胡柏楊，蔣林樹，李艷霞*，陳興財，安思羽

（1.北京師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，水環(huán)境模擬國家重點實驗室，北京 100875；2.北京農(nóng)學(xué)院，北京 102206）

畜禽糞便是農(nóng)作物生產(chǎn)中重要的營養(yǎng)物質(zhì)來源，土地利用則是糞便資源化的主要方式。然而，畜禽糞便只能在耕作期施用于土地，所以在冬季免耕期，大量的畜禽糞便會堆放儲存在戶外[1]。而在許多寒冷地區(qū)，由于冬季晝夜溫差大，畜禽糞便在堆放過程中就會經(jīng)歷凍融循環(huán)過程。凍融循環(huán)是一種十分常見的氣候現(xiàn)象，僅在我國，56%的國土面積都會發(fā)生凍融循環(huán)[2]。此外，我國每年產(chǎn)生約38億t的糞便，大量糞便在冬季會經(jīng)歷凍融循環(huán)過程[3]，因此探究凍融循環(huán)對畜禽糞便環(huán)境行為的影響具有重要意義。然而，目前關(guān)于凍融的研究多數(shù)以土壤作為對象，對畜禽糞便的關(guān)注則相對較少[4-6]。

研究表明，凍融循環(huán)可以使土壤顆粒破碎，并影響土壤的物理化學(xué)性質(zhì)、微生物種群及其有機質(zhì)的種類[7]。因此可以推斷，凍融循環(huán)也可能會對畜禽糞便的粒徑分布及其有機質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響其在環(huán)境中的遷移和污染情況。畜禽糞便中含有大量的有機物質(zhì)，其中溶解性有機質(zhì)、腐植酸、木質(zhì)素和蛋白質(zhì)是畜禽糞便中有機質(zhì)的重要組分，也是畜禽糞便環(huán)境行為的重要影響因素。溶解性有機質(zhì)不僅包含大量的生物反應(yīng)中間體，還充當(dāng)某些微生物養(yǎng)分的直接來源，對微生物的群落結(jié)構(gòu)和活性以及畜禽糞便中污染物的遷移具有重要影響[8]。腐植酸在施肥后的土壤生態(tài)、土壤結(jié)構(gòu)、肥料效率和植物生長中也起著重要作用[9]。此外，蛋白質(zhì)類物質(zhì)（例如氧化還原酶和水解酶）也與基本營養(yǎng)素的代謝密切相關(guān)[10]，對其含量和結(jié)構(gòu)變化的分析有助于反映有機質(zhì)的分解過程。木質(zhì)素則會吸附有機污染物，并影響糞便中污染物在環(huán)境中的遷移和轉(zhuǎn)化等行為[11]。

因此，本研究通過凍融模擬實驗，研究凍融循環(huán)對糞便的粒徑分布和有機質(zhì)含量的影響。同時，在凍融前后提取糞便中的有機質(zhì)組分（包括溶解性有機質(zhì)、腐植酸、木質(zhì)素和蛋白質(zhì)），并通過傅里葉紅外光譜和13C 核磁共振光譜研究其結(jié)構(gòu)變化，來進(jìn)一步深入分析凍融對糞便有機質(zhì)組成的影響，以便更好地了解環(huán)境溫度下豬糞的凍融過程，為評估凍融循環(huán)過程對畜禽糞便的潛在環(huán)境影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實驗用新鮮豬糞采集于某集約化養(yǎng)豬場。使用木鏟將收集的糞便樣品裝入塑料桶中運輸至實驗室進(jìn)行基本理化性質(zhì)的測定以及后續(xù)相關(guān)實驗。原始糞便的主要理化性質(zhì)如表1所示。

1.2 凍融實驗

將豬糞樣品封裝于塑料盒內(nèi)進(jìn)行凍融處理。將樣品在（-18±2）℃的冷凍室中凍結(jié)24 h，然后在（20±2）℃的恒溫培養(yǎng)箱中融解24 h，整個過程即為一個凍融循環(huán)周期（48 h），整個凍融實驗共經(jīng)歷30個凍融循環(huán)。在第5、10、20、30次凍融處理后取出子樣本，與0次凍融循環(huán)（即未經(jīng)凍融處理）樣品一同進(jìn)行冷干處理，之后提取其中的溶解性有機物、腐植酸、蛋白質(zhì)和木質(zhì)素進(jìn)行測定和分析。

