王維華，郭永剛，李敏

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東青島266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院；3.淄博市周村區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村服務(wù)中心，山東淄博 255300)

植物根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)是植物根系定居性內(nèi)寄生生物，分布廣泛，且寄主繁多，隨著我國(guó)大量高毒殺線蟲劑的禁用及根結(jié)線蟲對(duì)傳統(tǒng)殺線蟲劑抗藥性的累積，根結(jié)線蟲病害的防治形勢(shì)嚴(yán)峻[1]。西瓜是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，設(shè)施西瓜連作加劇了根結(jié)線蟲病的發(fā)生。

研究發(fā)現(xiàn)輪作辣椒能有效降低西瓜根內(nèi)根結(jié)線蟲繁殖體數(shù)量，減輕西瓜根結(jié)線蟲病的危害程度[2]，而不同的辣椒品種對(duì)根結(jié)線蟲的抗性不同[3]。用抗根結(jié)線蟲辣椒與黃瓜和葫蘆輪作極大降低土壤中根結(jié)線蟲二齡幼蟲和卵的密度，減輕黃瓜根結(jié)線蟲病的危害[4]。植物根系分泌物中的揮發(fā)性物質(zhì)作為信號(hào)分子在根結(jié)線蟲侵染識(shí)別過(guò)程中發(fā)揮著主導(dǎo)作用[5]。

為探究抗線蟲辣椒品種在西瓜輪作過(guò)程中對(duì)西瓜根結(jié)線蟲病害的效應(yīng)，本試驗(yàn)選取了對(duì)根結(jié)線蟲抗性不同的2個(gè)辣椒品種，利用根系分泌物自動(dòng)收集裝置收集根系分泌物，并用GC-MS進(jìn)行成分分析。用辣椒根系分泌物分別處理南方根結(jié)線蟲卵粒及二齡幼蟲，結(jié)合兩品種根系分泌物成分比對(duì)，初步探究抗病辣椒根系分泌物中的特異化感物質(zhì)對(duì)根結(jié)線蟲的抑制作用，為進(jìn)一步探討辣椒輪作防控西瓜根結(jié)線蟲病害的機(jī)制及根結(jié)線蟲病害的綜合防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 辣椒根系分泌物的成分分析

1.1.1 根系分泌物自動(dòng)收集

試驗(yàn)于2016年7～8月在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)日光溫室進(jìn)行。辣椒品種為中抗線蟲品種‘青農(nóng)簇生椒’(青島農(nóng)業(yè)大學(xué))和感病品種‘農(nóng)家小尖椒’(哈爾濱金龍農(nóng)業(yè)有限公司)。2016年7月1日辣椒種子催芽，7月5日播種，8月15日，將苗用去離子水沖洗干凈，移栽到根系分泌物自動(dòng)收集裝置中[6]。收集分泌物的色譜柱中裝有XAD-4大孔吸附樹脂(SIGMA-ALDRICH.CO.)，樹脂柱規(guī)格為15 mm×300 mm，采用濕法裝柱。開(kāi)啟裝置，控制離子水流量為1 L·h-1，連續(xù)收集10 d。將收集10 d的色譜柱取下，先用500 mL去離子水清洗，再用200 mL正己烷洗脫。將洗脫液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上40 ℃下減壓旋蒸至正己烷揮發(fā)完全，用10 mL甲醇溶解干物質(zhì)，獲得2種根系分泌物，于4 ℃下保存。

1.1.2 辣椒根系分泌物成分

采用GC-MS進(jìn)行分析，參考陳瀟[6 ]的方法。氣相色譜儀為Agilent 6980N；質(zhì)量選擇檢測(cè)器為Agilent Technologies 5973；分析軟件為Agilent Chemstation，通過(guò)Agilent Chemstation化學(xué)工作站檢索Nist標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)確定化合物。

1.2 辣椒分泌物對(duì)西瓜根線蟲的影響

2016年9～11月在日光溫室內(nèi)進(jìn)行。共設(shè)3個(gè)處理，6次重復(fù)。將‘京欣4號(hào)’西瓜種子催芽后，播種于裝有滅菌基質(zhì)(草炭∶蛭石體積比=2∶1)的15 cm×20 cm花盆中，每盆留1株壯苗。三葉一心時(shí)，接種3×105個(gè)·L-1根結(jié)線蟲卵懸浮液10 mL，同時(shí)分別澆灌1 mL·L-1不同品種辣椒根系分泌物提取液10 mL·株-1，以等量滅菌的蒸餾水為對(duì)照。50 d后測(cè)定根圍和根內(nèi)根結(jié)線蟲數(shù)量。

