羅弼豪，韓雪英，常振宇，郭抗抗

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏林芝 860000)

副乳房鏈球菌(Streptococcusparauberis，Spu)是一種球型、短鏈狀排列的革蘭氏陽性菌，無運(yùn)動(dòng)性，能夠引起多種動(dòng)物疾病并表現(xiàn)出血性敗血癥、眼球突出癥、腦膜炎、惡病質(zhì)等臨床癥狀，在短時(shí)間內(nèi)病死率可達(dá)50%以上，給養(yǎng)殖業(yè)造成了極其嚴(yán)重的損失[1]。1996年，該菌最早發(fā)現(xiàn)于西班牙北部的大菱鲆養(yǎng)殖場，被認(rèn)定是魚類的一種重要病原菌[2]。此后，在污染的肉制品、奶牛乳房炎乳汁和病死豬肺臟中相繼分離鑒定出副乳房鏈球菌[3-5]，但是目前并沒有關(guān)于牦牛源副乳房鏈球菌的相關(guān)報(bào)道。2019年，對青海省某養(yǎng)殖場出現(xiàn)呼吸道疾病的牦牛肺臟組織進(jìn)行了細(xì)菌培養(yǎng)，通過對分離菌的形態(tài)特征觀察、生化試驗(yàn)、16S rDNA序列分析等確定了3株副乳房鏈球菌，并進(jìn)行了小鼠致病性試驗(yàn)和藥物敏感性研究，旨在為牦牛中副乳房鏈球菌的基礎(chǔ)研究和防控提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 肺臟組織采自青海省某規(guī)?；笈ｐB(yǎng)殖場，無菌采集后，干冰保存并及時(shí)送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離。4周齡～6周齡清潔級昆明小鼠30只，雌雄各半，體重20 g左右，購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑 血平板，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)，武漢科瑞生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；標(biāo)準(zhǔn)小牛血清、pMD19-T 載體、大腸埃希氏菌DH5α，北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；生化反應(yīng)試劑、藥敏紙片，杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌DNA提取試劑盒、16S rDNA PCR試劑盒、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000，杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 PCR擴(kuò)增儀(S-1000)、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；全自動(dòng)半封閉脫水機(jī)(TP1020)、染色機(jī)，YAGUANG公司產(chǎn)品；病理石蠟包埋機(jī)(LS-100)、自動(dòng)恒溫?cái)偪竞嫫瑱C(jī)(GTK-2002)，湖北貝諾醫(yī)療科技有限公司產(chǎn)品；石蠟切片機(jī)(LEICA RM 2126)，德國Leica公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡(Motic AE2000)，麥克奧迪實(shí)業(yè)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化 無菌采集的肺臟用常規(guī)方法劃線接種于TSA培養(yǎng)基(含50 mL/L小牛血清)，37 ℃培養(yǎng)24 h后挑取半透明、光滑、圓形，伴有少量熒光的可疑菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。將純化菌落接種于血平板上觀察溶血情況。對分離純化的細(xì)菌進(jìn)行載玻片涂片、革蘭氏染色、顯微鏡觀察。

1.2.2 分離菌株的生化鑒定 將分離菌株接種于TSA培養(yǎng)基上，按常規(guī)方法使用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管進(jìn)行試驗(yàn)，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[6]判定并分析結(jié)果。

1.2.3 分離菌株的16S rDNA鑒定 利用高溫裂解法提取分離菌株的基因組DNA，并利用16S rDNA通用引物(F:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)對分離菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，16S rDNA擴(kuò)增長度約1 500 bp。PCR 反應(yīng)體系50 μL：2×PCR Mixture 25 μL，ddH2O 21 μL，DNA模板 2 μL，上、下游引物各1 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將陽性PCR產(chǎn)物回收后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將陽性克隆送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 分離菌株的同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將測序獲得的16S rDNA序列利用Blast軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的副乳房鏈球菌16S rDNA基因序列進(jìn)行同源性比對分析，并采用Mega 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹。