1.3 粒徑分布

通過濕篩法確定豬糞中的粒徑分布。向100 g豬糞樣品中加入600 mL 超純水，攪拌均勻后在40 W 下超聲5 min，按圖1 所示過程進(jìn)行篩分，得到＞1 000、250～1 000、75～250 μm 和 38～75 μm 的顆粒，在通過38μm尼龍篩后的液體幾乎澄清時，將混合物在10 000 r·min-1下離心30 min，得到＜38 μm的顆粒[12]。

1.4 測定方法

1.4.1 總有機質(zhì)

使用馬弗爐灼燒法測定總有機質(zhì)的含量[13]。將糞便樣品在105 ℃的烘箱中干燥過夜后置于馬弗爐中，在550 ℃下加熱5 h，稱質(zhì)量后計算總有機質(zhì)的含量。

1.4.2 溶解性有機質(zhì)

用去離子水在固液比為1∶5（m/V）的條件下提取糞便樣品，在20 ℃下振蕩16 h，然后于4 ℃下以8 000 r·min-1離心25 min 后，將懸浮液通過0.45 μm 濾膜過濾。使用總有機碳分析儀（TOC-500，日本島津）測定濾液中溶解性有機碳（DOC）的濃度，即為溶解性有機質(zhì)的含量[14]。

1.4.3 腐植酸

用 0.1 mol·L-1NaOH 和 0.1 mol·L-1Na2P2O7在固液比為1∶10（m/V）的條件下對豬糞樣品進(jìn)行萃取，在4 000 r·min-1下離心20 min后分離出含有腐植酸的上清液。重復(fù)提取3 次后將上清液混合并在室溫下靜置24 h，再次在4 000 r·min-1下離心20 min，將獲得的上清液進(jìn)行冷凍干燥以獲得腐植酸樣品[15]。

表1 豬糞的基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physical and chemical properties of pig manure

1.4.4 蛋白質(zhì)

使用硫酸銨沉淀法提取蛋白質(zhì)樣品[16]。向一定量的糞便樣品中加入10 mL 磷酸鹽緩沖液（pH=7），然后將溶液離心以完全去除懸浮顆粒。隨后，向上清液中加入60%的硫酸銨溶液，同時通過1 mol·L-1的KH2PO4調(diào)節(jié)pH 使其穩(wěn)定在7.0。在4 ℃下放置4 h后，將懸浮液在8 000 r·min-1下離心35 min，得到的沉淀物即為蛋白質(zhì)樣品。

1.4.5 木質(zhì)素

將糞便樣品進(jìn)行風(fēng)干研磨后，取0.025 g 干樣至聚四氟乙烯消解罐，加入0.5 g CuO、0.05 g 六水合硫酸鐵銨和15 mL 2 mol·L-1NaOH 溶液在155 ℃下萃取3 h。冷卻至常溫后在2 000 r·min-1下離心 10 min 后，將上清液用6 mol·L-1HCl酸化至pH=1，并用10 mL乙酸乙酯重復(fù)萃取3次，風(fēng)干后即得到木質(zhì)素樣品[17]。

1.5 樣品分析

根據(jù)方宇瀟等[18]的方法測定豬糞pH 以及含水率。同時，使用傅里葉紅外光譜和固態(tài)交叉極化13C核磁共振光譜獲得上述提取的有機質(zhì)組分的官能團以及化學(xué)成分的相關(guān)信息來進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS Statistics 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，并采用單因素方差分析來評估統(tǒng)計差異，顯著性水平選擇為0.05。使用Origin 2018 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 凍融對豬糞粒徑分布的影響

統(tǒng)計學(xué)分析表明，凍融循環(huán)對豬糞的粒徑分布存在顯著影響（P＜0.05）。如圖2 所示，凍融循環(huán)處理過后，糞便的平均質(zhì)量直徑明顯減小，且隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，糞便的平均質(zhì)量直徑呈現(xiàn)出降低趨勢。從粒徑的分布來看，原始糞便主要由＞1 000 μm 和＜38μm 的顆粒組成，其共占總粒徑的67.6%，而38～250μm的顆粒含量范圍僅為8.33%～14.65%。隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，＞1 000μm 的顆粒含量逐漸降低，而小顆粒的比例逐漸上升。其中，經(jīng)過30次凍融循環(huán)處理的樣品與原始樣品相比，＞1 000μm 的顆粒含量降低了6.73%，而38～75 μm 和＜38 μm 的顆粒含量則分別增加了5.94%和6.13%。這說明凍融循環(huán)過程使得糞便中的大顆粒發(fā)生破碎，主要由＞1 000μm 的顆粒破碎成＜75 μm 的顆粒。并且，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，破碎的效果也更加明顯。這與對土壤粒徑大小在凍融環(huán)境下變化的研究結(jié)果類似[4-5]。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的主要原因是凍融循環(huán)過程中豬糞顆粒間的水分發(fā)生凍結(jié)，形成的冰晶對顆粒不斷發(fā)生剪切作用而使大顆粒破碎成小顆粒[19]。除此之外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，含水率越高，凍融作用對顆粒的破壞性越大[20]。本實驗使用的豬糞的含水率高達(dá)71%，遠(yuǎn)高于表層土壤含水率（11.71%～16.46%），因此，高含水率的豬糞結(jié)冰后會形成更強的擴張力進(jìn)而破壞顆粒間的結(jié)合，同時顆粒間隙的增加也擴大了凍結(jié)的面積，這均會導(dǎo)致大顆粒破碎比例的增加。因此，凍融環(huán)境中＞1 000μm 的顆粒的破碎主要是物理作用引起的。