1.2.1 西瓜根圍根結(jié)線蟲和卵粒數(shù)的計(jì)數(shù)方法

采用離心漂浮分離法和乳酚油-酸性品紅溶液染色法[7]，分別測(cè)定西瓜根內(nèi)二齡幼蟲、雌成蟲數(shù)和根圍土壤二齡幼蟲、卵粒數(shù)等。將根系切成0.5～1.5 cm小段，混勻后隨機(jī)取1 g鮮質(zhì)量根采用酸性品紅液染色法，于顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)根內(nèi)線蟲數(shù)量，表示方法為條·g-1。取100 g根圍土壤于燒杯內(nèi)，注水至600 mL；攪拌20 s靜止1 min后，將上清液經(jīng)500 μm網(wǎng)篩倒入38 μm網(wǎng)篩內(nèi)，收集38 μm網(wǎng)篩內(nèi)的土壤和線蟲混合物，并在3 000 r·min-1離心5 min， 棄上清液并加入38.5%蔗糖溶液，充分混勻后3 000 r·min-1離心30 s，將上清液傾入26 μm網(wǎng)篩中，收集網(wǎng)篩中線蟲和卵粒，定容并于體視顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.2.2 南方根結(jié)線蟲孵化率測(cè)定

按照呂星光[8]的方法測(cè)定。取已滅菌的直徑9 cm的培養(yǎng)皿，挑取并加入約100粒經(jīng)1% H2O2表面消毒過(guò)的根結(jié)線蟲卵粒，分別加入兩種辣椒分泌物提取液10 mL，以滅菌的去離子水為對(duì)照。每處理重復(fù)3次。25 ℃黑暗培養(yǎng)。第2天開(kāi)始觀察線蟲孵化情況，并每隔24 h觀察一次，觀察至第10天為止，計(jì)算線蟲卵孵化率。

1.3 鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)南方根結(jié)線蟲的影響

鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)為分析純，南方根結(jié)線蟲卵粒及二齡幼蟲由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)菌根研究所提供。

線蟲孵化率和死亡率測(cè)定 取已滅菌的直徑9 cm的培養(yǎng)皿，挑取并加入約100粒經(jīng)1 % H2O2表面消毒過(guò)的根結(jié)線蟲卵粒，分別加入濃度為0.1、0.2、0.3、0.4 mL·L-1的DBP水溶液，以滅菌蒸餾水為對(duì)照。計(jì)算線蟲卵孵化率。25 ℃黑暗培養(yǎng)，24 h后觀察二齡幼蟲成活情況，并計(jì)算線蟲死亡率及校正死亡率。殺線蟲強(qiáng)弱分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)按Chandravadana等[9]的方法進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及處理

采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，用DPS 7.05軟件進(jìn)行方差顯著性分析(LSD法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒根系分泌物對(duì)線蟲孵化率的影響

如圖1所示，各處理的線蟲孵化率均隨時(shí)間而呈“S”型曲線增長(zhǎng)，除了在2 d和4 d對(duì)照(CK)與‘農(nóng)家小辣椒’根分泌物處理的差異不顯著外，其余均顯著高于兩種辣椒分泌物處理。在處理1～6 d，兩種辣椒根系分泌物的線蟲孵化率間無(wú)顯著性差異，各處理孵化率增幅均在4～6 d達(dá)到最高，其中對(duì)照孵化率增幅最高，為16.67%。處理6 d至10 d，各處理的線蟲孵化率增幅均逐漸減小。在處理后10 d，對(duì)照的線蟲孵化率最高，為84.33%；‘青農(nóng)簇生椒’根系分泌物處理的線蟲孵化率最低，為60.67 %；‘農(nóng)家小尖椒’分泌物處理的線蟲孵化率為70.33 %。在7～10 d，兩種辣椒分泌物處理的線蟲孵化率均存在顯著性差異?？梢?jiàn)，兩辣椒品種根系分泌物均能顯著抑制根結(jié)線蟲孵化，而且抗線蟲品種 ‘青農(nóng)簇生椒’根系分泌物對(duì)線蟲孵化的抑制作用高于‘農(nóng)家小尖椒’。

