韓婷婷，楊天資，趙培磊，祝軍，張玉剛，孫曉紅,3

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/青島市園藝植物遺傳改良與育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266109；2. 青島市黃島區(qū)自然資源局，山東青島 266555；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/山東省植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266109)

種質(zhì)資源是現(xiàn)代育種和生物技術(shù)研究的物質(zhì)基礎(chǔ)，是獲得生物新品種的遺傳保障。紅肉蘋果[Malussieversiif.neidzwetzkyana(Dieck) Langenf]原產(chǎn)于新疆天山山脈，屬新疆野蘋果的變型，具有早開花、早結(jié)果等特點(diǎn)。其枝葉花果均呈紅色，具有一定的觀賞價(jià)值；果實(shí)富含必需氨基酸和花青苷[1-2]，具有較高的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值；果實(shí)酸度高，加工特性好，可用于果品的加工?；谌绱硕嗟膬?yōu)異特性，紅肉蘋果是蘋果雜交育種中重要的種質(zhì)資源。

目前對(duì)新疆野蘋果的遺傳多樣性研究成果較多。董研等[3]利用SSR標(biāo)記技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)新疆野蘋果的遺傳變異主要存在于居群內(nèi)部，群體間分化很小。劉遵春等[4]對(duì)新疆野蘋果株系的花、葉片和果實(shí)的13個(gè)性狀系統(tǒng)進(jìn)行了性狀相關(guān)主成分和通徑分析，發(fā)現(xiàn)單果質(zhì)量存在較大遺傳變異。楊美玲[5]研究新疆野蘋果居群遺傳多樣性發(fā)現(xiàn)，新疆野蘋果在花粉形態(tài)、果實(shí)形態(tài)和種子大小等方面均存在遺傳多樣性。閆鵬等[6]對(duì)收集到的129個(gè)新疆野蘋果單株的12個(gè)數(shù)量性狀和5個(gè)質(zhì)量性狀進(jìn)行了遺傳多樣性及相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)新疆野蘋果果實(shí)相關(guān)性狀的多樣性指數(shù)(Diversity Index)H′高，變異幅度大。王憲璞等[7]對(duì)新疆野蘋果果實(shí)主要性狀進(jìn)行的遺傳多樣性分析結(jié)果表明，果實(shí)大小及形態(tài)的遺傳多樣性最為突出，符合Forsline和Aldwinckle[8]調(diào)查結(jié)果。新疆紅肉蘋果和白肉蘋果雜交后代的遺傳多樣性分析報(bào)道尚少。

本研究用新疆紅肉蘋果‘紅勛1號(hào)’(Hongxun No.1)花粉給白肉蘋果‘金冠’(Golden Delicious)授粉，獲得雜交F1代群體。以雜交群體為試材，從群體遺傳學(xué)角度對(duì)紅肉蘋果雜交群體的若干性狀進(jìn)行多樣性分析，為紅肉蘋果在蘋果育種應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

‘紅勛1號(hào)’是課題組從新疆收集的紅肉蘋果，‘金冠’是傳統(tǒng)的栽培品種，二者在花、葉和果實(shí)方面的性狀(見圖1)表觀差異顯著。

2012年4月下旬，在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)膠州現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園，以‘金冠’為母本，人工授‘紅勛1號(hào)’花粉后套袋，正常管理。秋季收獲雜交種子，冰箱層積兩個(gè)月左右，2013年3月中旬播種于大棚穴盤中，獲得實(shí)生苗。2014年春將雜種實(shí)生苗嫁接到‘八棱海棠’砧木上，每棵砧木在東西對(duì)稱位置上嫁接相同兩芽。2015年春季進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，共嫁接成活164株系(相同兩芽為一個(gè)株系)。2018年和2019年春秋兩季對(duì)雜種后代的各表觀性狀進(jìn)行觀察并拍照，隨后進(jìn)行科學(xué)統(tǒng)計(jì)并采集試樣分析。夏末季節(jié)采集葉樣品，采集原則是取當(dāng)年生枝條上端完全伸展的第5～7片葉子，成熟果實(shí)樣品采集原則是在果樹四周距地面1.2～1.7 m處取無病蟲害果子，保存于冷庫(kù)中。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 描述型性狀測(cè)定

