宋澤，何學(xué)佳，楊翠，張建沖，余顯權(quán)，周麗潔

（貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽 550025）

隨著生活水平的提高，人們對稻米品質(zhì)的需求也更加多樣化，糯稻因支鏈淀粉含量較高（95%～100%）而成為副食加工的重要原材料［1］。貴州作為全國糯稻種質(zhì)資源最豐富的省份之一，全省范圍內(nèi)均有糯稻栽培，特別是黔東南自治州的“糯禾”，因其獨(dú)特的口感和較強(qiáng)的抗性深受當(dāng)?shù)厣贁?shù)民族的喜愛［2-5］。近年來，隨著雜交水稻的大面積推廣，貴州糯稻種植面積不斷縮小，大量地方糯稻資源被淘汰［6］。目前對貴州地方糯稻資源的研究主要集中于農(nóng)藝性狀、抗病性及稻米品質(zhì)等方面，而利用分子標(biāo)記系統(tǒng)研究貴州地方糯稻品種的遺傳多樣性鮮有報(bào)道，貴州地方糯稻遺傳多樣性和品種間的親緣關(guān)系尚不清楚。

SSR標(biāo)記因其穩(wěn)定、多態(tài)性好、成本低等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于水稻種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究［7］。李修平等［8］通過50對SSR引物對192份寒地水稻種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明供試材料遺傳多樣性不夠豐富。吳錦泉等［9］采用60對SSR分子標(biāo)記，分析了江蘇省256份水稻品系遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)所有水稻品系間親緣關(guān)系較近，遺傳多樣性程度低。劉丹等［10］對黑龍江省的104份粳稻資源進(jìn)行SSR分析，明確了各育成品種的親緣關(guān)系。Verma等［11］利用65對SSR標(biāo)記分析印度114份水稻種質(zhì)資源的遺傳多樣性、相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)供試材料具有豐富的遺傳變異。

本研究通過利用56對SSR引物對來自貴州多個(gè)地區(qū)的173份地方糯稻品種資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在明確貴州地方糯稻品種資源間的親緣關(guān)系，為有效利用貴州地方糯稻種質(zhì)資源和挖掘優(yōu)異基因提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以173份貴州省內(nèi)不同地區(qū)的糯稻種質(zhì)資源為供試材料，由貴州省農(nóng)作物品種資源研究所提供。供試材料的名稱及來源見表1。

表1 173份供試材料及來源Table 1 173 tested materials and sources

續(xù)表1

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增和電泳

將173份供試材料室內(nèi)發(fā)芽，至3葉期取鮮嫩葉片，利用CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法提取供試材料基因組DNA。利用均勻分布在水稻12條染色體上的56對SSR引物進(jìn)行分子標(biāo)記檢測。SSR引物由上海Invitrogen公司合成。PCR擴(kuò)增采用10μL體系：模板DNA（30～50 ng／μL）2μL，10×PCR Buffer（含Mg2+）1.2μL，dNTP 0.2μL，5 U／μL Taq酶0.1μL，正、反向引物各1μL，ddH2O 4.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)電泳結(jié)果，統(tǒng)計(jì)SSR電泳的多態(tài)性條帶，在相同遷移位置上有條帶記為“1”，無條帶的記為“0”，缺失記為“9”，利用Excel統(tǒng)計(jì)整理數(shù)據(jù)。用Popgene 32進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon信息指數(shù)（I）和Nei′s基因多樣性指數(shù)（H）。

多態(tài)性信息指數(shù)PICi＝1-

式中：pij為i標(biāo)記第j個(gè)等位基因的頻率。

利用NTSYS-pc（Version 2.10 e）中similarity的qualitative data程序計(jì)算出種質(zhì)間的Nei′s遺傳相似系數(shù)進(jìn)行UPGMA聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR多態(tài)性和遺傳多樣性分析