2.2 辣椒根系分泌物對(duì)西瓜根系根結(jié)線蟲數(shù)量的影響

由表1可知，‘青農(nóng)簇生椒’辣椒分泌物處理的西瓜根內(nèi)及根圍根結(jié)線蟲數(shù)量均顯著低于對(duì)照；‘農(nóng)家小尖椒’分泌物處理的西瓜根圍根結(jié)線蟲幼蟲和卵粒數(shù)量均顯著高于‘青農(nóng)簇生椒’， 且與對(duì)照差異顯著?！r(nóng)家小尖椒’處理的西瓜根內(nèi)根結(jié)線蟲二齡幼蟲和雌成蟲數(shù)量均次于對(duì)照，且高于‘青農(nóng)簇生椒’處理；‘農(nóng)家小尖椒’根內(nèi)二齡幼蟲與對(duì)照差異不顯著，而根內(nèi)雌成蟲數(shù)量顯著高于對(duì)照且與‘青農(nóng)簇生椒’間不存在顯著性差異。

表1 辣椒根系分泌物對(duì)西瓜根內(nèi)和根圍根結(jié)線蟲數(shù)量的影響Table 1 Effect of root exudates on the number of root knot nematodes in watermelon roots and rhizosphere 單位：(個(gè)·g-1)

2.3 兩品種辣椒根系分泌物成分對(duì)比

在辣椒品種‘青農(nóng)簇生椒’和‘農(nóng)家小尖椒’根系分泌物中，分別檢測(cè)到了17種和18種化學(xué)物質(zhì)，包括酯類、烴類、酚類和胺類等(表2)。對(duì)比兩個(gè)品種辣椒根系分泌物發(fā)現(xiàn)，‘青農(nóng)簇生椒’中出現(xiàn)了‘農(nóng)家小尖椒’沒(méi)有的鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)。

表2 辣椒根系分泌物中化感物質(zhì)Table 2 Allelopathic substance in root exudates of pepper

2.4 不同濃度DBP對(duì)線蟲孵化率的影響

如圖2所示，各處理的線蟲孵化率均隨時(shí)間而呈“S”型曲線增長(zhǎng)，對(duì)照組孵化率均高于其他處理。在處理第3天，除對(duì)照組外，各處理間沒(méi)有顯著性差異，僅4 mL·L-1DBP與對(duì)照間差異顯著；各處理孵化率增幅均在第4～6天達(dá)到最高，其中對(duì)照孵化率增幅最高，為16.67%，DBP濃度由低至高其線蟲孵化率最高增幅為13.00%、10.33%、9.67%和9.33%。從第6天至第9天，各處理的線蟲孵化率增幅均逐漸減小。在處理后第10天，對(duì)照的線蟲孵化率最高，為84.33%；3 mL·L-1和4 mL·L-1DBP的線蟲孵化率最低，分別為57.33%和55.33%，兩個(gè)處理間無(wú)顯著性差異。綜上所述，線蟲孵化率隨DBP濃度的升高而降低。

2.5 不同濃度DBP對(duì)二齡幼蟲死亡率的影響

由表3可見(jiàn)，DBP對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲具有顯著的殺滅作用，且其死亡率及校正死亡率與DBP的濃度呈正相關(guān)。對(duì)照的死亡率為45.00%，與對(duì)照相比，4 mL·L-1DBP的死亡率、校正死亡率最高，分別為94.44%、90.85%，活性強(qiáng)度為強(qiáng)活性；其次為3 mL·L-1DBP的死亡率、校正死亡率分別為79.30%、63.63%，活性強(qiáng)度為較強(qiáng)活性；4 mL·L-1與3 mL·L-1DBP的死亡率、校正死亡率不存在顯著性差異。1 mL·L-1與2 mL·L-1DBP的死亡率、校正死亡率分別為53.22%、16.68%和58.41 %、26.01 %，且與對(duì)照間無(wú)顯著性差異，活性強(qiáng)度均為弱活性。