采用直接觀察法評(píng)定與雜交群體的花、葉、枝相關(guān)的描述型性狀，具體包括花期、花色、葉色和枝色。

1.2.2 數(shù)值型性狀測(cè)定

對(duì)13個(gè)數(shù)值型性狀采用常規(guī)測(cè)量法測(cè)量并計(jì)算，包括單果重、果實(shí)縱徑、橫徑、果形指數(shù)、洼深、梗長(zhǎng)、果實(shí)硬度、可溶性固形物、可滴定酸、糖酸比、花青苷共11個(gè)與果實(shí)相關(guān)的性狀及葉長(zhǎng)、葉寬2個(gè)與葉片相關(guān)的性狀。使用電子天平(TD5001C)稱量果實(shí)單果重；游標(biāo)卡尺(SLKC)測(cè)量果實(shí)洼深、梗長(zhǎng)、果實(shí)縱徑、果實(shí)橫徑和葉片長(zhǎng)度、寬度，并計(jì)算果形指數(shù)；使用硬度儀(GY-J-4)測(cè)定果實(shí)硬度；使用糖酸檢測(cè)儀(PAL-BX/ACID 5)測(cè)定果實(shí)可溶性固形物、總酸，并計(jì)算糖酸比；使用pH計(jì)(DOUBLE JUNCTION)測(cè)定果實(shí)pH值；參照孫曉紅等[9]花青苷提取方法，利用紫外分光光度計(jì)(UV-5100)測(cè)定雜交果實(shí)花青苷含量[10]。其中：?jiǎn)喂孛恐觌S機(jī)取20個(gè)果實(shí)進(jìn)行測(cè)量；果實(shí)縱經(jīng)、橫經(jīng)、洼深、梗長(zhǎng)每株隨機(jī)取10個(gè)果實(shí)進(jìn)行測(cè)量；果實(shí)硬度、可溶性固形物、可滴定酸、糖酸比、花青苷每株系取5個(gè)果實(shí)進(jìn)行測(cè)定；葉長(zhǎng)、葉寬每株取20片葉子進(jìn)行測(cè)量。每株的測(cè)量或測(cè)定結(jié)果取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel和DPS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。數(shù)值型性狀的遺傳多樣性采用標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation，SD)、變異系數(shù)(Coefficient of Variation, CV)、H′等表示，其中H′每0.5 SD為一個(gè)等級(jí)，統(tǒng)計(jì)各性狀在每級(jí)出現(xiàn)的組中值及頻率，采用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)衡量其遺傳多樣性，計(jì)算公式為：H′=-∑PilnPi，Pi為某一性狀第i個(gè)類型出現(xiàn)的頻率；對(duì)描述型性狀予以賦值，同樣采用H′以反映各性狀的遺傳多樣性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 描述型性狀的遺傳多樣性分析

蘋果是高度雜合的二倍體，雜交后代性狀分離明顯。雜交群體在花期、花色、葉色和枝色上均出現(xiàn)了明顯的分離。對(duì)供試雜交群體的4個(gè)描述型性狀進(jìn)行遺傳多樣性分析(表1)，可以看出雜交群體描述型性狀多樣性指數(shù)的變化范圍為0.68～1.75，大小順序是花色>花期>葉色>枝色；分析4個(gè)描述型性狀在兩個(gè)雜交群體后代中的分布頻率發(fā)現(xiàn)，相較于綠色枝條，紅色枝條占比較大，相較于綠色葉片，紫色葉片占比較大；雜交群體紫紅色花瓣所占比例相對(duì)淺色花瓣高，占比為47.56%；此外，雜交群體中同一時(shí)間處于盛花期的花朵在一半以上，一定程度上說明雜交群體均具有花期提前的特點(diǎn)，表明紅肉蘋果‘紅勛1號(hào)’對(duì)雜交后代花期的改變具有較大貢獻(xiàn)。

表1 雜交群體描述型性狀分布頻率和多樣性

2.2 數(shù)值型性狀的遺傳多樣性分析

采用具體測(cè)量法對(duì)兩個(gè)紅肉蘋果雜交群體的13個(gè)數(shù)值型性狀分別進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各性狀的平均值、變異幅度、SD、CV和H′，分析雜交群體在各個(gè)數(shù)值型性狀上的分離情況。

