姚佳穎 毛彥軍 王杉杉 盧 涵 王 博 應(yīng)琳琳 李 垚

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030)

飼料蛋白質(zhì)利用率低已成為世界各國養(yǎng)豬業(yè)普遍存在的問題，不僅浪費(fèi)蛋白質(zhì)資源，還會因為過多氮排泄造成環(huán)境污染，添加飼料添加劑是提高飼料蛋白質(zhì)利用的有效措施之一。本課題組前期研究證明，沙棘黃酮可提高肉雞和蛋雞蛋白質(zhì)利用率[1]，同時發(fā)現(xiàn)提高肉雞蛋白質(zhì)利用率與槲皮素激活雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，TOR)信號通路有關(guān)[2]。而槲皮素是沙棘黃酮的主要成分，具有抗菌、消炎、抗病毒、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種活性[3-5]。此外，槲皮素還可以促進(jìn)畜禽對其他營養(yǎng)物質(zhì)的利用[2,6-7]，這些結(jié)果均表明，飼糧添加黃酮類化合物是提高飼料蛋白質(zhì)利用率的有效途徑。然而關(guān)于槲皮素影響飼料蛋白質(zhì)利用的機(jī)制研究尚不完善，特別是槲皮素對豬利用飼料蛋白質(zhì)的作用機(jī)制研究仍屬空白。因此，本研究以豬腸上皮細(xì)胞作為模型，研究槲皮素對豬腸上皮細(xì)胞利用蛋白質(zhì)的作用機(jī)制，旨在為槲皮素在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器及材料

ELITE-300PLUS型基礎(chǔ)電泳儀電源(美國Wealtec)；5415C型高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf)；UV-2540分光光度計(日本SHIMAZDU)；NanoDrop超微量紫外-可見光分光光度計(美國ThermoFisher)；Yrdimes SW07D0567蛋白印跡儀(美國Wealtec)；Li-COR Odyssey凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Li-COR)；ABI Prism 7500型實時熒光定量PCR儀(德國Roche)。

豬腸上皮細(xì)胞由中國科學(xué)院亞熱帶生態(tài)研究所印遇龍院士惠贈；DMEM/F12培養(yǎng)液購自Invitrogen公司；無支原體胎牛血清購自Gibco公司；槲皮素(純度≥97%)、二甲基亞砜(DMSO)、雙抗、磷酸鹽緩沖液(PBS)皆購自美國Sigma公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量試劑盒皆購自中國大連TaKaRa公司；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳試劑盒、全蛋白抽提試劑盒和Western blot檢測試劑盒皆購自中國南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；其他相關(guān)試驗試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將復(fù)蘇后的豬腸上皮細(xì)胞按1×105個/瓶接種于含有89% DMEM/F12、10%胎原血清和1%雙抗培養(yǎng)液的25 mL培養(yǎng)瓶中，之后將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于二氧化碳恒溫密閉式培養(yǎng)箱(37 ℃，飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%)中進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)液每隔2 d更換1次，以確保細(xì)胞維持對數(shù)生長。收集對數(shù)生長期的細(xì)胞并消化分離后，按1×106個/mL的濃度以每孔2 mL接種到6孔板。將經(jīng)過48 h培養(yǎng)的細(xì)胞分為6組，試驗組分別添加含0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/L槲皮素的DMSO溶液，對照組添加0.2% DMSO，每組重復(fù)6孔。處理72 h后收集細(xì)胞以進(jìn)行RNA的提取和蛋白質(zhì)含量的測定。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量的測定

槲皮素處理72 h后，棄掉培養(yǎng)液并用PBS溶液清洗待測細(xì)胞2次。每孔加入200 μL放射免疫沉淀(RIPA)裂解液，離心(10 000 r/min，3 min)后取上清液。采用二喹啉甲酸(BSA)法，按照牛血清白蛋白試劑盒的說明制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測樣品與工作液按100 μL/孔先后加入96孔板中，每個樣品平行3次。立即混勻，于37 ℃水浴60 min后再冷卻至室溫，然后用酶標(biāo)儀在562 nm處測定樣品的吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品的蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測