表3 不同濃度DBP對(duì)二齡線蟲死亡率的影響Table 3 Effect of different concentrations of DBP on the mortalities of nematode J2

3 結(jié)論與討論

植物根系分泌物與線蟲的生長(zhǎng)和繁殖密切相關(guān)[7]。植物根系能夠向根際釋放大量的化感物質(zhì)，這些物質(zhì)可以對(duì)土壤生物產(chǎn)生直接或間接的影響，當(dāng)然也包括線蟲[10]。根系分泌物中的化學(xué)物質(zhì)可以吸引線蟲向根部移動(dòng)或反向排斥，或抑制線蟲的運(yùn)動(dòng)能力，甚至使線蟲死亡。感病材料根系分泌物能夠促進(jìn)胞囊線蟲卵粒的孵化，而抗病材料根系分泌物則對(duì)線蟲卵孵化具有明顯的抑制作用[11-12]?？剐苑颜枘靖捣置谖锟芍苯踊蜷g接抑制南方根結(jié)線蟲卵孵化與發(fā)育，從而抑制線蟲在寄主根內(nèi)的發(fā)育繁殖和再侵染；與感病番茄相比，抗性番茄根系分泌物的抑制效果更為明顯，且隨抗性増強(qiáng)抑制效果增加[13]。將不同抗性的茄子砧木接種南方根結(jié)線蟲后，感病品種根系分泌物能夠明顯刺激線蟲卵的孵化，而抗病品種在線蟲侵染初期表現(xiàn)出顯著抑制作用[14]，這可能是由于兩種植物根系化感物質(zhì)成分的差異造成的。從高抗、中抗和感病番茄材料的根系分泌物中均得到了DBP，且在未接種南方根結(jié)線蟲前3種番茄根系分泌物中的DBP含量相近，而接種后根系分泌物中DBP含量隨番茄材料抗線蟲能力的增強(qiáng)而升高。感病番茄根系分泌物對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲具有吸引作用，而抗病番茄根系分泌物對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲具有排斥作用，且隨抗性増強(qiáng)而增加[15]。

耿廣東等[16]采用GC-MS分析法發(fā)現(xiàn)辣椒根系分泌物含有多種化感物質(zhì)，其中DBP的含量最高。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)根結(jié)線蟲抗性不同的兩個(gè)辣椒品種的根系分泌物組成成分進(jìn)行比對(duì)和分析，共獲得21種物質(zhì)。其中，在抗線蟲辣椒品種‘青農(nóng)簇生椒’中出現(xiàn)了感病辣椒品種‘農(nóng)家小尖椒’根系分泌物中沒(méi)有的酯類——DBP。本試驗(yàn)進(jìn)一步分析了不同濃度的DBP處理的線蟲孵化和二齡幼蟲成活情況，隨著DBP濃度的升高，南方根結(jié)線蟲的生長(zhǎng)和繁殖也均受到了抑制作用。結(jié)論認(rèn)為辣椒根系分泌的化感物質(zhì)DBP，在抑制南方根結(jié)線蟲的生長(zhǎng)和繁殖方面起到了積極作用。可以推測(cè)，輪作抗線蟲辣椒根系分泌的化感物質(zhì)BDP是防控西瓜根結(jié)線蟲病害的可能機(jī)制之一。

本試驗(yàn)分析了抗性不同的兩種辣椒根系分泌物處理南方根結(jié)線蟲卵的孵化和根圍二齡幼蟲和卵粒數(shù)量的情況，結(jié)果表明，抗線蟲品種‘青農(nóng)簇生椒’根系分泌物對(duì)線蟲孵化的抑制作用高于‘農(nóng)家小尖椒’?！噢r(nóng)簇生椒’辣椒分泌物處理的西瓜根內(nèi)及根圍根結(jié)線蟲二齡幼蟲和卵粒數(shù)量均低于‘農(nóng)家小尖椒’。而兩種辣椒材料均對(duì)根結(jié)線蟲具有抑制作用，推測(cè)在辣椒根系分泌物中還有其他能夠拮抗根結(jié)線蟲的化感物質(zhì)，且該物質(zhì)同時(shí)存在于兩種辣椒材料中，從而導(dǎo)致不含DBP的‘農(nóng)家小尖椒’對(duì)線蟲也有一定的抑制作用。