1.2.5 致病性試驗(yàn) 將純化好的單菌落接種于TSB培養(yǎng)液(含50 mL/L小牛血清)中，置37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)并用生理鹽水將菌液稀釋后用于動(dòng)物感染試驗(yàn)。將小鼠隨機(jī)平均分為3組(n=10)：低劑量組(LD)、高劑量組(HD)和對照組(C)，各組小鼠分別腹腔注射6.4×109CFU菌液、9.6×109CFU菌液和TSB培養(yǎng)液。接種后每日觀察小鼠臨床癥狀和死亡情況并做好記錄，剖檢死亡小鼠并無菌采集肝臟、肺、脾臟等組織，用多聚甲醛(40 mg/mL)固定，進(jìn)行HE染色。

1.2.6 藥物敏感性試驗(yàn) 采用K-B 紙片擴(kuò)散法[7]進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)推薦的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 分離菌株的形態(tài)特征

對肺臟組織進(jìn)行細(xì)菌分離，結(jié)果分離純化得到3株優(yōu)勢菌株；分離菌株在TSA(含50 mL/L小牛血清)長出半透明、光滑、圓形、伴有少量熒光的單菌落；血平板上長出灰白色、突起、光滑、邊緣整齊菌落，有α 溶血現(xiàn)象。革蘭氏染色結(jié)果可見，分離菌株為革蘭氏陽性的成雙或短鏈狀排列的短桿菌或球桿菌(圖1)，將其命名為Spu-1、Spu-2和Spu-3。

2.2 分離菌株的生化鑒定

生化鑒定結(jié)果顯示，分離菌株發(fā)酵甘露醇、菊糖和水楊苷，不發(fā)酵鼠李糖和乳糖，其中Spu-1和Spu-3發(fā)酵葡萄糖、蔗糖和海藻糖，不發(fā)酵山梨醇，而Spu-2發(fā)酵山梨醇不發(fā)酵葡萄糖、蔗糖和海藻糖(表1)。參考伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊分析，Spu-1、Spu-2和Spu-3分離株均符合副乳房鏈球菌的生化特性。

圖1 副乳房鏈球菌革蘭氏染色鏡檢結(jié)果(1 000×)

表1 分離株生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3 分離菌株16S rDNA鑒定

提取分離菌株的基因組DNA進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增，產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結(jié)果顯示，擴(kuò)增出的片段大約在1 500 bp(圖2)，與預(yù)期的基因片段大小相符。

2.4 分離菌株同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的建立

將測序得到的16S rDNA基因序列經(jīng)Blast比對分析，分離菌株的16S rDNA基因序列與GenBank中副乳房鏈球菌相應(yīng)序列同源性在99%。利用Mega 6.0 軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)分離菌株Spu-1、Spu-2和Spu-3與副乳房鏈球菌SPOF3K相似(CP025420.1)聚為一簇，進(jìn)一步證實(shí)了分離菌株為副乳房鏈球菌(圖3)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;N.陰性對照;1～3.分離株

2.5 分離菌株致病性試驗(yàn)

本研究選取病變最嚴(yán)重的肺臟分離株Spu-1，腹腔注射昆明小鼠進(jìn)行致病性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，低劑量組和高劑量組小鼠20 h內(nèi)均死亡，對照組小鼠均存活并且十分活躍。通過肺、肝、脾、腎的HE染色可以發(fā)現(xiàn)，對照組小鼠各實(shí)質(zhì)器官均沒有明顯病理變化。高劑量組和低劑量組肺臟組織出現(xiàn)嚴(yán)重出血，炎性細(xì)胞浸潤，許多肺泡縮小甚至消失(圖4A)。高劑量組和低劑量組脾臟組織瘀血、出血，有中性粒細(xì)胞浸潤(圖4B)。高劑量組和低劑量組肝臟組織瘀血，肝細(xì)胞變性、壞死，炎性細(xì)胞浸潤(圖4C)。高劑量組和低劑量組腎臟組織出血，以淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤，腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死(圖4D)。與高劑量組相比，低劑量組的組織病理學(xué)變化略輕。

