使大西洋和太平洋得以連通從而形成環(huán)繞南極大陸的南極環(huán)流(ACC), 將南極大陸沿岸水團(tuán)與北部水團(tuán)有效分隔, 棕囊藻逐漸被隔離分化出一支南極冷水種(Medlin et al, 2007)。波切棕囊藻和南極棕囊藻雖然分布于地球兩極, 但卻是親緣關(guān)系最近的姊妹株, 南極海域這一冷水種即是它們的祖先(Medlin et al, 1994)。這表明擴(kuò)散不是從現(xiàn)今的暖水種向兩極擴(kuò)散演化成現(xiàn)今的冷水種, 而是跨越了熱帶地區(qū)的兩極之間的基因流。研究發(fā)現(xiàn)這2 種冷水種的進(jìn)一步分化約在2000—1500 萬年前第三紀(jì)的中新紀(jì),全球海洋有一次短暫的變暖事件(Crame, 1993)。而在此之前, 全球水溫相對(duì)較低, 允許南極海域的冷水種棕囊藻存活并越過赤道區(qū)域到達(dá)北半球。但是這次短暫變暖事件使地球升溫, 將南北兩極的棕囊藻隔離分化, 最終形成南極的南極棕囊藻和北半球的波切棕囊藻。Darling 等(2000, 2004)在有孔蟲的研究中也發(fā)現(xiàn)南北兩極之間確實(shí)存在跨越熱帶地區(qū)的基因流,為棕囊藻從南極向北極的傳播分化過程提供了間接證據(jù)。而最近Wu 等(2015)在熱帶海域南海西南沿海冷渦區(qū)域發(fā)現(xiàn)了大量南極棕囊藻和波切棕囊藻的存在, 與暖水種球形棕囊藻一起貢獻(xiàn)了9%—67.1%的葉綠素生物量。這些冷水種類到底從哪里來, 是本地起源還是外來物種, 其適應(yīng)機(jī)制如何, 還無從考究,但這一發(fā)現(xiàn)或許能夠?yàn)樽啬以鍍蓸O之間的傳播途徑提供直接的證據(jù)。

除了單細(xì)胞型和群體型, 近來還發(fā)現(xiàn)了介于二者之間的中間進(jìn)化類型, 即2015 年在阿拉伯海域發(fā)現(xiàn)的新種冠狀棕囊藻, 目前僅觀察到單細(xì)胞形態(tài)存在, 但其細(xì)胞個(gè)體較其他棕囊藻種類都大, 尤其外被的多層不定形有機(jī)鱗片和指狀突起的葉綠體特征,與其他棕囊藻種有顯著的差別(Andersen et al, 2015)。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示, 冠狀棕囊藻是介于單細(xì)胞種類(心形棕囊藻和揚(yáng)棕囊藻)和群體型種類(球形棕囊藻、南極棕囊藻、波切棕囊藻)的中間進(jìn)化類型, 在遺傳距離上更接近南極棕囊藻, 表明囊體的形成是后來衍生的特征(圖11, Andersen et al, 2015)。有關(guān)此種的地理分布范圍、生活史等諸多問題尚不得而知,但這一中間進(jìn)化類型的發(fā)現(xiàn)無疑對(duì)于我們完整理解棕囊藻屬的系統(tǒng)進(jìn)化具有重要意義。

圖11 利用最大似然法(RAxML, 28 個(gè)種類, 4824 個(gè)對(duì)齊位置)基于5 種基因序列(線粒體16S rRNA, 18S rRNA and 28S rRNA, 質(zhì)粒 psbA and rbcL 基因)構(gòu)建的可培養(yǎng)棕囊藻種類的系統(tǒng)發(fā)育樹(Andersen et al, 2015)Fig.11 Phylogenetic tree of Phaeocystis inferred from a concatenated alignment of five genes (the ribosomal 16S rRNA, 18S rRNA and 28S rRNA, and the plastidial psbA and rbcL genes) using Random Axelerated Maximum Likelikhood(RAxML, 28 taxa with 4824 aligned positions) (Andersen et al, 2015)

3 展 望

根據(jù)棕囊藻屬不同類型種類發(fā)現(xiàn)的先后順序,如群體型種類先被發(fā)現(xiàn), 后來發(fā)現(xiàn)的種類多為單細(xì)胞型, 推測(cè)那些未被描述的種類或者新種都應(yīng)以單細(xì)胞種類為主(Andersen et al, 2015)。而且隨著環(huán)境樣品分子標(biāo)記及高通量測(cè)序等深度、廣度技術(shù)的應(yīng)用,出現(xiàn)了更多的“未培養(yǎng)克隆”棕囊藻種類(Lin et al,2014; Wu et al, 2015), 不僅分布極其廣泛, 而且豐度都較高。從生物多樣性的角度來看, 這些遺傳信息所代表的多樣性還需要從形態(tài)學(xué)上進(jìn)一步相互驗(yàn)證。但無論如何, 新的分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用對(duì)于深入了解全球范圍內(nèi)棕囊藻屬的種類多樣性及其地理分布特征、發(fā)現(xiàn)新的棕囊藻種類都具有極大的推動(dòng)作用。棕囊藻屬的種類多樣性研究, 正面臨前所未有的機(jī)遇與挑戰(zhàn), 相信今后在傳統(tǒng)的分類學(xué)與分子生物學(xué)組學(xué)等技術(shù)相結(jié)合的基礎(chǔ)上, 將更加清晰揭示全球棕囊藻的物種多樣性、遺傳多樣性與生態(tài)系統(tǒng)多樣性分布格局。