任杰，曾安平

（1 中國農業(yè)科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；2 德國漢堡工業(yè)大學，生物過程與系統(tǒng)工程研究所，德國 漢堡 D-21073）

本世紀人類面臨的最大挑戰(zhàn)之一是能源轉型和氣候變化，這兩者都與二氧化碳（CO2）的排放和利用息息相關。迫于大眾對頻繁極端氣候的高度關注和強大輿論壓力，世界各主要工業(yè)國家都紛紛公布甚至提前原定碳達峰和碳中和的時間點。尤其是中國最近在這方面的重大舉措，提出力爭于2030 年前達到CO2排放峰值，并在2060 年前實現(xiàn)碳中和，使得CO2的減排、捕捉和利用成為各領域的重大課題和迫切任務。為實現(xiàn)上述目標，需要工業(yè)技術和國家相關產業(yè)政策的根本性變革，使能源系統(tǒng)從化石能源轉化為以可再生能源為主，制造業(yè)從不可再生碳資源轉化為以可再生碳資源為主，基于CO2的生物制造從長遠來講是實現(xiàn)這兩大目標的最佳途徑。

基于CO2的生物制造在文獻中也常被稱為第三代生物煉制技術，以區(qū)別于主要以淀粉及其他含糖物質為原料的第一代生物煉制技術和以木質纖維素等生物質為原料的第二代生物煉制技術，其特征是利用微生物及藻類細胞工廠在光或電等可再生能源的驅動下將CO2等碳一化合物轉化為生物能源、化學品及材料等。生物制造原則上具有易于大規(guī)模生產、條件溫和、選擇性好、環(huán)境友好等優(yōu)點，符合綠色生態(tài)的理念，近年來基于CO2的生物制造尤其受到廣泛的重視。北京化工大學譚天偉教授課題組和Jens Nielsen 教授課題組（瑞典/丹麥）合作撰寫發(fā)表在Nature Catalysis的綜述文章“Third-generation biorefineries as the means to produce fuels and chemicals from CO2”（Liu et al，2020）［1］總結了多年來生物法固定CO2的研究，從原料、固碳途徑、能量利用和產品四個大方面系統(tǒng)地介紹了以CO2為基礎原料的第三代生物煉制。這篇綜述文章內容詳實豐富，不但對大量相關文獻進行了梳理，指出了CO2基生物制造的難點與重點，并提出了有益的建議和展望。本文簡要介紹這篇綜述文章，并結合自己的相關研究從基礎研究和工程應用的角度提出一些看法和建議，意在拋磚引玉。

Liu 等指出，CO2的人為排放量每年高達330 億噸，其來源十分廣泛，如工業(yè)生產廢氣、垃圾填埋廢氣、生物質氣化、車輛及呼吸排放等。不同來源的CO2含有不同的雜質，如氮氧化物和硫氧化物，宿主微生物細胞對于雜質的耐受將是影響生物煉制的重要因素之一。又比如，工業(yè)煙道氣的溫度與生物發(fā)酵的溫度相差極大，對煙道氣進行冷卻將付出成本，溫度耐受也將是考驗宿主微生物的指標之一。筆者認為，如何綜合利用高溫氣體的能量為生物合成提供能量甚至作為下游產品回收的能量，值得進一步探索，比如利用溫度使CO2與某物質反應生成活性物質參與生物合成并循環(huán)利用。理論上，CO2可以和環(huán)氧化物在高溫下反應生成環(huán)碳酸酯，若能通過生物或化學反應使其循環(huán)利用，則可以起到降低CO2活化能的效果。此外，可考慮生物法和物理法相結合，物理法中CO2的標準化前處理會提升生物合成的穩(wěn)定性，而且利用CO2壓縮氣建立高壓CO2生物反應器將有利于相關的酶反應平衡向合成方向移動。