2.2 凍融對有機質(zhì)的影響

2.2.1 有機質(zhì)的表征

如圖3所示，所有樣品的紅外光譜都包含相似的峰位置，主要的特征吸收帶是：（1）酚、羧酸和醇在3 400 cm-1附近的 O—H 拉伸振動；（2）脂族結(jié)構(gòu)在 2 930 cm-1和2 855 cm-1附近的C—H 拉伸振動；（3）硫醇在2 356 cm-1附近的 S—H 伸縮振動；（4）1 659 cm-1附近芳香環(huán)的骨架振動；（5）酰胺在 1 570 cm-1附近的N—H 變形和拉伸；（6）1 385 cm-1附近酚結(jié)構(gòu)的O—H變形和/或COO—基團的不對稱拉伸；（7）仲醇、酚類和芳基醚在1 103 cm-1附近的C—O 拉伸[21]。13C 核磁共振光譜的化學(xué)位移所代表的化學(xué)成分如下：乙酰（5～30 ppm），氨基酸和脂質(zhì)（30～50 ppm），甲氧基（50～60 ppm），碳水化合物（60～110 ppm），芳香木質(zhì)素（110～160 ppm），羰基/羧基（160～210 ppm）[22]。13C 光譜強度的相對分布由化學(xué)位移面積的積分確定，其積分結(jié)果如表2所示。

2.2.2 總有機質(zhì)和溶解性有機質(zhì)的變化

表2 30次凍融循環(huán)處理前后豬糞的溶解性有機質(zhì)、腐植酸、木質(zhì)素和蛋白質(zhì)的13C核磁圖譜積分結(jié)果Table 2 Distribution of 13C in dissolved organic matter，humic acid，lignin and protein extracted from pig manure without freeze-thaw cycle and after 30 freeze-thaw cycle treatment

在經(jīng)歷凍融循環(huán)之后，豬糞中的總有機質(zhì)下降，凍融循環(huán)次數(shù)對總有機質(zhì)存在顯著影響（P＜0.05），其含量隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加而逐漸降低（圖4）。與未進(jìn)行凍融處理的樣本相比，經(jīng)歷30 次凍融循環(huán)的豬糞的總有機質(zhì)含量下降了5.34%，此現(xiàn)象可能受許多因素影響。冷凍過程的溫度低至-20 ℃，一些熱塑性微生物可能由于對溫度的耐受性低而死亡，并作為碳源釋放。但是，細(xì)胞裂解后釋放的營養(yǎng)物可以被存活的生物體利用，改變了有機質(zhì)的狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌的存活基本不受凍融環(huán)境的影響[17]，尤其是反硝化細(xì)菌，它可以利用有機物進(jìn)行厭氧呼吸，發(fā)生反硝化反應(yīng)。因此，凍融循環(huán)之后的總有機質(zhì)下降可能是因為存活細(xì)菌分解的有機質(zhì)大于碳源釋放產(chǎn)生的有機質(zhì)。凍融循環(huán)還可能促進(jìn)了不穩(wěn)定有機碳和氮的礦化，并產(chǎn)生了二氧化碳和一氧化二氮氣體，導(dǎo)致有機質(zhì)的流失[23]。