試驗使用Trizol試劑提取受試細(xì)胞的總RNA，并用NanoDrop超微量紫外-可見光分光光度計測定提取的總RNA濃度和A260 nm/A280 nm的比值。RNA的完整性用1.2%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測，確保出現(xiàn)5S、18S和28S rRNA這3條亮帶。用0.1%焦碳酸二乙酯水調(diào)整所有樣品的RNA濃度至200 ng/μL。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄為模板cDNA。使用ABI 7500熒光定量PCR儀和熒光定量試劑盒進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測。內(nèi)參基因為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，試驗采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA的相對表達(dá)量。上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計并合成所有引物，引物序列見表1和表2。

1.2.4 Western blot檢測

用冰冷PBS溶液清洗細(xì)胞2次后移至預(yù)冷的離心管中，于冰上加入含有蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和苯甲基磺酰氟(PMSF)混合物的冰冷裂解緩沖液。樣品在4 ℃搖床振蕩15 min后，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，取得上清液即為全蛋白抽提物。取30 μg蛋白質(zhì)樣品，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜，將膜置于平皿中，5%脫脂奶粉封閉液進(jìn)行封閉，封閉結(jié)束后用Tris-HCl緩沖液(TBST)清洗3次。將膜移至含有一抗的平皿中，置于4 ℃搖床振蕩孵育過夜。次日，棄去一抗，經(jīng)TBST清洗后加入用封閉液按1∶8 000比例稀釋的二抗，室溫振蕩反應(yīng)2 h，結(jié)束后用TBST清洗3次，按照電子化學(xué)發(fā)光法(ECL)試劑盒的說明書進(jìn)行檢測。GAPDH為內(nèi)參。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)的單因素方差分析與Duncan氏多重比較檢驗由SPSS 20.0軟件完成。Western blot檢測結(jié)果的灰度分析使用Gel-Pro Analyzer 4軟件完成，GraphPad Prism 5軟件完成試驗結(jié)果的柱狀圖繪制。試驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

表1 氨基酸和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體引物序列

表2 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路相關(guān)信號分子的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素對豬腸上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的影響

由表3可知，與對照組相比，0.4和0.8 mg/L槲皮素均極顯著增加豬腸上皮細(xì)胞中蛋白質(zhì)的含量(P<0.01)。

2.2 槲皮素對豬腸上皮細(xì)胞氨基酸和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA相對表達(dá)量的影響

由表4可知，與對照組相比，1.6 mg/L槲皮素極顯著提高細(xì)胞中興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體1(EAAC1)、谷氨酰胺載體2(ASCT2)、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體A2(ATA2)、L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體2(LAT2)、酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體1(CAT1)、b0,+系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體(rBAT)、y+L系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體1(y+LAT1)、y+L系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體2(y+LAT2)和寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體1(PepT1)mRNA相對表達(dá)量(P<0.01)。

2.3 槲皮素對豬腸上皮細(xì)胞mTOR信號通路相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量的影響

由表5可知，與對照組相比，0.4 mg/L槲皮素極顯著降低結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1(TSC1)和真核細(xì)胞翻譯起始因子4A(eIF4A)mRNA相對表達(dá)量(P<0.01)；0.8 mg/L可極顯著增加豬腸上皮細(xì)胞mTOR和核糖體蛋白S6(RPS6)mRNA相對表達(dá)量并極顯著降低TSC1 mRNA相對表達(dá)量(P<0.01)；1.6 mg/L槲皮素極顯著增加豬腸上皮細(xì)胞中mTOR、真核起始因子4E結(jié)合蛋白1(4E-BP1)、真核細(xì)胞翻譯起始因子4E(eIF4E)、eIF4A、真核細(xì)胞翻譯起始因子4B(eIF4B)和RPS6 mRNA相對表達(dá)量(P<0.01)。