固碳途徑方面，Liu等的文章對8條已知CO2生物固碳途徑（圖1）進行了系統(tǒng)的分析和闡述，包括6 條天然固碳途徑，即卡爾文循環(huán)（Calvin-Benson-Bassham cycle，CBB cycle）、Wood-Ljungdahl途徑（亦稱為還原乙酰輔酶A 途徑，reductive acetyl-CoA pathway）、二羧酸/4-羥基丁酸循環(huán)［dicarboxylate/4-hydroxybutyrate（DC/HB）cycle］、3-羥基丙酸/4-羥基丁酸循環(huán)［3-hydroxypropionate/4-hydroxybutyrate（HP/HB） cycle］、3-羥基丙酸雙循環(huán)（3-HP bicycle）和還原三羧酸（TCA）途徑（reductive TCA cycle），以及2條人工設計并已經(jīng)證實的固碳途徑，即還原甘氨酸途徑（reductive glycine pathway，rGlyP）和巴豆酰輔酶A/乙基丙二酰輔酶A/羥基丁酰輔酶 A 循環(huán)［crotonyl-coenzyme A（CoA）/ethylmalonyl-CoA/hydroxybutyryl-CoA，CETCH cycle］?？栁难h(huán)是植物及藻類固定二氧化碳的天然途徑，其關鍵酶為D-核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（D-ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，RubisCO），該酶的催化效率非常低下，每分鐘僅可催化幾個分子反應，而多年來對于該酶的改造一直都沒有很好的成功案例。二羧酸/4-羥基丁酸循環(huán)、3-羥基丙酸/4-羥基丁酸循環(huán)和3-羥基丙酸雙循環(huán)天然存在于一些自養(yǎng)微生物中，通過焦磷酸硫胺素（ThDP）活化后的羰基碳或是活潑的羰基α-碳作為受體固定CO2，裂解出乙酰輔酶A 或丙酮酸為溢出產物，這些天然途徑中固碳反應的能量消耗都比較高，難以實際應用。還原三羧酸途徑可以看作是三羧酸循環(huán)的逆向反應，可以固定2分子二氧化碳溢出1 分子乙酰輔酶A，這一途徑可以被高壓二氧化碳驅動，有望成為后續(xù)研究的重點之一。文章還介紹了3 條理論設計的CO2固碳途徑，如丙二酰CoA-草酰乙酸-乙醛酸（MOG）途徑等，通過兩步固碳反應最終溢出產物為乙醛酸；盡管從反應步數(shù)和理論能量利用效率上優(yōu)于上述的天然途徑，然而途徑中從輔酶A 到丙酮酸的固碳反應仍有較高的能量壁壘，是否可以高效地完成反應仍需實驗進一步驗證。與此相比較，CETCH 循環(huán)在人工設計時避開了輔酶A 固定CO2的反應，利用了如巴豆酰輔酶A 羧化/還原酶固定CO2消耗的NADH 來降低能量壁壘，使得多步級聯(lián)反應可以順利在體外完成，不過其體內可行性尚待進一步證實。與上述通過循環(huán)反應固定CO2不同，Wood-Ljungdahl 途徑和還原甘氨酸途徑是通過線性反應固定二氧化碳的，其對中心代謝的依賴或對其的干擾較小，我們認為從實現(xiàn)工業(yè)應用所需的高通量角度考慮，這可能是這兩條途徑的獨特優(yōu)勢?？傮w而言，目前關于二氧化碳固定反應與代謝網(wǎng)絡相互作用的研究還很有限，對于其相互作用網(wǎng)絡（包括調控網(wǎng)絡）的重構及系統(tǒng)定量分析具有重要的科學研究價值，值得關注。