根據(jù)統(tǒng)計分析，凍融循環(huán)處理對豬糞中溶解性有機質(zhì)含量也有顯著影響（P＜0.05）。與總有機質(zhì)的變化相反，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，溶解性有機質(zhì)的含量逐漸增加（圖4）。與原始樣品相比，經(jīng)過30次凍融循環(huán)處理的豬糞中的溶解性有機質(zhì)含量增加了48.7%。這一現(xiàn)象可以歸因于3個原因：首先，大顆粒的破碎會產(chǎn)生許多結(jié)冰縫隙，使未結(jié)冰部分的水不斷向凍結(jié)冰面遷移。該過程可以攜帶一部分溶解性有機質(zhì)，待融化時溶出[24]。其次，一些由于低溫死亡的微生物細(xì)胞釋放出大量可用的碳源（如糖和氨基酸），增加了溶解性有機質(zhì)的溶出。最后，厭氧環(huán)境中的無氧呼吸是厭氧微生物的主要呼吸方式，其會產(chǎn)生大量的厭氧消化產(chǎn)物（例如丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸等[1]），其中大多數(shù)處于膠體狀態(tài)或溶解狀態(tài)，因此，在固液分離的情況下，它們將進(jìn)入液相[25]。

紅外光譜的結(jié)果證實了這一假設(shè)。如圖3a 所示，30 次凍融循環(huán)處理后，3 400 cm-1處的條帶變寬，表明產(chǎn)生了更多的氨基酸；此外，在2 352 cm-1和1 638 cm-1處的峰幾乎消失，這表明在凍融過程中硫醇的消耗和碳不飽和度的增加。與未經(jīng)凍融處理的樣品相比，30 次凍融循環(huán)處理后的樣品在1 385 cm-1處的峰具有較高的相對強度，表明溶解性有機質(zhì)中OH 和/或COO—基團的增加[26]。豬糞凍融后pH 逐漸降低也證明了這一點（圖2）。此外，對應(yīng)多糖C—O或硅酸鹽Si—O 的峰在凍融之后強度降低，表明多糖和硅酸鹽的消耗[27]。

從豬糞中提取的溶解性有機質(zhì)的核磁共振光譜如圖5a所示?？梢钥闯?，凍融處理后，0～30 ppm 區(qū)域的乙?；吭谠黾?，信號峰增強，尤其是在12、18 ppm 和22 ppm 處。從表2可以看出，凍融后氨基酸和脂質(zhì)含量增加，38 ppm 和49 ppm 的峰值明顯升高，這可能是由于多糖分解使產(chǎn)物被轉(zhuǎn)化成更簡單的烷基鏈[28]。此外，經(jīng)過凍融處理后，羧基和羰基的含量增加。一般來說，有機物的分解伴隨著羧基的生成[29]，氧化的木質(zhì)素會產(chǎn)生更多的羧基、苯酚和羰基[30]，這也與上述紅外光譜結(jié)果中溶解性有機質(zhì)不飽和度增加的現(xiàn)象一致。

2.2.3 凍融對腐植酸的影響

從腐植酸的紅外光譜來看（圖3b），在凍融處理后，2 923 cm-1處的峰強度升高，對應(yīng)脂肪族結(jié)構(gòu)的含量增加，表明有機營養(yǎng)碳源的消耗量低于凍融過程中的生成量。30 次凍融處理后，1 643 cm-1和1 565 cm-1處的峰沒有明顯變化，表明腐植酸的芳香結(jié)構(gòu)在凍融過程中沒有變化。此外，與未經(jīng)凍融處理的樣品相比，經(jīng)過30 次凍融處理的樣品在1 500 cm-1處的峰具有較高的相對強度，這歸因于NH 變形和酰胺的拉伸[26]，表明氮的含量有所增加，與上述凍融過程中氨基酸增加結(jié)果一致。腐植酸的核磁共振光譜也顯示出相似的結(jié)果（圖5b）。178 ppm 處代表羧基的特征峰在凍融處理后的峰值強度增加了80%，說明凍融處理使腐植酸產(chǎn)生了更多的COO—。凍融過程中腐植酸的芳香區(qū)（110～160 ppm）基本不變，說明經(jīng)過凍融處理后腐植酸的芳香性基本沒有改變。此外，烷基碳區(qū)域（0～50 ppm）的特征峰略有增加，這可能是多糖分解所導(dǎo)致的[29]。

2.2.4 凍融對木質(zhì)素的影響

凍融處理后，豬糞中的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)也受到影響（圖3c）。凍融處理后樣品的光譜中2 917 cm-1和2 855 cm-1處的峰與未凍融樣品相比具有較高的相對強度，表明脂肪族結(jié)構(gòu)富集。與未凍融樣品相比，凍融處理后的樣品在2 358 cm-1處的峰輕度降低，表明硫醇作為微生物的營養(yǎng)物被消耗。此外，在凍融處理后的樣品中1 561 cm-1處的峰強度增加，表明在凍融過程中芳香結(jié)構(gòu)的富集。表2 顯示了在凍融過程中木質(zhì)素的甲氧基和碳水化合物被消耗，生成了氨基酸、脂類和芳香碳。180 ppm 處代表羧基的明顯特征峰在經(jīng)過凍融處理后沒有發(fā)生明顯變化（圖5c），這表明木質(zhì)素的羧基含量在凍融過程中基本不變。