由表2可以看出，56對SSR引物中，所有的引物在供試材料中都表現(xiàn)出多態(tài)性，共檢測出191個(gè)等位基因，每對SSR引物檢測出2～7個(gè)等位基因，平均為3.41個(gè)，94.6%的引物檢測出3個(gè)及以上等位基因，其中引物RM214的等位基因數(shù)最多，為7個(gè)，而引物RM113、RM212、RM132等位基因僅為2個(gè)。有效等位基因數(shù)變化范圍為1.03～3.00，平均為1.56個(gè)，有效等位基因占45.68%。Nei′s基因多樣性指數(shù)變化范圍為0.03～0.67，平均為0.30。Shannon信息指數(shù)變化范圍為0.10～1.32，平均為0.57。56個(gè)SSR位點(diǎn)的多態(tài)信息含量（PIC）變化范圍為0.03～0.66，平均為0.30，其中有10個(gè)高度多態(tài)位點(diǎn)（PIC≥0.50），即RM165、RM322、RM218、RM241、RM31、RM141、RM214、RM444、RM286和RM511；中度多態(tài)位點(diǎn)（0.25≤PIC＜0.50）和低度多態(tài)位點(diǎn)（PIC＜0.25）分別是18和28個(gè)。以上結(jié)果表明，173份貴州地方糯稻品種資源的遺傳多樣性水平較低，遺傳基礎(chǔ)不夠豐富。

表2 56對SSR引物在173份供試材料中的遺傳多樣性信息Table 2 Genetic diversity information of the 56 pairs of SSR primers in 173 test materials

2.2 SSR標(biāo)記遺傳相似性分析

根據(jù)56對SSR引物在173份供試材料所獲得的191個(gè)等位基因，按Nei的方法利用NTSYS-pc（Version 2.10 e）計(jì)算供試品種間的遺傳相似系數(shù)，以0.02為組距進(jìn)行次數(shù)分布分析，獲得遺傳相似系數(shù)的次數(shù)分布圖（圖1）。供試品種的遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.52～1.00，平均為0.76。供試品種的遺傳相似系數(shù)次數(shù)呈單峰分布，遺傳相似系數(shù)在0.70～0.90之間的占比87.80%；0.70以下和0.90以上的分別占總數(shù)的11.10%和1.10%。由此說明，供試貴州地方糯稻品種遺傳相似性較高，遺傳差異較大的品種數(shù)量相對較少。

圖1 貴州地方糯稻品種遺傳相似系數(shù)的次數(shù)分布圖Fig.1 Frequency distribution of genetic similarity coefficient of local glutinous rice varieties in Guizhou

2.3 貴州地方糯稻品種聚類分析

根據(jù)173份地方糯稻品種間的遺傳相似系數(shù)，使用UPGMA法進(jìn)行聚類分析。在遺傳相似系數(shù)為0.65處可將173個(gè)糯稻品種劃分為秈糯和粳糯兩個(gè)類群，第Ⅰ類群包含167個(gè)地方粳糯品種，占材料總數(shù)96.50%；第Ⅱ類群僅包含6個(gè)秈糯品種，占總材料數(shù)的3.50%，分別是紫云柚糯（130）、三都野豬糯（143）、甕安楊成糯（145）、麻殼糯（147）、六枝老來紅（163）、貴陽順海大麻谷（167），表明貴州地方糯稻品種多為粳糯材料。在遺傳相似系數(shù)為0.67處，第Ⅰ類群又可分為2個(gè)亞群，分別包含159和8個(gè)糯稻品種。第Ⅰ、第Ⅱ類群及亞類群都有來自不同地區(qū)的糯稻材料，表明親緣關(guān)系遠(yuǎn)近與地理位置不相關(guān)。