Liu 等的文章分析了各條途徑的優(yōu)缺點、能量來源、底物以及產物、關鍵酶的種類以及酶活等。文章特別指出，固碳途徑實際應用中的關鍵性因素為氧氣敏感性、ATP需求、熱力學、酶動力學和CO2利用形式。氧氣敏感性與ATP 需求掛鉤并與后續(xù)產物需求密切相關，熱力學與胞內NAD（P）H/NAD（P）的比例相聯(lián)系，酶動力學決定著細胞生長的速度，受體是與CO2本身還是其碳酸氫根形式結合影響固碳的效率和條件優(yōu)化。筆者認為，不同固碳途徑主要差異之一在于對ATP 的利用效率，二氧化碳被固定后往往得到一個羧基，而對羧基的活化及后續(xù)官能團的轉化往往都需要消耗ATP。Wood-Ljungdahl 途徑、還原TCA 途徑、還原甘氨酸途徑和CETCH 循環(huán)消耗能量比較少，而卡爾文循環(huán)、DC/HB 循環(huán)、HP/HB 循環(huán)和3-HP 雙循環(huán)都額外消耗了較多的ATP（圖1）。如何避免ATP 的消耗是構建高效固碳途徑的重要因素之一，因此對固碳途徑有必要進行更深入、更基礎的研究，如核心固碳酶對小分子結合及轉運的作用機制，這是提高固碳效率及構建新型途徑的關鍵問題。固碳反應的化學本質是親核進攻反應，親核基團攜帶電子進攻CO2中顯電正性的碳原子，形成羧酸或其衍生物。由于CO2中的碳原子已經(jīng)處于八隅體的穩(wěn)定結構，具有較強的動力學惰性，因此親核進攻需要克服較高的活化能才能完成，這就需要親核試劑本身處于較為活潑的高能態(tài)且通過酶與底物的結合降低活化能，因而固碳酶往往都有精細而獨特的作用機制。

以還原甘氨酸途徑為例，其核心固碳酶是甘氨酸裂解體系（glycine cleavage system， GCS），其可以逆向利用CO2、5，10-亞甲基四氫葉酸和氨（NH3）合成甘氨酸，同時固定2 分子一碳化合物（CO2和甲酸）和1 分子氨（圖1）。甘氨酸裂解體系是由三個酶（P 蛋白、T 蛋白、L 蛋白）和一個載體H蛋白組成的多酶復合體，通過載體H蛋白上硫辛酰賴氨酸臂作為活性親核基團，接受并轉移CO2

［2］。還原甘氨酸途徑為被認為是固碳途徑中最具優(yōu)勢的途徑之一，反應步驟較少，ATP 需求較低，途徑中的酶對氧氣的耐受性比較好，對中心代謝干擾小，有較好的工業(yè)應用潛力。最近還原甘氨酸途徑在E. coli［3-6］、Saccharomyces cerevisiae［7］、Clostridium drakei［8］等微生物中獲得成功表達，使得宿主細胞可以利用甲酸和CO2合成有機酸及氨基酸等初級代謝產物。但是，若單純以甲酸和CO2作為碳源的話，細胞生長非常緩慢，難以達到對工業(yè)微生物宿主的要求［9］。其中一個主要的原因是對固碳核心機制的理解還遠遠不足：甘氨酸裂解系統(tǒng)中各組分蛋白間的相互作用關系、硫辛?；d體H 蛋白的三種形態(tài)（Hox、Hred、Hint）以及其自我保護與解除保護、硫辛酰賴氨酸臂的合成以及攜帶碳一單位移動的方式（代謝通道）、影響因素，都缺乏系統(tǒng)定量的分析，阻礙了對GCS 進行工程化的研究和優(yōu)化，遑論以合成生物學手段對其進行重新設計和改造。最近，我們對H 蛋白的自我保護與解除保護過程進行了分子動態(tài)動力學模擬，從原子水平揭示了T 蛋白誘導Hint解除保護的過程，找到了氨甲基在釋放過程中歷經(jīng)的幾個階段所對應的關鍵氨基酸殘基位點，其突變可以明顯提高或降低GCS體系的活力，為rGlyP的合理調控提供了定量的理論基礎［10］。文獻中對于Wood-Ljungdahl途徑的研究已經(jīng)有很多報道，但其中一氧化碳（CO）的結合及一眾輔酶A 依賴的固碳途徑中CO2的結合同樣有待于更深入的定量研究。對其他途徑的研究，情況也大體如此。這些生物固碳途徑在異源微生物尤其是工業(yè)微生物中的表達和應用于生物合成，還處于研究的起步階段，已顯示其困難性和局限性，需要綜合結構生物學、計算生物學、機器學習、生物化學及代謝分析等進行合成生物學多學科交叉研究。此外，基于原有CO2固定反應的新型代謝途徑改造，也非常具有科學研究和實用價值。如Bouzon等［11］向高絲氨酸代謝途徑引入了外源的轉氨酶和醛縮酶，使之可以裂解成丙酮酸和甲醛，實現(xiàn)一種新的一碳代謝循環(huán)，CO2固定與一碳代謝的相互作用關系也是未來研究值得關注的重點之一。

