陳果，曲衍杰，任桓質(zhì)，于柏，張玉剛，祝軍，侯鴻敏

(1.青島農(nóng)業(yè)大學園藝學院/青島市園藝植物遺傳改良與育種重點實驗室，山東青島 266109；2.萊陽市照旺莊鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術推廣站，山東煙臺 265200)

葡萄(Vitisvinifera)是我國最重要的經(jīng)濟果樹之一，具有很高的經(jīng)濟價值。在自然條件下，植物體無法隨意的移動，其生存環(huán)境是相對固定的，因此，高鹽條件成為了干擾植物正常生長發(fā)育的主要因素之一[1]。現(xiàn)如今，土地鹽堿化的不斷加重，嚴重影響葡萄的產(chǎn)量和以葡萄為原料的加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。據(jù)研究表明，全球鹽堿地總面積已超過9.5億hm2，其中我國的鹽堿地面積總計約為9 900萬hm2[2]。所以，植物體為了維持自身在逆境條件下的正常生長與發(fā)育，通過建立不同的脅迫響應機制來抵抗各種逆境條件[3]。近年來，已有相關研究表明，當植物體受到不同的逆境脅迫時，轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控相關基因的表達，在抗逆應答反應中發(fā)揮作用[4]。

Squamosa啟動子結(jié)合蛋白(Squamosa promoter Binding Protein, SBP)最初是從金魚草(Antirrhinummajus)中分離出來的一類轉(zhuǎn)錄因子。因為SBP基因都擁有一個SBP保守結(jié)構(gòu)域，所以被認為是轉(zhuǎn)錄因子[5]。SBP保守結(jié)構(gòu)域是一個高度保守的DNA結(jié)合域[6-7]，大約由79個氨基酸殘基組成，包括兩個相互作用且缺一不可的鋅指結(jié)構(gòu)，N端為Cys-Cys-His-Cys，C端為Cys-Cys-Cys-His或Cys-Cys-Cys-Cys[8],并且能與順式作用元件TNCGTACAA結(jié)合，其核心序列為GTAC[9]。該基因已陸續(xù)從擬南芥[10]、白樺樹[11]、衣藻[12]、苔蘚[13]、番茄[14]、水稻[15]中分離出來。前期大量的研究表明SBP基因在調(diào)控植物開花時間[16-19]、葉片發(fā)育[20-22]、植物激素信號轉(zhuǎn)導[23-24]、果實著色和成熟[25-26]等諸多方面起著重要作用。

近年來，也有一些關于該轉(zhuǎn)錄因子在植物非生物脅迫[27-29]方面的功能逐漸被關注。2014年，Cui等[30]發(fā)現(xiàn)，SPL9基因被miR156下調(diào)后，參與了擬南芥響應鹽和干旱脅迫的反應；2015年Tan等[31]發(fā)現(xiàn)SBP基因在白菜中可以響應各種激素處理及非生物脅迫；類似的，2016年Song等[32]的研究也證明了該基因在菊花中同樣具有響應激素處理及非生物脅迫的功能；2017年Arshad等[33]發(fā)現(xiàn)MicroRNA156通過降低SBP基因的表達量改善了轉(zhuǎn)基因苜蓿干旱、鹽脅迫耐性；2018年Hou等[34]通過擬南芥的異源表達證明了某些葡萄SPL基因的耐鹽功能；2019年Wang等[35]通過整合miRNA-Seq和RNA-Seq數(shù)據(jù)研究了miR156/SPL模塊在耐鹽性中的作用；2020年Zhang等[27]的研究發(fā)現(xiàn)CaSBP12基因的過表達提高了辣椒對鹽脅迫的敏感性。本研究通過農(nóng)桿菌介導法將葡萄VpSBP3轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥中異源表達，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥株系，并通過非生物脅迫及生理指標的測定初步明晰VpSBP3轉(zhuǎn)錄因子在葡萄抗逆性方面的功能。該研究在擴大葡萄栽培面積、增加葡萄產(chǎn)量、提高葡萄品質(zhì)方面有著一定的意義，為以后SBP家族基因在葡萄抗逆性方面的研究奠定了前期理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試材選用‘白河35-1’(Vitispseudoreticulata‘Baihe-35-1’)葡萄株系, 擬南芥(Arabidopsisthaliana)哥倫比亞CO、克隆載體pGEM-T、pCAMBIA2300質(zhì)粒為本實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1VpSBP3基因的克隆

