池彥廷，張延平，張秋露，劉翠苓，李斌斌△

[1.北京大學口腔醫(yī)學院·口腔醫(yī)院，病理科 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實驗室 口腔數(shù)字醫(yī)學北京市重點實驗室，北京 100081； 2. 中國醫(yī)學科學院口腔頜面部腫瘤精準病理診斷創(chuàng)新單元(2019RU034)，北京 100081； 3.鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科，鄭州 450052； 4.四川大學華西臨床醫(yī)學院，成都 610041； 5.北京大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理學系，北京 100191； 6.北京大學第三醫(yī)院病理科，北京100191]

黏膜相關(guān)淋巴組織(mucosa associated lymphoid tissue，MALT)淋巴瘤的概念首先由Isaacson等[1]于1983年提出，是一種發(fā)生在淋巴結(jié)外黏膜相關(guān)淋巴組織的B細胞淋巴瘤，屬于非霍奇金淋巴瘤的一類。其發(fā)病率較高，約占B細胞性淋巴瘤的7%～8%[2]。MALT淋巴瘤的病因不明，目前普遍認為該腫瘤的形成可能與反復感染和自身免疫性疾病相關(guān)，如慢性胃炎(幽門螺桿菌感染)、橋本甲狀腺炎和干燥綜合征(Sj?gren’s syndrome，SS)等[3-4]。目前，胃MALT淋巴瘤作為MALT淋巴瘤中最常見的類型，臨床研究較多，其診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)、組織學形態(tài)、免疫表型、基因重排和分子病理學特征，一些特征性的病理表型可以為該疾病的臨床治療和預后評估提供一定參考依據(jù)。

SS是一種病因不明的自身免疫性疾病，主要發(fā)生于唾液腺、淚腺等外分泌腺組織。唾液腺SS患病率較低，一般為良性臨床過程，但部分患者有惡變?yōu)榱馨土龅娘L險，最常見的惡變類型為MALT淋巴瘤，約占46%～56%[5]。唾液腺SS繼發(fā)MALT 淋巴瘤(以下稱SS-MALT淋巴瘤)的臨床經(jīng)過和生物學行為呈惰性，預后較好，但也有高級別惡性淋巴瘤轉(zhuǎn)化的風險，預后轉(zhuǎn)差[6-7]。唾液腺SS-MALT淋巴瘤發(fā)病率低，臨床上患者病例數(shù)較少，對其病理表型上的認識較為有限。由于缺乏特異性的臨床表現(xiàn)和組織形態(tài)特點，僅憑臨床特點和病理形態(tài)可能會導致診斷上的漏診，以致于低估SS-MALT淋巴瘤的發(fā)病率，甚至可能會延誤對其進行針對性治療并進而影響預后的評估。

本研究將唾液腺SS-MALT淋巴瘤和無SS病史的MALT淋巴瘤(以下稱非SS-MALT淋巴瘤)進行對比，分析唾液腺SS-MALT淋巴瘤的臨床病理特點，并探索聯(lián)合應用組織病理形態(tài)、蛋白表達和分子表型檢測在唾液腺SS-MALT淋巴瘤病理診斷和預后評估中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集1997年1月至2016年12月期間就診于北京大學口腔醫(yī)院并被確診為SS的患者，從中篩選出惡變?yōu)橥僖合費ALT淋巴瘤的病例；另選取同期12例唾液腺非SS-MALT淋巴瘤患者作為對照。納入標準：(1)SS診斷符合國際診斷標準[8]；(2)MALT淋巴瘤診斷符合2017年WHO淋巴瘤診斷標準；(3)所有患者經(jīng)病理活檢確診并至少由兩位專業(yè)病理醫(yī)師審核。排除標準：(1)病史不明確；(2)病理診斷不明確。本研究已獲得北京大學口腔醫(yī)院生物醫(yī)學倫理委員會批準(PKUSSIRB-201949125)。