近日，Science雜志在線刊登了中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所名為“Cell-free chemoenzymatic starch synthesis from carbon dioxide”的文章［12］。馬延和研究員帶領的團隊經(jīng)過6 年的努力，終于在體外利用CO2通過化學-酶級聯(lián)轉換的方式成功合成了淀粉，其效率在特定的條件下可以達到植物天然合成淀粉的8.5 倍。這一開創(chuàng)性的工作為未來實現(xiàn)無土化的糧食生產提供了理論上的依據(jù)，具有重要的學術價值和潛在的巨大社會意義。該工作構建了4 個級聯(lián)轉換模塊，分別是CO2到甲醛的C1活化模塊，甲醛到3-磷酸甘油醛的C3縮合轉化模塊，3-磷酸甘油醛到6-磷酸葡萄糖的C6模塊以及最后的聚合合成淀粉的Cn模塊。其固碳的過程為CO2和氫氣在金屬催化劑的作用下合成甲醇，甲醇經(jīng)酶催化氧化得到甲醛，3 分子甲醛在甲醛裂合酶（formolase，fls）的作用下直接縮合成三碳化合物。催化甲醛縮合的fls 是2015 年由美國科學家通過計算機理性設計由苯甲醛縮合酶改造而來［13］，因其能夠直接縮合3 分子甲醛而備受關注，但其活力一直很低，導致甲醛積累產生毒性，嚴重限制了其進一步應用。馬延和團隊對fls進行了成功的改造，使其活力提高了4.7 倍，大大降低了甲醛的積累，提高了合成通量，突破了C1合成的關鍵瓶頸?？梢灶A期的是，以該工作構建的合成模塊為基礎，理論上將會有更多的化合物可以從CO2合成而來，大大推進C1生物合成的發(fā)展。在欣喜實現(xiàn)從0 到1 突破的同時，我們還應該看到未來實現(xiàn)產業(yè)化（1 到100）過程中的困難和挑戰(zhàn)所在。高達14 個酶（包括輔因子及副產物循環(huán)）參與的多酶體系體外大規(guī)模生物合成面臨著許多難題，如現(xiàn)有途徑中能量ATP 的供給來源于多聚磷酸，大規(guī)模多聚磷酸再生循環(huán)利用還不成熟；酶的用量、穩(wěn)定性及成本控制，工業(yè)化C1合成反應器，產品分離提純，都是產業(yè)化需要解決的難題。

