陳小飛，嚴(yán) 楠，張 斌，廖 明*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室/廣東省動(dòng)物原性人獸共患病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510642； 2.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041)

A群輪狀病毒(group A rotavirus，RVA)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)輪狀病毒屬(Rotavirus)，是仔豬以及其他幼齡哺乳動(dòng)物胃腸炎的主要病原之一[1-4]。RVA跨越種間屏障，引起幼兒腹瀉已被證實(shí)[5-7]。RVA是由11個(gè)不連續(xù)的雙鏈RNA組成的無囊膜病毒，分別編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-VP4、VP6、VP7)和5或6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1-NSP5/6)[8-10]。

據(jù)報(bào)道RVA的外衣殼蛋白VP7和VP4能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，是構(gòu)成G和P雙重分型系統(tǒng)的核心[11]，至今RVA已確立了35個(gè)G基因型和50個(gè)P基因型[12-13]。VP6是RVs基因組的核心蛋白，占病毒蛋白的50%以上，是參與介導(dǎo)RVA黏膜免疫反應(yīng)的特異性抗原，高度保守，具有較強(qiáng)的診斷學(xué)意義[8-10,14]。

隨著PCR應(yīng)用的推廣，極大地滿足臨床診斷的時(shí)效性需求，由于熒光定量PCR的靈敏性高，已逐漸成為金標(biāo)準(zhǔn)，用于各種疾病的檢測(cè)及監(jiān)控。近年來已建立了RVA PCR檢測(cè)方法[15-18]，但是由于RV的變異性，急需高效通用的檢測(cè)方法。本研究根據(jù)最近5年來NCBI及本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并測(cè)序的結(jié)果，通過針對(duì)RVA VP6的保守序列設(shè)計(jì)引物、優(yōu)化條件等建立了檢測(cè)RVA的熒光定量PCR方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株和臨床樣本 豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)疫苗株，廣東永順生物制藥股份有限公司提供；豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，RRRSV)疫苗株，吉林碩騰國原動(dòng)物保健品有限公司提供；豬A群輪狀病毒RVA/Pig-tc/CHN/SCMY-A3/2017/G9P [23]、豬輪狀病毒G9G3G4G5G26亞型、豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、豬呼腸孤病毒(Porcine reovirus,MRV)、豬捷申病毒(Porcine teschovirus,PTV)、巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,PM)、鏈球菌(Streptococcus,SS)及豬等孢球蟲(Isosporasuis)核酸，西南民族大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

2018年-2019年91份仔豬腹瀉糞便或腸道臨床樣本，來自四川省10個(gè)地區(qū)18個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)。

1.1.2 主要試劑與儀器 常規(guī)熒光定量PCR設(shè)備及試劑。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank近5年來發(fā)布的豬RVA VP6基因序列進(jìn)行比對(duì)，針對(duì)保守區(qū)域用Premier 5軟件設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物R：5'-TCAAGCACGATTTGGAAC-3'，下游引物F：5'-TGGTATTGCGTATTCCTG-3'，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為209 bp，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2.2 陽性RVA標(biāo)準(zhǔn)品的制備 取本實(shí)驗(yàn)室保存的豬A群輪狀病毒RVA/Pig-tc/CHN/SCMY-A3/2017/G9P[23]，按照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，并按照PrimeScriptTMRT試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以cDNA為模板對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳及凝膠成像掃描進(jìn)行鑒定。將PCR陽性擴(kuò)增目的條帶通過膠回收、克隆、提取相應(yīng)質(zhì)粒，再經(jīng)序列測(cè)定驗(yàn)證后作為本試驗(yàn)的陽性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒。將獲得的陽性標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)核酸蛋白測(cè)定儀定量，計(jì)算拷貝數(shù)后連續(xù)10倍梯度稀釋，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 TB Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 通過對(duì)反應(yīng)體系中退火溫度、最佳引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，最佳反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，54 ℃ 20 s，78℃ 5 s，共循環(huán)40次。優(yōu)化后的20 μL最佳反應(yīng)體系為：TB Green Premix ExTaqⅡ 10 μL，模版1 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。