1.2 方法

1.2.1臨床情況分析 通過查閱患者的病歷，獲得性別、年齡、發(fā)病部位、臨床表現(xiàn)、治療方法等臨床資料，并通過電話隨訪。

1.2.2蘇木精-伊紅染色 所有標本取自于患者原發(fā)病灶，經(jīng)甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色。

1.2.3免疫組織化學標記 采用EnVision法，抗體CD20、CD3ε、CD138、AE1/AE3、Pax5、Ki-67、κ輕鏈和λ輕鏈均購自丹麥DAKO公司。每次均設(shè)有陽性對照，以磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)替代一抗作為陰性空白對照。

1.2.4免疫球蛋白基因重排分析 石蠟包埋組織 DNA 提取試劑盒購自德國QIAGEN公司，按照試劑盒說明書進行操作。免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)基因重排克隆性分析采用BIOMED-2方案[免疫球蛋白重鏈(immunoglobulin heavy chain，IgH)-FR1、IgH-FR2、IgH-FR3、免疫球蛋白κ鏈(immunoglobulin kappa chain，IgK)-A、IgK-B]，使用ABI3500基因分析儀進行毛細管電泳，結(jié)果使用GeneMapper軟件進行分析。毛細管電泳基因擴增的結(jié)果在目標片段范圍內(nèi)見明顯的尖銳擴增峰，可判讀為陽性，即存在單克隆性重排；若呈現(xiàn)連續(xù)的波浪小峰或數(shù)個低矮雜亂峰，甚至無峰出現(xiàn)則判讀為陰性。

1.2.5MALT1、IGH和BCL6基因斷裂的檢測 應用間期熒光原位雜交技術(shù)(fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)在3～4 μm厚的石蠟切片上進行，操作步驟按照說明書進行。MALT1雙色分離探針、IGH雙色分離探針、BCL6雙色分離探針均購自美國Vysis公司。封片后在熒光顯微鏡下觀察，計數(shù)200個腫瘤細胞核，超過15%的細胞核內(nèi)出現(xiàn)紅色和綠色分開(分開距離應大于點信號直徑的兩倍)的信號，判讀為陽性；或者出現(xiàn)3個或3個以上的紅色和綠色融合形成的黃色信號，亦判讀為陽性；否則為陰性。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 24.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，采用χ2檢驗、Fisher 精確檢驗法進行陽性率比較，檢驗水準α= 0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床情況

本研究共收集260例SS患者，其中男性19例，女性241 例(男 ∶女=1 ∶12.68)， 發(fā)病年齡為6～83歲(平均年齡為58.92歲)。SS患者中有16例惡變?yōu)镸ALT淋巴瘤，其惡變率約為 6.15%，惡變時間為3～240個月。SS-MALT淋巴瘤組包括2例男性和14例女性(男 ∶女=1 ∶7)，年齡范圍在 30～83歲(平均年齡為57.25 歲)； 腫瘤發(fā)生于腮腺者13例(81.25%)，舌下腺者2例(12.5%)，腭腺者1例(6.25%)。所有患者均行腫瘤切除術(shù)，截至2019年12月20日電話隨訪時，SS-MALT淋巴瘤組有2例患者因發(fā)生高級別轉(zhuǎn)化，進展為彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)而死亡。

2.2 組織形態(tài)、蛋白表達和分子表型特點

2.2.1HE染色鏡下表現(xiàn) SS-MALT淋巴瘤鏡下表現(xiàn)為腺泡不同程度萎縮破壞；部分病例可見腺腔囊性擴張；淋巴細胞彌漫浸潤，主要為中心細胞樣細胞(細胞小到中等、胞漿少、核形不規(guī)則且核仁不明顯、染色質(zhì)致密)、單核樣B細胞(細胞中等大小、胞漿淡染、核圓或稍有凹陷、有小核仁)和小淋巴細胞，可出現(xiàn)少量漿細胞和免疫母細胞；形成反應性淋巴濾泡，腫瘤細胞可浸潤淋巴濾泡形成濾泡植入；腺上皮破壞，可見淋巴上皮病變(圖1)。非SS-MALT淋巴瘤與SS-MALT淋巴瘤組織形態(tài)表現(xiàn)類似。