能量利用方面，由于CO2是能源化合物燃燒和氧化代謝的最終產物，其能量是最低的，利用CO2就必須引入外部能源（圖2）。Liu 等的文章討論了依據(jù)能量來源的三類固碳方式：光自養(yǎng)合成、化學自養(yǎng)合成及電自養(yǎng)合成。光自養(yǎng)合成主要存在于植物、藻類及綠硫細菌等，通過卡爾文循環(huán)、3-羥基丙酸雙循環(huán)和還原TCA 途徑等途徑利用不同能量和數(shù)量的光子。近年來，光自養(yǎng)合成被移植到模式微生物如大腸桿菌或酵母中，但仍處于起步階段。光自養(yǎng)合成的主要限制因素在于光能的收集效率較低和微生物生長對于光密度的要求較高?；瘜W自養(yǎng)合成主要是宿主微生物可以利用給電子的化學物質來獲得能量，如氫氣、CO、甲酸及金屬礦物質等，筆者認為，還原性的金屬礦物質雖然可以作為能量供體，但來源范圍相對較窄，和CO2的大規(guī)模利用不相符。電自養(yǎng)合成則是利用電能直接或間接給宿主細胞提供能量，其中間接方式與化學自養(yǎng)合成相近，利用電能將CO2通過電化學還原為CO 或甲酸再被細胞利用。筆者認為，隨著光伏電池在世界范圍內尤其是我國的迅速發(fā)展，通過光伏電池將光能轉化為電能，之后再進行直接或間接的電自養(yǎng)合成，其整體的能量利用效率是有可能高于傳統(tǒng)的光自養(yǎng)合成的［14］，利用氫氣、CO、甲酸同時作為碳源和能源進行生物發(fā)酵有很大應用潛力，這也是Wood-Ljungdahl途徑和還原甘氨酸途徑的優(yōu)勢點之一。目前直接利用電能進行生物合成雖然受到很大關注，但其效率極低，機理還不清楚，文獻報道的微生物如巴氏梭菌（Clostridium pasteurianum）直接從電極獲得電子進行生物合成并無直接證據(jù)，很有可能是通過電極表面的電子傳遞中間體如氫氣而造成的假象［15］。從已有文獻看來，間接性通過氫氣和甲酸可能是更為現(xiàn)實的電化學CO2生物利用途徑，尤其甲酸可能是在有氧條件下更具有吸引力的能量載體。文章指出了電自養(yǎng)合成的關鍵影響因素，包括宿主的選擇、能量載體的溶解度和傳質速率、電解槽中CO2的濃度以及電極和微生物的兼容性。筆者認為，在進一步的研究中，解析電親核宿主的電子轉移機制及電親核宿主作為模式底盤細胞的工程化研究尤其值得關注。與光能比較，電可以達到更高的能量密度，用光能發(fā)電再用電能發(fā)酵是有效提高能量密度的策略。此外，電能還可以轉化自風能和核能，我國特色的特高壓輸電解決了電能的轉移問題，使得電可以作為標準高效原料參與固碳途徑。

圖2 基于CO2的生物制造：從“概念驗證”到規(guī)?；I(yè)應用Fig.2 CO2-based biomanufacturing:from proof-of-concept to large-scale industrial applications

從現(xiàn)實的工業(yè)應用角度看來，要解決單純自養(yǎng)合成中的關鍵瓶頸，例如底物的傳質限制、能量（ATP）及還原當量供應有限，細胞生長慢和產物形成率低，混合營養(yǎng)（mixotrophy）生物合成是有效方案?；旌蠣I養(yǎng)涉及共同利用一碳化合物（C1）和有機底物，作為異養(yǎng)和自養(yǎng)生物合成的結合，對其研究還相對較少。Hong和Zeng（2021）［16］介紹和討論了C1-mixotrophy 的不同途徑及其潛力，并用示例展示了它們的優(yōu)勢。混合營養(yǎng)生物合成的另一種可能性是提高對天然存在于異養(yǎng)生物中的C1固定回補反應的利用。碳代謝的重新構建可以導致強制C1固定到最終產品中，從而克服異養(yǎng)生物可實現(xiàn)的產品收率的固有限制。從中短期來看，在混合營養(yǎng)中使用C1固定模塊的天然或合成途徑代表了一種有前途且可行的生物過程策略。為此，需要對C1固定和分解代謝模塊的細胞內相互作用進行更多的定量和系統(tǒng)研究。應該更好地研究混合營養(yǎng)中可能的分解代謝物抑制或其他干擾性天然調節(jié)機制。逐步改造已建立的生產菌株是提高基于C1原料的生物合成的工業(yè)相關性的必要努力。