在該反應(yīng)條件下，陽性標(biāo)準(zhǔn)品10倍系列稀釋(101～109)的質(zhì)粒作為模板建立檢測(cè)豬RVA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 TB Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性試驗(yàn) 用優(yōu)化的反應(yīng)體系及條件檢測(cè)豬RVA(G3、G4、G5、G9、G26)，以及豬常見病原(CSFV、PRRSV、PEDV、MRV、PTV、PM、SS、豬等孢球蟲)，以檢驗(yàn)所建立的TB Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的特異性。

1.2.5 TB Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn) 將陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒設(shè)3個(gè)重復(fù)，用優(yōu)化好的反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)；將陽性質(zhì)粒-20 ℃保存，每周檢測(cè)1次，連續(xù)3次，計(jì)算批間變異系數(shù)。

1.2.6 TB Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR臨床檢測(cè)及應(yīng)用 將91份臨床腹瀉樣本用PBS重懸，離心取上清，按Trizol法提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用本研究建立的TB Green 熒光定量PCR、文獻(xiàn)報(bào)道的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR[15]檢測(cè)方法和國家標(biāo)準(zhǔn)RVA普通RT-PCR檢測(cè)方法[16]同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估本方法與以報(bào)道方法及國家標(biāo)準(zhǔn)法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 TB Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，得到大小約為209 bp的目的片段，與預(yù)期結(jié)果相符，測(cè)序分析顯示，該片段與親本毒株的VP6基因序列的一致性為100%，并與NCBI中其他豬源RVA VP6基因片段同源性大于90%。該陽性質(zhì)粒濃度為337.1 ng/μL，1.06×1011copies/μL。

基于TB Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)RVA陽性質(zhì)粒在1.06×108copies/μL～1.06×102copies/μL有很好的線性關(guān)系，最低檢測(cè)值為106 copies/μL，擴(kuò)增曲線見圖1。所獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為：y=-3.519x+ 40.104，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 5，擴(kuò)增效率為92.35%，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。熔解曲線(圖3)顯示，溶解溫度Tm = 83 ℃±0.5 ℃，只產(chǎn)生特異性單峰，沒有引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。

1～8.10倍梯度稀釋的1.06×108 copies/μL～1.06×102 copies/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品

2.2 TB Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果

用本研究建立的TB Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法僅對(duì)RVA(G3、G4、G5、G9、G26)擴(kuò)增出陽性信號(hào)，對(duì)豬常見病原(如PRRSV、CSFV、PEDV、MRV、PTV、SS、PM及SC)均未檢測(cè)到擴(kuò)增信號(hào)(圖4)。表明本研究建立的TB Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)豬RVA有良好的特異性，并能檢測(cè)多種RVA亞型。

2.3 TB Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

TB Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)陽性標(biāo)準(zhǔn)品1.06×103、1.06×104、1.06×105copies/μL的批內(nèi)變異系數(shù)分別為1.68%、1.46%、1.94%；批間變異系數(shù)分別為1.89%、1.54%、1.22%(表1)；批間和批內(nèi)的變異系數(shù)均小于2%，表明該方法具有很好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

圖2 TB Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 RVA TB Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR的熔解曲線

2.4 臨床腹瀉樣本檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用本研究建立的TB Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法、已報(bào)道的SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法[15]和國家標(biāo)準(zhǔn)RVA普通RT-PCR方法[16]對(duì)91份臨床腹瀉樣本檢測(cè)結(jié)果表明，國家標(biāo)準(zhǔn)RVA普通RT-PCR檢出11份(12.09%)RVA陽性，已報(bào)道的熒光定量PCR方法[15]檢出39份(42.86%)RVA陽性，本研究建立的TB Green熒光定量PCR檢測(cè)方法檢出40份(43.96%)RVA陽性。已報(bào)道的兩種PCR方法檢測(cè)的陽性樣品，TB Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)也為陽性，本方法與已報(bào)道熒光定量PCR方法及國家標(biāo)準(zhǔn)RVA檢測(cè)方法符合率為100%。對(duì)40份陽性樣本進(jìn)行克隆測(cè)序，結(jié)果表明均為RVA VP6核酸序列片段。

1.質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品1.06×104 copies/μL；2～6.RVA陽性；7～15.PRRSV、CSFV、PEDV、MRV、PTV、SS、PM、豬等孢球蟲和陰性對(duì)照

表1 批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)