3 討論

前人對糯稻資源遺傳多樣性已有較多的研究。楊慧等［13］對云南63個(gè)糯稻品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，表明平均Nei′s基因多樣性指數(shù)為0.72，得出云南糯稻總體遺傳多樣性水平較高。姚國新等［14］對50份湖北地方糯稻資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)湖北地方糯稻遺傳資源豐富，平均多樣性指數(shù)和多態(tài)信息含量分別為0.71和0.69。Wang等［15］利用36對SSR標(biāo)記對黔東南禾類資源及臨近省份地方糯稻品種進(jìn)行遺傳多樣性、遺傳分化和親緣關(guān)系檢測，發(fā)現(xiàn)供試材料平均等位變異數(shù)高達(dá)24.61，PIC值為0.75，遺傳多樣性高。馬琳等［16］利用21對SSR引物對74份貴州“禾”水稻品種進(jìn)行遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)貴州地方稻種資源整體水平上“禾”品種的遺傳相似性較高，遺傳背景相對單一。

本研究利用水稻12條染色體的56對SSR引物對來自貴州省不同地區(qū)的173份糯稻品種進(jìn)行遺傳相似性和遺傳多樣性研究，顯示貴州地方糯稻品種遺傳多樣性較低，可能與所選用的SSR分子標(biāo)記及長期以來地區(qū)間品種交流較頻繁有關(guān)，如農(nóng)戶換種現(xiàn)象普遍所引起的“同種異名”與“異種同名”所導(dǎo)致。

聚類分析結(jié)果表明，大多數(shù)品種親緣關(guān)系較近，不同類群均有來源于不同地區(qū)的糯稻材料，表明供試材料間親緣關(guān)系與地理位置沒有相關(guān)性。這與李金梅［17］對云南不同來源地的地方稻種進(jìn)行分析得出地理來源與聚類結(jié)果密切相關(guān)的結(jié)論有所不同。張曉麗等［18］對東南亞及中國部分地方的316個(gè)稻種材料分析結(jié)果與李金梅的結(jié)論相同，認(rèn)為親緣關(guān)系與地理來源具有相關(guān)性。而陳越等［19］對來自云南不同地區(qū)的908份水稻種質(zhì)材料遺傳多樣性分析認(rèn)為，聚類結(jié)果與地理來源沒有相關(guān)性，不同來源的種質(zhì)材料交叉分布于4個(gè)類群中。雷啟義等［20］通過分析黔東南香禾糯農(nóng)家品種的遺傳多樣性，也得出遺傳距離與地理來源不完全對應(yīng)，兩者間沒有相關(guān)性的結(jié)論。導(dǎo)致不同研究結(jié)論差異的原因可能與材料來源不同有關(guān)。供試材料中粳糯占絕大多數(shù)，這與貴州特殊的地理生態(tài)環(huán)境和少數(shù)民族喜食糯性食物習(xí)慣有關(guān)，粳糯也是生產(chǎn)上應(yīng)用的主要傳統(tǒng)水稻品種類型之一［21］。

貴州獨(dú)特的生態(tài)條件造就了豐富的糯稻資源。自20世紀(jì)80年代以來雜交水稻的大力推廣和當(dāng)?shù)嘏吹酒贩N抗病性差、易倒伏和產(chǎn)量低等原因?qū)е麓罅颗吹酒贩N被淘汰，部分優(yōu)良的變異類型在選擇過程中丟失［22，23］，使貴州糯稻資源遺傳多樣性逐漸降低，面臨因親緣關(guān)系相近而易遭受病蟲害威脅的危險(xiǎn)。因此，育種工作者應(yīng)挖掘優(yōu)異基因，收集、保存具有豐富遺傳基礎(chǔ)的種質(zhì)資源，同時(shí)引進(jìn)國內(nèi)外優(yōu)異的稻種資源，拓寬貴州糯稻資源的遺傳基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究利用水稻12條染色體的56對SSR引物對來自貴州省內(nèi)不同地區(qū)的173份地方糯稻品種進(jìn)行遺傳相似性和多樣性分析，結(jié)果表明貴州糯稻品種多為粳糯，遺傳多樣性較低，不同地區(qū)地方糯稻資源遺傳背景相似程度較高。