2.2.2免疫表型特點 SS-MALT淋巴瘤組與非SS-MALT淋巴瘤組CD20和Pax5均為陽性，陽性率100%(圖2)。對于Ki-67陽性率，SS-MALT淋巴瘤組≤10%者占50%(8/16)，>10%者占50%(8/16)；非SS-MALT淋巴瘤組≤10%者占66.7%(8/12)， >10%者占33.3%(4/12)。SS-MALT淋巴瘤組中37.5%(6/16)有κ及λ輕鏈限制性表達，非SS-MALT淋巴瘤組表達率為16.7%(2/12)。AE1/AE3染色顯示，兩組分別有93.75%(15/16)、83.3%(10/12)殘存腺上皮。全部病例腫瘤細胞CD3ε均為陰性，CD138染色顯示有1%～3%的漿細胞。

2.2.3PCR基因重排結(jié)果 應用IgH-FR1、IgH-FR2、IgH-FR3及IgK-A和IgK-B五組引物進行克隆性分析，15例(1例因蠟塊質(zhì)量差而排除)SS-MALT淋巴瘤病例中，14例檢測出單克隆性重排，靈敏度為93.3%。9例(3例因蠟塊質(zhì)量差而排除)非SS-MALT淋巴瘤患者有8例檢測出克隆性重排，其靈敏度為 88.9%。SS-MALT淋巴瘤組中IgH-FR1、IgH-FR2、IgH-FR3陽性檢出率分別為 33.3%、53.3%和33.3%(圖3A)；IgH三管聯(lián)合應用，檢出率為80%。IgK-A陽性檢出率為20%(圖3B)， IgK-B陽性率為26.7%，IgK兩管聯(lián)合應用陽性檢出率為40%。聯(lián)合應用IgH和IgK陽性檢出率達93.3%。非SS-MALT淋巴瘤組中IgH-FR1、IgH-FR2、IgH-FR3陽性檢出率分別為44.4%、44.4%和44.4%；三管聯(lián)合應用陽性檢出率為55.6%。IgK-A陽性檢出率為 55.6%，IgK-B陽性檢出率為11.1%；兩管聯(lián)合應用檢出率為55.6%。聯(lián)合應用IgH和IgK陽性檢出率可達88.9%。

2.2.4FISH分子表型 本研究選取11例SS-MALT淋巴瘤患者進行分子遺傳學研究，其中MALT1雙色分離探針陽性者4例(36.4%)， 2例為基因斷裂(圖4A)，2例為3基因拷貝，陰性者7例(63.6%)；IGH雙色分離探針陽性者3例(27.3%)， 3例均為基因斷裂，陰性者8例(72.7%)；BCL6雙色分離探針陽性者3例(27.3%)，其中1例為基因斷裂(圖4B)，2例為3基因拷貝，陰性者8例(72.7%)， 三種探針共同檢出率為72.7%。

3 討論

SS-MALT淋巴瘤是由SS惡變而來的一種低度惡性B細胞淋巴瘤。SS首先由瑞典眼科學家Sj?gren于1933年首次報道，提出眼干、口干為該疾病的主要臨床特征，其特征性病理學改變?yōu)橄袤w組織被密集淋巴細胞取代，形成淋巴濾泡以及上皮肌上皮島。SS發(fā)病率為 0.1%～4.8%，常發(fā)生于40歲以上的中老年女性，男女發(fā)病率之比為1 ∶9。SS一般臨床預后良好，但約有5%～10%惡變?yōu)榱馨土?。報道顯示，從SS惡變?yōu)榱馨土龅闹形粫r間為7.5年，惡變危險性較普通人群增加44倍，其發(fā)病率最高的為MALT淋巴瘤[5]。本研究中，260例SS患者有16例惡變?yōu)镾S-MALT淋巴瘤，其惡變率約為6.15%，惡變時間為3～240個月，與以往報道相符。MALT多發(fā)于中老年人，女性略多于男性，男女比約為1 ∶1.2[9]，而本研究SS-MALT淋巴瘤組男女比例為1 ∶7，女性發(fā)病率遠高于男性，這種差異可能與SS好發(fā)于女性相關(guān)。另外，本研究中有81.25% SS-MALT淋巴瘤患者的發(fā)病部位為腮腺，證實腮腺是SS-MALT淋巴瘤的最常見發(fā)病部位。