3 討論

豬A群輪狀病毒(Group A Rotavirus，RVA)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)輪狀病毒屬(Rotavirus)，是引起小孩和仔豬腹瀉的主要原因[1]。無論是單純的輪狀病毒感染還是混合感染都直接或間接的影響豬群生產(chǎn)力，從而導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并且已經(jīng)證實(shí)豬 RVA引起幼兒腹瀉[5-7]。

輪狀病毒基因組由11個(gè)雙鏈的RNA節(jié)段構(gòu)成，分別編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-VP4、VP6和VP7)和6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1-NSP6)。根據(jù)VP6抗原的差異將輪狀病毒分為10個(gè)基因群組(A-J)[11]，由于VP6基因的高度保守，所以成為國內(nèi)外檢查RVs的最重要分子靶點(diǎn)[8-10,14]。本研究根據(jù)GenBank中近5年來豬RVA VP6最新序列分析，針對(duì)保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，同對(duì)優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，成功建立了TB Green熒光定量PCR檢測(cè)方法。該方法特異性好，用于檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)保存的豬RVA亞型G3、G4、G5、G9、G26均可見特異性擴(kuò)增曲線和單特異性熔解曲線，而對(duì)豬常見病原如PRRSV、CSFV、PEDV、MRV、PTV、SS、PM以及豬等孢球蟲檢測(cè)均為陰性；重復(fù)性高，批間、批內(nèi)變異系數(shù)均小于2%；靈敏度高，對(duì)陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的檢測(cè)下限為106 copies/μL，該方法完全能滿足臨床樣本的檢查。本研究建立的TB Green熒光定量PCR檢測(cè)方法不僅為豬RVA的診斷提供了方法，而且為RVA的流行病學(xué)調(diào)查提供了有力的工具。本研究建立的熒光定量PCR方法檢測(cè)下限為106 copies/μL。我們?cè)趯?duì)采自四川10個(gè)地區(qū)18個(gè)豬場(chǎng)的91份仔豬臨床腹瀉樣本采用本研究建立TB Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法、已發(fā)表SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法[15]進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)出率分別是43.96%(40/91)、42.86%(39/91)，而采用國家標(biāo)準(zhǔn)普通RT-PCR[16]方法的檢出率為12.09%(11/91)。上述結(jié)果表明本研究所建立的方法檢出率顯著高于國家標(biāo)準(zhǔn)法，這可能是由于國家標(biāo)準(zhǔn)法是針對(duì)RVA VP7基因建立，而VP7基因變異較大，決定RVA G型[11]。

王振玲等[19]對(duì)北京地區(qū)2010年8月-2012年1月的248份腹瀉樣本采用膠體金快速檢測(cè)試紙進(jìn)行RV抗原檢測(cè)，其陽性率為17.7%～40%；王璐等[20]對(duì)2011年-2012年除海南、西藏自治區(qū)外全國的531份病料采用PCR方法進(jìn)行調(diào)查，顯示樣本陽性率為7.34%，豬場(chǎng)陽性率為19%，西南地區(qū)2.7%(1/37)。曹恭貌等[21]對(duì)四川部分地區(qū)2015年的腹瀉樣本使用PCR方法檢測(cè)顯示陽性率為7.69%(10/130)。秦谷雨等[22]對(duì)安徽省2011年10月-2012年5月的37個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)采集病料使用RT-PCR方法檢測(cè)顯示，豬RV樣本陽性率為8.1%，豬場(chǎng)陽性率為21.6%。而本研究中對(duì)2018年-2019年，四川10個(gè)地區(qū)的18個(gè)農(nóng)場(chǎng)91份仔豬臨床腹瀉樣本顯示樣本陽性率為43.96%。上述研究提示我國豬RV的感染率可能在逐年增加，地區(qū)間應(yīng)該存在感染率差異，近年來四川地區(qū)豬RV感染率顯著高于過去，這些差異可能與檢測(cè)方法有關(guān)。

綜上所述，本研究基于RVA VP6建立的熒光定量PCR方法檢測(cè)下限為106 copies/μL，靈敏度高、準(zhǔn)確性好，在豬RVA的快速診斷、流行病學(xué)調(diào)查等方面具有極高的應(yīng)用價(jià)值。