雜交群體11個(gè)果實(shí)相關(guān)性狀及2個(gè)葉片性狀的測(cè)定結(jié)果見表2。由表2可以看出雜交群體各性狀的多樣性差異均很大，CV的變化范圍是0.08～1.72，H′的變化范圍是0.56～2.14。在上述兩個(gè)雜交群體中，果形指數(shù)的變化范圍為0.72～1.14，平均值為0.899，其CV最小，H′也較小，而花青苷含量的變異幅度較大，其CV最大，表明‘紅勛1號(hào)’和‘金冠’雜交的后代果實(shí)的果形為近圓形且變異較小，分離程度低，但在花青苷含量性狀上分離明顯；CV處于中間水平的性狀包括葉長(zhǎng)、葉寬、洼深、果實(shí)硬度和果梗長(zhǎng)，分析上述性狀的H′發(fā)現(xiàn)葉寬在雜交群體中均有最高的遺傳多樣性，同時(shí)果實(shí)硬度也表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性；此外，單果重和糖酸比也具有較高CV，表明在雜交群體后代中對(duì)以上2個(gè)性狀做進(jìn)一步選擇的潛力較大，有利于從中選擇大小合適且風(fēng)味佳的優(yōu)系做進(jìn)一步評(píng)價(jià)。

表2 雜交群體數(shù)值型性狀的變異統(tǒng)計(jì)分析

綜合比較雜交群體數(shù)值型性狀的CV和H′發(fā)現(xiàn)，以上13個(gè)性狀中的8個(gè)CV值大于0.20，最大CV值是花青苷含量，為1.72，其次是糖酸比CV值，最小是果形指數(shù)CV值，為0.08；遺傳多樣性指數(shù)H′值中，除單果重和糖酸比偏低，其余11個(gè)性狀的H′值均在1.20以上，具有豐富的多樣性。

2.3 數(shù)值型性狀的分布頻率

雜交群體各數(shù)值型性狀的分級(jí)數(shù)值及分布頻率統(tǒng)計(jì)情況分別見表3。如表3所示，上述雜交群體各數(shù)值型性狀中大多數(shù)性狀存在不同程度的趨中傾向，其中，果實(shí)硬度、洼深、果形指數(shù)、pH值、花青苷含量和葉長(zhǎng)在雜交群體中有明顯的趨中傾向。

單果重是衡量果實(shí)大小的重要指標(biāo)，雜交群體單果重分布于第1～3級(jí)(29.83～65.10 g)的比例高達(dá)82.24 %，分布于第8～10級(jí)(165.35～194.73 g)的比例為5.11 %。由此可見，單果重在雜交群體中表現(xiàn)出明顯的趨極現(xiàn)象，而且較之兩個(gè)親本更趨向于小果型親本‘紅勛1號(hào)’，呈衰退趨勢(shì)。

糖酸比是評(píng)價(jià)果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，本試驗(yàn)所用親本‘金冠’的糖酸比為6.61，‘紅勛1號(hào)’為6.81。雜交群體糖酸比的中親值為6.71，平均糖酸比(16.6)高于中親值和最優(yōu)親本值，具有中親優(yōu)勢(shì)和超親優(yōu)勢(shì)的比例分別占147.39%和143.76%，分析其在各等級(jí)的分布情況發(fā)現(xiàn)糖酸比分布在第1級(jí)(<6.52)的占比高達(dá)66.37 %，而且同樣存在中親優(yōu)勢(shì)(175.36%)和超親優(yōu)勢(shì)(123.20%)，表明雜交群體的糖酸比受父本‘紅勛1號(hào)’的影響較大，但仍存在高糖酸比的果實(shí)，具有進(jìn)一步篩選獲得高糖酸比優(yōu)株的潛力。