研究顯示，SS-MALT 淋巴瘤沒有特異的免疫組織化學標記物，其蛋白表達與邊緣區(qū)B淋巴細胞基本相同[10]，但需要和其他小 B 細胞淋巴瘤相鑒別：如套細胞淋巴瘤表達CD5、cyclinD1；淋巴漿細胞淋巴瘤表達CD138；濾泡性淋巴瘤表達CD5、CD10；小淋巴細胞性淋巴瘤表達CD5、CD23等[11]。臨床診斷工作中，Pax-5常作為B細胞的一種核標記物，與CD20共同使用，用于B細胞淋巴瘤的診斷和鑒別診斷。本研究中，SS-MALT淋巴瘤組與非SS-MALT淋巴組CD20和Pax-5陽性率均達100%。CD20的彌漫性陽性提示為B細胞淋巴瘤。Pax5基因是Pax基因家族的成員之一，具有編碼B細胞特異轉(zhuǎn)錄因子、抑制非B系細胞基因、調(diào)控B 細胞定向分化[12]和調(diào)節(jié) IgH基因VJ-DJ 重排的功能[13]。在免疫表型方面，SS-MALT淋巴瘤與非SS-MALT淋巴瘤基本相似，與其他部位MALT淋巴瘤相同，無明顯特異性。

A, FISH with a MALT1 dual-color break-apart probe. Arrows pointed to the separated red and the green signals (split signals) in a lymphoma cell nucleus, indicating a break of the region within the MALT1 gene (18q21.1). B, FISH with BCL6 dual-color break-apart probe. Arrows pointed to three fusion signals in a lymphoma cell nucleus, suggesting an intact BCL6 gene (3q27) with 3 copies (one extra copy).

B淋巴細胞分化中DNA發(fā)生特異性變化，造成Ig基因重排。當發(fā)生淋巴瘤時，B淋巴細胞表現(xiàn)為單克隆性增生，單克隆性的基因重排可以通過免疫組化、Ig基因擴增或者核酸分子雜交的方法檢測出來[14]。MALT淋巴瘤可用免疫球蛋白κ和λ輕鏈的限制性表達來評估B淋巴細胞克隆性增生的程度，是B淋巴細胞單克隆性增生的標志[15]。本研究對SS-MALT淋巴瘤組和非SS-MALT淋巴瘤組進行κ和λ限制性表達的檢測，其陽性率分別為37.5%和 16.7%，SS-MAT淋巴瘤組檢出率高于非SS-MALT淋巴瘤組，但兩者之間差異無統(tǒng)計學意義。通過PCR技術(shù)進行Ig基因重排的檢測，其陽性檢出率高于免疫組織化學法[16]。應用IgH-FR1、IgH-FR2、IgH-FR3三個框架區(qū)引物進行基因重排的檢測，SS-MALT淋巴瘤組的陽性檢出率分別為33.3%、53.3%、33.3%，F(xiàn)R2區(qū)引物檢出率高于FR1區(qū)和FR3區(qū)，但差異無統(tǒng)計學意義；三管聯(lián)合應用，陽性檢出率達80%。非SS-MALT淋巴瘤組三個框架區(qū)引物陽性檢出率均為44.4%，三管聯(lián)合應用檢出率達55.6%。IgH在SS-MALT淋巴瘤組陽性檢出率高于非SS-MALT淋巴瘤組，但差異無統(tǒng)計學意義。此外, 在B細胞淋巴瘤中有時會出現(xiàn)IgK基因的單克隆重排[17]。本研究中，SS-MALT淋巴瘤組與非SS-MALT淋巴瘤組IgK-A的陽性檢出率為20.0%和 55.6%，IgK-B陽性檢出率為 26.7%和11.1%。兩管聯(lián)合應用SS-MALT淋巴瘤組(40%)低于非SS-MALT淋巴瘤組(55.6%)，但差異無統(tǒng)計學意義。本研究中IgH和IgK基因重排在兩組的陽性檢出率差異無統(tǒng)計學意義；但IgH和IgK聯(lián)合應用，SS-MALT淋巴瘤組陽性檢出率高，可達93.3%，非SS-MALT淋巴瘤組達88.9%，明顯提高了石蠟組織標本Ig基因單克隆重排的檢出率，增加了疾病診斷的精準性。