2.2.5 凍融對蛋白質(zhì)的影響

凍融處理也會對豬糞中蛋白質(zhì)的性質(zhì)產(chǎn)生影響（圖3d）。3 226 cm-1處的峰代表蛋白質(zhì)的獨有結(jié)構(gòu)——酰胺鍵，經(jīng)過凍融處理后其譜帶變寬，說明在凍融過程中產(chǎn)生了小分子氨基酸，這與溶解性有機質(zhì)和腐植酸中的變化一致。此外，經(jīng)過凍融處理后，1 650 cm-1處的峰值強度增加，表明在凍融過程中芳香結(jié)構(gòu)的富集。以上結(jié)果表明，凍融循環(huán)可以將豬糞中的蛋白質(zhì)分解為小氨基酸，增加蛋白質(zhì)的芳香結(jié)構(gòu)并增加其不飽和度。從核磁光譜看（圖5d），173 ppm 時出現(xiàn)的特征峰主要為羧基碳，經(jīng)過凍融處理后，該峰強度增加了約50%，說明凍融后蛋白質(zhì)產(chǎn)生了更多的COO—。110～160 ppm 區(qū)域的含量明顯增加，說明凍融處理后蛋白質(zhì)的芳香性增加，這可能是由于低耐受性微生物在冷凍過程中死亡以及一些不飽和化合物的釋放所致[31]。

2.2.6 與堆肥過程的比較

在經(jīng)歷凍融循環(huán)過程后，豬糞的總有機質(zhì)含量下降，溶解性有機質(zhì)含量上升。從紅外光譜和核磁共振光譜的結(jié)果判斷，凍融使豬糞中有機質(zhì)（溶解性有機質(zhì)、腐植酸、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)）的不飽和度增加，產(chǎn)生了更多的氨基酸、—COO—和基團。另外，溶解性有機質(zhì)的芳香性降低，腐植酸和木質(zhì)素的芳香性基本不變，而蛋白質(zhì)的芳香性增加。

畜禽糞便主要通過堆肥的方式回收利用[32]。堆肥是在有機肥生產(chǎn)過程中，通過微生物的高溫發(fā)酵作用，使畜禽糞便礦化、腐殖質(zhì)化而達(dá)到無害化的過程[33]。研究表明，在堆肥過程中，有機質(zhì)的芳香性會增加，碳水化合物會分解，—COO—基團會降解，這與凍融循環(huán)過程中有機質(zhì)的變化形成了鮮明的對比。因此，堆肥是糞便中有機物逐漸穩(wěn)定并達(dá)到無害化的過程，而與之相反，凍融過程的變化（例如溶解性有機質(zhì)的增加以及大分子有機物分解的現(xiàn)象），將會增加糞便在自然環(huán)境中的溶解度和流動性，進(jìn)而導(dǎo)致糞便中的污染物如抗生素和重金屬等的遷移性增加，帶來更大的環(huán)境風(fēng)險和危害[14]。

3 結(jié)論

（1）經(jīng)過凍融處理后，糞便中＞1 000 μm 的粒徑組成減少，而 38～75 μm 和＜38 μm 的顆粒增加，說明凍融使糞便中的大顆粒破碎成小顆粒，且凍融次數(shù)越多，破碎效果越明顯。

（2）凍融循環(huán)會影響豬糞中有機質(zhì)的含量。經(jīng)過30 次凍融循環(huán)后，豬糞中的總有機質(zhì)降低了5.34%，溶解性有機質(zhì)增加了48.7%。

（3）凍融循環(huán)后，豬糞中溶解性有機質(zhì)、腐植酸、蛋白質(zhì)和木質(zhì)素中的不飽和有機物成分均增加，并產(chǎn)生了更多的氨基酸、—COO—和基團。溶解性有機質(zhì)的芳香性降低而蛋白質(zhì)的芳香性增加。這可能會導(dǎo)致環(huán)境中豬糞有機質(zhì)的遷移率增加，進(jìn)而影響糞便中污染物的環(huán)境行為，并對人和動物健康構(gòu)成威脅。因此，需要進(jìn)一步研究糞便施用，儲存和土地利用過程中的污染物遷移情況，同時，常年經(jīng)歷凍融的區(qū)域應(yīng)針對性地采用適當(dāng)?shù)姆椒▋Υ嫘笄菁S便，減少凍融所造成的糞便中污染物遷移而導(dǎo)致的面源污染風(fēng)險和環(huán)境危害。