大規(guī)模綠色生物制造的瓶頸在于原材料的可持續(xù)性和價格、生產成本以及產品提取方面的制約。實現(xiàn)對以CO2為代表的C1原料的生物利用是解決原料來源的最佳途徑和關鍵技術，合成生物學在提高C1原料轉化率，降低成本方面大有作為。目前，第三代生物煉制技術的生產成本總的來說還太高，產品分離提取方面的工作還太少。Liu 等的文章最后從產品方面總結目前第三代生物煉制已經(jīng)可以合成多種燃料和化學品，部分已經(jīng)開始進入商業(yè)化應用階段，如利用煉鋼廢氣生產燃料乙醇，利用微藻合成脂肪酸類化合物。文章對C1生物合成的最新技術和信息進行了豐富的調查和總結，并對C1生物合成進行了展望，后續(xù)值得我們繼續(xù)思考的有：如引用文獻提到用生物質合成氫氣并發(fā)電，可以將電價降低到2 美分/千瓦時，而C1生物合成目標是利用電力和C1化合物合成生物質，很難說這樣的電力應用會更有效率，而采用原位（in situ）光或電水制氫和人造光電驅動CO2還原與生物合成相融合的技術研發(fā)，有望在這一研究方向做出具有重大突破及影響的工作。

在工業(yè)應用方面，目前絕大多數(shù)固碳途徑和產品還只是停留在“概念驗證”階段，是單一化合物從“0 到1”的突破，其技術指標KPI（key performance indicators）遠未達到規(guī)?；镏圃斓男枨螅▓D2）。對于大宗化學品的工業(yè)化生物制造而言，其產物濃度往往要求在每升上百克（約100 g/L），生產強度在2 g/（L·h）以上。除個別過程及產品外，基于CO2自養(yǎng)型的生物合成通常只能達到mg 及g/L 的濃度水平，生產強度在g/（L·d）以下。在可預見的將來，要實現(xiàn)從“0 到1”到“1 到100”的基于CO2的大規(guī)模生物制造過程，還需要工程技術的突破與原創(chuàng)的工藝技術相配合。

從工業(yè)發(fā)展的歷史來看，從基礎科學到產業(yè)的形成，工程技術的突破或原創(chuàng)的工藝技術至關重要。20世紀初，化學工業(yè)的革命性成就之一——人工合成氨——就是科學和技術結合的典范。它是由德國卡爾斯魯厄理工學院的Fritz Haber教授和巴斯夫公司的Karl Bosch博士領導的團隊合作完成的。其實，Haber 在其工藝原理的研究中所使用的條件［1020 ℃，1 bar（1 bar=105Pa）］和得到的結果（1904年前后氨的收率約0.005%）是遠遠無法工業(yè)化的，是巴斯夫公司在高壓化工過程和設備方面的突破，才催生了世界上第一座高溫高壓（約450 ℃，300 bar）化學反應器，使得這一過程在1913 年得以實現(xiàn)工業(yè)化，導致隨之的農業(yè)革命，為此他們分別于1918 年和1931 年獲得了諾貝爾化學獎。可以說，沒有這種科學與工程的緊密結合，很難產生這樣劃時代的技術！基于CO2的生物合成也需要在生物反應器方面有所創(chuàng)新，與傳統(tǒng)生物合成不同，它是體積縮小的反應過程，加之氣體溶解度低，高壓生物合成具有顯而易見的優(yōu)勢，但這方面的研究極少。最近，Steffens等［17］發(fā)現(xiàn)在細菌Hippea martima中，僅僅通過提高環(huán)境CO2的濃度或分壓（40%）即可逆轉三羧酸循環(huán)，從而實現(xiàn)從CO2和氫氣合成丙酮酸。在這一過程中，無需三羧酸循環(huán)酶體系以外的酶參與反應，只需其中的檸檬酸合成酶有較高的表達水平。這一現(xiàn)象可能存在于許多別的生物體內，主要是由熱力學決定。這為高壓CO2生物轉化提供了很好的生物學理論基礎。

以二氧化碳、甲烷、甲酸和甲醇為代表的一碳化合物（C1）的生物轉化及工業(yè)應用是合成生物學及綠色生物制造的重大機遇和挑戰(zhàn)，是助力碳中和的重大課題。研究重點在于合成生物學、過程系統(tǒng)工程、材料科學及其他基礎科學與技術的綜合應用，實現(xiàn)一碳生物轉化、光電生物技術及工程工藝過程的有機融合，最終實現(xiàn)利用大氣CO2和太陽能等綠色能源進行生物制造，為人類緩解氣候變化做出貢獻。