表3 雜交群體數(shù)值型性狀的分組數(shù)值和分布頻率

續(xù)表3

花青苷類物質(zhì)是紅肉蘋果中的重要營(yíng)養(yǎng)成分，具保健價(jià)值。本試驗(yàn)雜交群體果實(shí)中花青苷含量的性狀分離廣泛，花青苷含量的H′為1.44，平均含量為0.16 mg/g，而鮮果中花青苷含量分布于第1～5級(jí)(≤0.06 mg/g)的占比高達(dá)75.45%，以上結(jié)果表明紅肉蘋果‘紅勛1號(hào)’與白肉蘋果雜交后代中大部分果實(shí)花青苷含量低于紅肉親本的花青苷含量(0.07 mg/g)，但仍存在超親優(yōu)勢(shì)。

3 討論

本研究所用的母本‘金冠’是中晚熟蘋果品種，果面金黃色，風(fēng)味酸甜適度，肉質(zhì)細(xì)脆，具濃郁芳香，適于鮮食；父本‘紅勛1號(hào)’平均單果重28.8 g，果實(shí)含酸量高，總酸為17.32 g/kg，出汁率為78.35%，可溶性固形物含量為13.5%，富含花青苷[11-12]。

植物表型多樣性是遺傳多樣性和環(huán)境多樣性的綜合體現(xiàn)，對(duì)表型性狀的研究可以從整體上了解研究對(duì)象的多樣性程度[13-14]。馮濤等[15]發(fā)現(xiàn)新疆野蘋果果實(shí)形態(tài)性狀中單果重的變異幅度較大，CV高達(dá)0.297，在本試驗(yàn)中，‘金冠’ב紅勛1號(hào)’雜交群體單果重的CV在0.5以上，進(jìn)一步選擇的潛力很大。此外，單果重在本試驗(yàn)中雜交群體均明顯的趨向于小果型親本，表現(xiàn)出明顯的衰退現(xiàn)象，與前人研究結(jié)果一致[16]。研究發(fā)現(xiàn)花青苷在上述雜交群體中的分離廣泛，雜交群體中H′較高，這一結(jié)果也與陳學(xué)森等[17]的研究結(jié)果一致。閆鵬等[6]研究新疆野蘋果可溶性固形物含量的CV為0.20，H′為1.997，王憲璞等[7]的研究結(jié)果顯示新疆野蘋果可溶性固形物含量、可溶性糖含量和可滴定酸含量的CV分別為0.13、0.18和0.38，這些結(jié)果表明糖酸組分存在豐富的遺傳變異。本試驗(yàn)中對(duì)雜交群體pH值和可溶性固形物含量的分析結(jié)果顯示，二者的CV低于0.20，其遺傳多樣性與新疆野蘋果存在一定差異。雜交群體果實(shí)可溶性固形物和pH值的CV雖較小，但糖酸比的CV大，故推測(cè)上述雜交群體果實(shí)中存在部分高糖低酸或低糖高酸的果實(shí)。雜交群體糖酸比分布在第1級(jí)(<6.52)的占比在55%以上，且具有超親優(yōu)勢(shì)，表明上述雜交群體中確實(shí)存在大量高糖低酸的果實(shí)。此外，雜交群體糖酸比的H′較小，與CV趨勢(shì)相反，而且該現(xiàn)象普遍存在[18]，上述差異可能是因?yàn)樘撬岜却嬖谮厴O現(xiàn)象，均勻度低。

綜上所述，‘金冠’ב紅勛1號(hào)’雜交群體中各個(gè)性狀均存在一定程度的分離，其中糖酸比和花青苷含量的變異程度較大，分別為1.72和1.13。在遺傳多樣性方面除單果重和糖酸比外其他性狀的H′均在1.2以上，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性，單果重在雜交群體中均表現(xiàn)出衰退趨勢(shì)，而糖酸比具有超親優(yōu)勢(shì)。在果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)方面，花青苷含量的變異程度最高 ，糖酸比的變異程度次之，所以，雜交群體可為紅肉蘋果的營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味品質(zhì)遺傳改良提供豐富的種質(zhì)資源，可據(jù)此選育富含花青苷且糖酸適中的功能型蘋果優(yōu)株。綜上所述，紅肉蘋果‘紅勛1號(hào)’雜交群體對(duì)于選擇富含花青苷和高糖酸比的果品具有資源優(yōu)勢(shì)，但對(duì)于生產(chǎn)大果型紅肉蘋果可能需要進(jìn)一步回交。