本試驗參照原平皓植物RNA快速提取試劑盒說明書，采用液氮研磨法提取‘白河35-1’葉片RNA，用DNaseⅠ處理總RNA，參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA的合成，具體試驗步驟參照沙婷[36]的實驗方法。根據(jù)歐洲葡萄SBP基因的同源序列設計特異引物，設計帶有XbaⅠ和KpnⅠ酶切位點的引物，上游引物為F：5′-GGCTCTAGAATGGGCTATAATCTGAAGAC-3′XbaⅠ，下游引物為R：5′-GGTACCCTACTCCCAAGAGAACGAGA-3′KpnⅠ。以‘白河35-1’葉片cDNA為模板擴增獲得VpSBP3目的片段，送TaKaRa公司測序。

1.2.2VpSBP3基因組DNA序列的擴增

本試驗參照林延翔[37]的實驗步驟，利用天根公司的DNA提取試劑盒，通過液氮研磨法提取‘白河35-1’葉片總DNA。然后，參照侯鴻敏[38]的擴增反應體系，以‘白河35-1’葉片總DNA為模板進行PCR擴增。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的獲得

利用雙酶切法將VpSBP3基因連接到載體pCAMBIA2300-35，測序后將陽性質(zhì)粒命名為pCAMBIA2300-35S-VpSBP3。將其和pCAMBIA2300-35S空載體通過農(nóng)桿菌介導的花絮浸潤法轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得T0代種子。在含40 mg·L-1卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基上對T0代種子進行篩選，正常生長的苗子確定為轉(zhuǎn)化陽性苗。

將對照和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子置于4 ℃冰箱中春化3～4 d后，在超凈工作臺上進行消毒處理，然后用移液槍點播在MS+150 mmol·L-1氯化鈉(NaCl)培養(yǎng)基中，置于光照培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)16 h、黑暗培養(yǎng)8 h。最終選取在培養(yǎng)基中與對照表型有差異的轉(zhuǎn)基因株系作為試驗材料。

1.2.4 鹽脅迫處理下轉(zhuǎn)基因株系萌發(fā)率及根長測定

將T3代轉(zhuǎn)基因株系、空載體pCAMBIA2300對照和野生對照的種子置于4 ℃冰箱中春化3～4 d后，在超凈工作臺上進行消毒處理，然后分別用移液槍點播在MS和MS+150 mmol·L-1NaCl的培養(yǎng)基上，置于光照培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)16 h、黑暗培養(yǎng)8 h。每2 d觀察并統(tǒng)計一次對照與轉(zhuǎn)基因株系的萌發(fā)率，直到萌發(fā)率趨于穩(wěn)定。同時把MS和MS+150 mmol·L-1NaCl培養(yǎng)基豎放在培養(yǎng)皿架上，生長15 d后，觀察并記錄根長。該試驗分別進行3次生物學和3次技術重復。

1.2.5 失水率及電解質(zhì)滲漏測定

用150 mmol·L-1NaCl分別對正常生長的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥株系進行脅迫處理。7 d后分別取0.1 g表型一致的對照和轉(zhuǎn)基因株系葉片進行電導率的測定。 首先將所取樣品分別置入含有50 mL蒸餾水的試管中，靜置3～5 h后，用電導儀測其電導值R1，測定結(jié)束后將該樣品繼續(xù)放入90 ℃水浴鍋中30 min，冷卻到室溫，測其電導值R2，利用公式R1/R2分別計算其相對電導值[39]。該試驗分別進行3次生物學重復和3次技術重復。

1.2.6 丙二醛含量的測定

用200 mmol·L-1NaCl處理轉(zhuǎn)基因和對照株系的盆栽苗，一周后取0.2 g葉片，參照 Dhindsa等[40]的實驗方法，利用分光光度計測定丙二醛的含量。該試驗分別進行3次生物學重復和3次技術重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 VpSBP3基因的克隆及序列分析