圖3 牦牛源副乳房鏈球菌分離株與參考菌株16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

1.肺;2.脾;3.肝;4.腎;LD.低劑量;HD.高劑量;C.對照

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

選取臨床常用的9種抗菌藥物對分離菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。按照CLSI動(dòng)物源性藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，以抑菌圈直徑位于CLSI規(guī)定的耐藥(resistance，簡稱R)、中敏(intermediate，簡稱I)、敏感(sensitive，簡稱S)值的范圍判斷試驗(yàn)結(jié)果。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，3株Spu對四環(huán)素和強(qiáng)力霉素有不同程度的耐藥性， 所有Spu分離株均對鏈霉素耐藥，對紅霉素、阿奇霉素、萬古霉素和麥迪霉素敏感或中度敏感(表2)，因此可以選用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素進(jìn)行治療。

表2 牦牛源副乳房鏈球菌分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

作為我國青藏高原地區(qū)的特有品種和優(yōu)勢家畜，牦牛是當(dāng)?shù)啬撩癫豢苫蛉钡奈镔|(zhì)來源和經(jīng)濟(jì)來源，其健康養(yǎng)殖對我國牧區(qū)的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展具有重要戰(zhàn)略意義[8-9]。然而牦牛多生活在高寒缺氧、晝夜溫差大、牧草匱乏的高原高山地帶，加上其以散養(yǎng)放牧為主的生產(chǎn)養(yǎng)殖模式，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件差，容易誘發(fā)各種疾病，特別是傳染病發(fā)生的頻率大大增加[10]。因此關(guān)于牦牛致病原的研究至關(guān)重要，對于牦牛傳染性疾病的防控具有實(shí)際指導(dǎo)意義。

副乳房鏈球菌是一種環(huán)境性致病菌，可以引起魚類、豬和奶牛等多種動(dòng)物的疾病，但是目前尚未見到牦牛感染副乳房鏈球菌的研究報(bào)告[11-14]。本研究采集了青海省牦牛肺臟樣本，從中分離得到了3株副乳房鏈球菌，通過培養(yǎng)特性觀察、生化特征鑒定和16S rDNA序列分析等方法對分離株進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明分離株與副乳房鏈球菌的同源性高達(dá)99%，根據(jù)細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增序列同源性大于97%便歸屬于同一個(gè)種[15]的原則，可以確定本研究中分離株確實(shí)為副乳房鏈球菌。這是國內(nèi)首次從牦牛中分離鑒定出副乳房鏈球菌。

本研究分離的3株副乳房鏈球菌經(jīng)血平板培養(yǎng)均發(fā)現(xiàn)α 溶血現(xiàn)象，通常認(rèn)為具有α 溶血特性的細(xì)菌為條件致病菌；此外，致病性試驗(yàn)也顯示，小鼠腹腔注射Spu-1菌液后表現(xiàn)出明顯副乳房鏈球菌感染癥狀，抑郁，厭食癥，呼吸困難以及死亡，組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)小鼠的肝、腎、肺、脾等組織具有損傷，這些結(jié)果提示在獸醫(yī)臨床上不可忽視該細(xì)菌的致病作用及這種病原菌的對牦牛養(yǎng)殖業(yè)潛在威脅。

合理使用抗菌類藥物是防治細(xì)菌性疾病的重要措施之一。此次藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，在受試的9 種日常養(yǎng)殖常用的抗菌藥物中，分離株對四環(huán)素和強(qiáng)力霉素有不同程度的耐藥性，所有Spu分離株均對鏈霉素耐藥，對紅霉素、阿奇霉素、萬古霉素和麥迪霉素敏感或中度敏感。因此，在治療副乳房鏈球菌引起的相關(guān)疾病，可以根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果合理選擇抗菌藥物，以提高治療效果。

本研究通過從牦牛肺臟中分離出副乳房鏈球菌，分析其形態(tài)特征、生化特性、對小鼠的致病性及對抗菌藥物的敏感性，闡明了牦牛源副乳房鏈球菌的部分生物學(xué)特性，為牦牛副乳房鏈球菌的防控提供了科學(xué)依據(jù)。