表3 槲皮素對豬腸上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的影響

表4 槲皮素對豬腸上皮細(xì)胞氨基酸和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA相對表達(dá)量的影響

續(xù)表4項目Items槲皮素添加水平 Quercetin supplemental levels/(mg/L)0(對照 Control)0.10.20.40.81.6中性和堿性氨基酸載體b0,+系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體rBAT1.05±0.05Aa1.11±0.19Aa1.48±0.44Aa1.15±0.02Aa1.20±0.08Aa2.22±0.10Bby+L系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體1y+LAT11.16±0.09Aa0.60±0.04Bb0.77±0.10Bb0.64±0.04Bb0.59±0.11Bb2.08±0.20Ccy+L系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體2y+LAT21.06±0.17Aa0.55±0.05Bb0.69±0.05Bb0.52±0.03Bb0.58±0.06Bb1.31±0.08Aa小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體1PepT11.11±0.15Aa0.89±0.07ABab0.54±0.05Bb0.49±0.06Bb0.77±0.05Aa1.47±0.30Cc

表5 槲皮素對豬腸上皮細(xì)胞mTOR信號通路相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量的影響

為驗證槲皮素處理對豬腸上皮細(xì)胞mTOR信號通路相關(guān)基因表達(dá)的影響，采用Western blot法檢測mTOR、eIF4E、4E-BP1和eIF4A蛋白表達(dá)量。此外，根據(jù)槲皮素處理后細(xì)胞中mTOR信號通路相關(guān)基因的mRNA相對表達(dá)量結(jié)果，選擇0.1和1.6 mg/L槲皮素進(jìn)行檢測。由圖1可知，與對照組相比，0.1和1.6 mg/L槲皮素可極顯著提高細(xì)胞中mTOR、eIF4E和eIF4A蛋白表達(dá)量(P<0.01)，并極顯著降低4E-BP1蛋白表達(dá)量(P<0.01)。

3 討 論

3.1 槲皮素對豬腸上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的影響

蛋白質(zhì)是構(gòu)成動物機(jī)體的關(guān)鍵物質(zhì)，在機(jī)體的各項生命活動中都發(fā)揮重要作用。目前，蛋白質(zhì)資源短缺和過量的氮排泄問題使得提高畜禽對蛋白質(zhì)的利用變得更加迫切。開發(fā)更加有效的飼料添加劑如黃酮類物質(zhì)，是解決這一問題的好辦法。飼糧添加大豆黃酮和柑橘黃酮可以提高肉雞胸肌蛋白質(zhì)含量[8]。富含黃酮類物質(zhì)的銀杏葉提取物和連翹提取物提高了愛拔益加肉雞的粗蛋白質(zhì)表觀代謝率[9-10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以提高愛拔益加肉雞的粗蛋白質(zhì)表觀代謝率并增加胸肌、腿肌蛋白質(zhì)沉積，這可能與槲皮素提高了肉雞消化道蛋白酶的活性及激活TOR信號通路有關(guān)[2]。本試驗發(fā)現(xiàn)，槲皮素提高了豬腸上皮細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量，提示槲皮素可能與其他黃酮類物質(zhì)相同，也具有提高畜禽對蛋白質(zhì)利用率的作用。

mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 mammalian target of rapamycin;4E-BP1:真核起始因子4E結(jié)合蛋白1 eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1;eIF4E:真核細(xì)胞翻譯起始因子4E eukaryotic translation initiation factor 4E; eIF4A：真核細(xì)胞翻譯起始因子4A eukaryotic translation initiation factor 4A;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase。

3.2 槲皮素對豬腸上皮細(xì)胞氨基酸和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA相對表達(dá)量的影響

氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體在感應(yīng)機(jī)體腸腔中氨基酸的流動、調(diào)節(jié)游離氨基酸穿過腸細(xì)胞頂端和刷狀緣膜的運(yùn)動、以及細(xì)胞內(nèi)氨基酸池和下游信號中起著不可或缺的作用[11-12]。依據(jù)氨基酸的底物特異性將氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體分為中性系統(tǒng)、堿性系統(tǒng)、酸性系統(tǒng)、亞胺-甘氨酸系統(tǒng)和β-氨基酸系統(tǒng)[12-13]。轉(zhuǎn)運(yùn)載體的基因表達(dá)可作為小腸生長和吸收能力的指標(biāo)[12,14-15]。EAAC1是一種對谷氨酸具有高親和力的鈉依賴性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體[16]，當(dāng)斷奶仔豬回腸EAAC1基因表達(dá)降低時，回腸谷氨酸含量相應(yīng)降低[17]。ATA2、ASCT2和LAT2是中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體，在腸腔內(nèi)，ASCT2可吸收丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、蘇氨酸、絲氨酸與谷氨酰胺等大部分的中性氨基酸；ATA2對部分中性氨基酸有廣泛的親和力，能夠吸收蛋氨酸、脯氨酸、絲氨酸等中性氨基酸；而LAT2主要對芳香族氨基酸和支鏈氨基酸進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。CAT1屬于堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體，能夠轉(zhuǎn)運(yùn)鳥氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸。rBAT、y+LAT1和y+LAT2對中性氨基酸和堿性氨基酸具有廣泛的親和力。小肽與氨基酸的吸收機(jī)制不同，兩者相互獨(dú)立，互不干擾，因此，小肽能夠降低常見吸收位點(diǎn)針對游離氨基酸競爭吸收的拮抗作用以加速氨基酸吸收與蛋白質(zhì)合成[18]。PepT1主要在腸上皮細(xì)胞表達(dá)，是腸上皮細(xì)胞吸收小肽的主要載體，能夠?qū)⒕哂?～5個氨基酸殘基的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)到腸腔內(nèi)，而且轉(zhuǎn)運(yùn)二肽的速度最快[19]。黃酮類物質(zhì)雖能促進(jìn)氨基酸的吸收[20]，但對氨基酸及小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體作用的研究卻鮮見報道。在本研究中，槲皮素促進(jìn)了豬腸上皮細(xì)胞中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體EAAC1、ASCT2、ATA2、LAT2、CAT1、rBAT、y+LAT1、y+LAT2和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體PepT1 mRNA相對表達(dá)量，表明槲皮素能經(jīng)由上調(diào)氨基酸及小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)來增強(qiáng)豬腸上皮細(xì)胞對氨基酸和小肽的吸收。

3.3 槲皮素對豬腸上皮細(xì)胞mTOR信號通路相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量及蛋白表達(dá)量的影響