以‘白河35-1’葉片DNA和總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為模板，用VpSBP3的特異引物擴增，分別獲得約1 200 bp 和3 200 bp大小的條帶(圖1)。將VpSBP3基因連接到pGEM-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并進行測序，在http://www.ncbi.nlm.nih. gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi上進行cDNA序列分析。分析表明，VpSBP3基因含有一個大小為1 170 bp的開放閱讀框，編碼一個含有390個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。通過InterProScan蛋白數(shù)據(jù)庫來鑒定該基因的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明VpSBP3基因含有一段高度保守的雙向核定位序列和一個完整的SBP-domain結(jié)構(gòu)域(PF03110)(圖2)。DNA序列分析發(fā)現(xiàn)VpSBP3基因的DNA序列長度為3 200 bp，其中3個外顯子長度分別為408、138、624 bp；2個內(nèi)含子長度分別為1 884、146 bp，其排列的相對位置見圖2。

2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的獲得

通過花絮浸潤法，將含有pCAMBIA2300-35S-VpSBP3質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，獲得T0代種子。將消毒后的T0代種子鋪在含40 mg·L-1卡那霉素的MS培養(yǎng)基上進行轉(zhuǎn)基因陽性苗的篩選。結(jié)果表明非轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在選擇培養(yǎng)基上逐漸白化死亡，而轉(zhuǎn)基因植株可以正常生長(圖3A)。將野生對照WT和不同轉(zhuǎn)基因株系擬南芥T3代種子用移液槍點播在提前配制并滅菌MS+150 mmol·L-1NaCl培養(yǎng)基上，春化后在光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)正常培養(yǎng)5 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有的轉(zhuǎn)基因株系均對鹽脅迫敏感。最終選取在培養(yǎng)基中與對照表型差異最明顯的轉(zhuǎn)基因株系VpSBP3-26和VpSBP3-42作為后續(xù)研究材料 (圖3B)。

2.3 VpSBP3轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽脅迫培養(yǎng)基上的萌發(fā)情況

將野生對照、空載pCAMBIA2300對照和轉(zhuǎn)基因株系同時播種在MS、MS+150 mmol·L-1NaCl培養(yǎng)基上，每隔2 d統(tǒng)計一次發(fā)芽率并拍照觀察，用prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析作圖。發(fā)現(xiàn)在MS培養(yǎng)基上野生對照、空載pCAMBIA2300對照和轉(zhuǎn)基因株系在2 d時開始萌發(fā)，8 d后的萌發(fā)率均達到100%(圖4A)。而在MS+150 mmol·L-1NaCl培養(yǎng)基上，只有野生對照和空載pCAMBIA2300對照8 d時萌芽率達到100%，而轉(zhuǎn)基因株系12 d時萌發(fā)率才達到最高值80%， 可以明顯看到MS+150mmol·L-1NaCl培養(yǎng)基上，野生對照和空載pCAMBIA2300對照的萌發(fā)率高于轉(zhuǎn)基因株系(圖4B)。從圖5可以看出，MS培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)基因株系和兩個對照的生長情況基本一致，長勢良好(圖5A)，而脅迫培養(yǎng)基上的兩個對照要比轉(zhuǎn)基因株系生長的好(圖5B)。以上結(jié)果說明轉(zhuǎn)基因株系對鹽脅迫環(huán)境更加敏感，VpSBP3轉(zhuǎn)錄因子在響應過程中具有負向調(diào)控作用。

2.4 VpSBP3轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽脅迫培養(yǎng)基上的根長情況

將2個轉(zhuǎn)基因株系和2個對照分別種植于培養(yǎng)皿中，并豎放在培養(yǎng)皿架上。本研究用prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析作圖。觀察發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)基因株系和對照株系的根長基本一致(圖6A,6C)，150 mmol·L-1NaCl脅迫處理20 d后轉(zhuǎn)基因株系和對照株系的根部生長均受到了抑制，但是轉(zhuǎn)基因株系的根長顯著低于對照株系(圖6B,6C)。結(jié)果表明，VpSBP3基因降低了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。

2.5 模擬鹽脅迫處理下VpSBP3轉(zhuǎn)基因擬南芥的失水率及相對電解質(zhì)滲透率

取150 mmol·L-1NaCl處理和正常培養(yǎng)20 d后的轉(zhuǎn)基因及野生型擬南芥株系進行電解質(zhì)滲漏處理，分別計算相對電導率。本研究用prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析作圖。從圖7看出，WT、pCAMBIA2300、VpSBP3-