染色體易位及基因異常與MALT淋巴瘤的診斷、治療和預后等相關(guān)，不同分子遺傳特征的MALT淋巴瘤在臨床分期和預后有一定差異?，F(xiàn)已證實的MALT淋巴瘤分子遺傳學改變有：t(11;18)(q21;q21)/API2-MALT1、t(14;18)(q32;q21)/IGH-MALT1、t(1;14)(p22;q32)/IGH-BCL10、t(3;14)(p14;q32)/IGH-FOXP1[18-19]和BCL6基因染色體易位[20]。研究表明，胃MALT淋巴瘤若伴有t(11;18)(q21;q21)，其臨床分期晚，侵襲性強，易向高級別轉(zhuǎn)化，且耐受幽門螺旋桿菌根除的標準治療方法，預后較差[21-22]。目前，有關(guān)染色體和基因異常在唾液腺SS-MALT淋巴瘤中的研究尚少。FISH作為檢測細胞染色體結(jié)構(gòu)及基因異常的一種分子細胞遺傳學技術(shù)，能準確地檢測淋巴瘤相關(guān)基因并顯示出拷貝數(shù)，具有快速、安全、敏感性強、特異性高的優(yōu)點[21]。本研究中MALT1雙色分離探針、IGH雙色分離探針、BCL6雙色分離探針的陽性檢出率分別為36.4%、27.3%和27.3%；三者聯(lián)合應用，基因異常檢出率為 72.7%，既包括基因斷裂，亦包括基因的多拷貝。因此，F(xiàn)ISH技術(shù)的應用可進一步提高SS-MALT淋巴瘤診斷的精確性和特異性。

大部分SS-MALT淋巴瘤預后良好，多數(shù)患者臨床表現(xiàn)和生物學行為呈惰性，但也有少部分SS-MALT淋巴瘤轉(zhuǎn)化為高度惡性的DLBCL。本研究中，2例患者因腫瘤高級別轉(zhuǎn)化為DLBCL而死亡，其中1例患者的Ki-67高達50%，另1例患者κ及λ輕鏈限制性表達(κ ∶λ>10 ∶1)。這些表現(xiàn)可能對SS-MALT淋巴瘤高級別轉(zhuǎn)化有提示意義，但由于本研究病例過少，需在增加病例數(shù)后進一步驗證。因此，SS-MALT淋巴瘤應定期復診和長期隨訪，及早發(fā)現(xiàn)復發(fā)和高級別轉(zhuǎn)化的線索，做到早發(fā)現(xiàn)、早治療，提高患者的生存率。

綜上所述，唾液腺SS-MALT淋巴瘤作為非霍奇金淋巴瘤中的一種低度惡性腫瘤，總體預后較好，但由于缺乏特異性的臨床表現(xiàn)及組織學形態(tài)特點，病理診斷過程中聯(lián)合應用組織形態(tài)觀察、免疫組織化學、PCR和FISH技術(shù)，將有助于該疾病的精準病理診斷，為唾液腺SS-MALT淋巴瘤的臨床規(guī)范化治療和預后評估提供參考依據(jù)。