氨基酸、能量和生長因子能夠有效激活mTOR信號通路[21]，mTOR信號通路的靶點(diǎn)可調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞中的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，促進(jìn)氨基酸的吸收和利用，還可通過調(diào)控腸上皮細(xì)胞中的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體參與調(diào)節(jié)氨基酸的吸收和利用[22-23]。S6K1和4E-BP1是mTOR信號通路下游最重要的2個信號分子。正常情況下，mTOR信號通路可通過調(diào)節(jié)S6K1和4E-BP1等下游信號通路蛋白的磷酸化狀態(tài)傳遞機(jī)體營養(yǎng)狀況等信號，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)核糖體發(fā)生、蛋白質(zhì)合成等過程[24]。研究發(fā)現(xiàn)，甘氨酸能夠通過調(diào)控mTOR信號通路來促進(jìn)新生豬腸上皮細(xì)胞的生長和增殖[25]；谷氨酰胺可激活豬小腸細(xì)胞mTOR信號通路并調(diào)控S6K1和4E-BP1表達(dá)以增加細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成且抑制蛋白質(zhì)降解[26]。mTOR信號通路能夠調(diào)節(jié)4E-BP1的磷酸化水平以影響翻譯起始復(fù)合物的功能。TSC是mTOR復(fù)合物的重要上游調(diào)節(jié)因子。若TSC1/2二聚體的磷酸化被激活，則mTOR復(fù)合物1(mTORC1)的活性被抑制；當(dāng)TSC1/2二聚體的磷酸化被抑制時，mTORC1的活性被增強(qiáng)，因此通路的信號被傳遞到下游[27]。本研究中，槲皮素降低了TSC1 mRNA相對表達(dá)量，意味著槲皮素處理可能導(dǎo)致TSC1蛋白被翻譯的數(shù)量減少，從而抑制TSC1/2二聚體的磷酸化，使得mTORC1活性增強(qiáng)，有利于信號傳至下游。mTORC1被激活后，4E-BP1被磷酸化并與eIF4E分離[28]。隨著游離eIF4E的增加，可與eIF4A和eIF4G合成eIF4F復(fù)合物，促進(jìn)帽依賴式翻譯。在本研究中，槲皮素上調(diào)了4E-BP1 mRNA相對表達(dá)量，這意味著槲皮素處理可能導(dǎo)致更多的4E-BP1蛋白被翻譯；此外，槲皮素降低了非磷酸化4E-BP1蛋白的表達(dá)，提示槲皮素增加了磷酸化4E-BP1蛋白的表達(dá)，從而增加了游離eIF4E的數(shù)量；而且本研究中，槲皮素增加了eIF4EmRNA相對表達(dá)量和蛋白表達(dá)量，進(jìn)一步說明槲皮素通過調(diào)節(jié)4E-BP1的磷酸化狀態(tài)促進(jìn)帽依賴式翻譯過程。mTOR信號通路還能夠通過調(diào)節(jié)S6K1的磷酸化水平調(diào)控核糖體蛋白和翻譯調(diào)節(jié)蛋白的合成以及蛋白質(zhì)翻譯過程中肽鏈的延伸[2]。活化的S6K1可促進(jìn)eIF4B的磷酸化，并通過eIF4G和eIF4A形成eIF4F復(fù)合物，從而促進(jìn)帽依賴式翻譯。真核細(xì)胞延伸因子2激酶(eEF2K)能夠促進(jìn)真核細(xì)胞延伸因子2(eEF2)磷酸化來弱化eEF2與和核糖體的結(jié)合，從而阻礙肽鏈的延伸。然而活化后的S6K1可抑制eEF2K的表達(dá)以實現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯過程中肽鏈延伸的目的。此外，當(dāng)eEF2K活性被抑制時，核糖體蛋白RPS6的磷酸化增強(qiáng)，繼而促進(jìn)一些末端嘧啶基因的翻譯，從而影響蛋白質(zhì)的翻譯過程。本研究中，槲皮素提高了豬腸上皮細(xì)胞mTOR、4E-BP1、RPS6、eIF4E、eIF4B和eIF4AmRNA相對表達(dá)量，并降低了TSC1 mRNA相對表達(dá)量。此外，槲皮素還降低了4E-BP1蛋白表達(dá)量，并提高了eIF4E、eIF4B和eIF4A蛋白表達(dá)量。本課題組以往的研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素還可上調(diào)S6K1和eEF2 mRNA相對表達(dá)量，并下調(diào)eEF2KmRNA相對表達(dá)量[4]。由此可見，槲皮素可通過激活mTOR信號通路并調(diào)節(jié)部分信號通路基因的表達(dá)來促進(jìn)豬腸上皮細(xì)胞對蛋白質(zhì)的利用。

4 結(jié) 論

① 經(jīng)槲皮素處理過的豬腸上皮細(xì)胞中蛋白質(zhì)的含量提高。

② 槲皮素促進(jìn)了豬腸上皮細(xì)胞氨基酸和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的mRNA表達(dá)。

③ 槲皮素可調(diào)控豬腸上皮細(xì)胞mTOR信號通路部分基因的mRNA及蛋白表達(dá)。