26、VpSBP3-

42在MS培養(yǎng)基上的相對電解質(zhì)滲透率分別為27.81%、37.60%、36.05%、39.50%，在MS+150 mmol·L-1NaCl培養(yǎng)基上的相對電解質(zhì)滲透率分別為34.05%、41.23%、66.41%、86.61%。以上結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因株系相對電解質(zhì)滲透率比野生對照的低，轉(zhuǎn)基因株系對鹽脅迫更敏感，該基因具有負向調(diào)控作用。

2.6 鹽脅迫處理下VpSBP3轉(zhuǎn)基因擬南芥丙二醛含量的測定

用200 mmol·L-1NaCl處理生長健壯的野生型和轉(zhuǎn)基因株系的擬南芥，每個營養(yǎng)缽澆50 mL，每隔2 d處理一次，處理7 d后，摘取葉片測其MDA含量。本研究用prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析作圖。從圖8中可以看出，在正常條件下培養(yǎng)的野生型和轉(zhuǎn)基因株系的MDA含量基本一致，但在150 mmol·L-1NaCl脅迫處理下，2個轉(zhuǎn)基因株系的MDA含量均顯著高于2個對照株系，表明轉(zhuǎn)VpSBP3基因的擬南芥抗逆性顯著低于野生型。

3 討論

隨著全球環(huán)境條件的不斷惡化，導致土地干旱和土地鹽堿化越來越嚴重，使得環(huán)境脅迫成為影響植物生長發(fā)育的重要因素之一。為了防止這種脅迫的潛在有害影響，植物進化出復雜的網(wǎng)絡機制來識別外部信號，并通過不同的細胞信號轉(zhuǎn)導途徑進行傳導，導致植物體內(nèi)產(chǎn)生一系列的脅迫響應轉(zhuǎn)錄級聯(lián)反應，影響了相關基因表達。而基因的表達受植物體內(nèi)各種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子在植物生命活動中起著關鍵的調(diào)節(jié)作用，與DNA結(jié)合域共價結(jié)合，從而達到抑制或增強基因表達的作用，常見的參與植物抗逆調(diào)控過程有WRKY[41]、MYB[42]、bZip[43]等轉(zhuǎn)錄因子。

SBP-box基因是一類新的編碼DNA結(jié)合蛋白的轉(zhuǎn)錄因子，他們只存在于綠色植物中。研究表明，這些基因均含有一個SBP保守結(jié)構(gòu)域，其中含有一個C端的雙向核定位信號和兩個結(jié)合DNA的鋅指結(jié)構(gòu)。本研究中，對VpSBP3序列分析，發(fā)現(xiàn)該基因符合SBP基因的所有結(jié)構(gòu)特征，屬于SBP家族成員(圖2)。相關研究表明SBP轉(zhuǎn)錄因子作為miRNA156的靶基因，參與了植物對非生物脅迫響應過程[44]，但不同的SBP基因在非生物脅迫響應中表現(xiàn)出了不同甚至相反的功能。在擬南芥中，過表達AtSPL1和AtSPL12能夠提高其耐熱性[45]；干旱、低溫和鹽脅迫等非生物脅迫可以誘導蘋果MdSBP20基因的表達[46]；短期鹽脅迫處理下，MdSPL13的過量表達可以提高蘋果的耐鹽性[47]。與以上研究結(jié)果相悖，也有研究表明SBP基因在植物非生物脅迫響應中具有負向調(diào)控功能。在擬南芥中miR156可通過下調(diào)靶基因AtSPL9提高轉(zhuǎn)基因株系抗鹽和抗旱能力[48]；辣椒中CaSBP12基因也可負向調(diào)控植株對鹽脅迫的耐受性[27]；本研究將VpSBP3基因在擬南芥中過量表達后發(fā)現(xiàn)相較于兩個對照，鹽脅迫處理下轉(zhuǎn)基因株系的種子萌發(fā)率更低、根長更短、相對電導率更高和MDA的含量更高。根據(jù)以上試驗結(jié)果可以推測VpSBP3基因的過量表達可能增強了植株對鹽脅迫的敏感性。該研究為進一步解析miR156/SBP在植物逆境脅迫中的作用機理提供了一定的理論基礎，對植物的抗逆性研究和應用有一定的指導意義。