熊亮斌，宋璐，趙云秋，劉坤，劉勇軍，王風(fēng)清，魏東芝

（1 華東理工大學(xué)，魯華生物技術(shù)研究所，生物反應(yīng)器國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2 上海健康醫(yī)學(xué)院，協(xié)同科研中心，上海 201318）

甾體亦稱類固醇，是一類以環(huán)戊烷多氫菲為母核的有機(jī)小分子，廣泛存在于動(dòng)植物、真菌及個(gè)別細(xì)菌，其在生命體生存繁育的過(guò)程中，作用極其多樣且無(wú)可取代。天然甾體一方面是細(xì)胞膜的重要組分，如膽固醇等對(duì)于維持細(xì)胞膜流動(dòng)性和穩(wěn)定性不可或缺［1］。在生物體內(nèi)，甾體通常扮演著“激素”角色［2-4］，例如人體內(nèi)的性激素、植物體內(nèi)的生長(zhǎng)激素蕓苔素內(nèi)酯、昆蟲(chóng)體內(nèi)的蛻皮激素等。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，腎上腺皮質(zhì)激素、性激素和蛋白同化激素等，密切參與了生殖、骨骼和大腦發(fā)育、生物效應(yīng)調(diào)控及穩(wěn)態(tài)維持等生命過(guò)程［5］。因此，人們很早就發(fā)現(xiàn)其可作為一種強(qiáng)效藥物，用于消炎、避孕、抗過(guò)敏、免疫調(diào)節(jié)、內(nèi)分泌紊亂和老年性疾病等［6］。此外，甾體還具有非激素的功能，如抗病毒、抗抑郁、保護(hù)神經(jīng)、治療心腦血管疾病以及促進(jìn)骨骼發(fā)育等［7］。隨著甾體化合物愈加普遍地應(yīng)用于臨床，從而逐漸形成了一類依據(jù)結(jié)構(gòu)特征命名的藥物——甾體藥物。

目前，全球獲準(zhǔn)上市的甾體藥物約有400 余種［8-9］，其中如地塞米松和倍他米松等，在用于癌癥、重癥感染和器官移植等危重病癥時(shí)療效顯著。作為基礎(chǔ)衛(wèi)生體系的必備藥物，甾體藥物常作為戰(zhàn)略性物資進(jìn)行儲(chǔ)備［10-11］。值得一提的是，在抗擊SARS，以及目前仍在全球肆虐的新冠肺炎疫情中，甾體藥物發(fā)揮了關(guān)鍵的治療作用［12］。2020 年10 月，世界衛(wèi)生組織通過(guò)系統(tǒng)對(duì)比指出，地塞米松是對(duì)重癥患者唯一有效的藥物，可將依靠呼吸機(jī)維持生命的重癥患者死亡率降低約三分之一［13-15］。除此之外，甾體在農(nóng)業(yè)［16］、環(huán)境［17］和化工［18］等領(lǐng)域，也有著廣闊的應(yīng)用前景。由此，甾體的工業(yè)化制造是一項(xiàng)關(guān)乎國(guó)計(jì)民生的核心產(chǎn)業(yè)，對(duì)于維護(hù)人類健康、促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展等意義重大。

1 甾體制造的發(fā)展歷程

甾體藥物的發(fā)現(xiàn)和工業(yè)化生產(chǎn)，是20 世紀(jì)全球醫(yī)藥工業(yè)最成功的兩大進(jìn)展之一。從20 世紀(jì)初發(fā)現(xiàn)甾體化合物具有強(qiáng)大的藥用功效，到如今甾體制藥已成為一個(gè)龐大的產(chǎn)業(yè)，其工業(yè)化過(guò)程大致經(jīng)歷了以下4個(gè)階段：

（1）初創(chuàng)階段（近代—20 世紀(jì)40 年代） 受動(dòng)物腺體提取物可用于內(nèi)分泌、心血管等疾病治療的啟發(fā)，人們猜測(cè)其內(nèi)容物可能具有強(qiáng)大的生理和藥理活性。由此，先后從動(dòng)物組織中分離得到了雌酚酮、雌二醇、雌三醇、睪丸素、皮質(zhì)酮等甾體激素成分［19］。此階段，3 位德國(guó)科學(xué)家Wieland、Windaus 和Butenandt 分別完成了膽酸、維生素D 以及雌甾酮、雄甾酮、孕甾酮等性激素活性成分的鑒定，從而分別獲得1927 年、1928 年和1939 年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)［20］。然而由于動(dòng)物腺體的成分復(fù)雜、甾體含量極低，加之收集比較困難，導(dǎo)致此階段的甾體藥物不僅供應(yīng)種類有限，并且價(jià)格極其高昂。例如，當(dāng)時(shí)從動(dòng)物腺體提取的黃體酮，單價(jià)曾高達(dá)1000 美元/g，遠(yuǎn)超黃金價(jià)格。

（2）起步階段（20 世紀(jì)40—60 年代） 天然甾體來(lái)源有限、價(jià)格高昂，嚴(yán)重限制了甾體藥物的臨床應(yīng)用普及。隨著化學(xué)制藥工業(yè)的興起，人們開(kāi)始嘗試通過(guò)化學(xué)合成生產(chǎn)此類物質(zhì)。1940 年，賓夕法尼亞州立大學(xué)的Russel Marker 發(fā)現(xiàn)薯蕷屬植物中存在一種甾體皂苷元（俗稱薯蕷皂素），以此為原料經(jīng)三步降解即可生成孕烯酮醇，再經(jīng)氧化又可高效合成黃體酮（Marker三步降解）［21］。隨后，Marker 又在墨西哥找到了富含薯蕷皂素的小穗花薯蕷，解決了原料來(lái)源問(wèn)題。此后利用薯蕷皂素為原料，經(jīng)Marker 降解生產(chǎn)不同的甾體藥物得到了蓬勃發(fā)展，最終形成了沿用至今的“薯蕷皂素-雙烯”半合成體系（圖1）。本階段，黃體酮等甾體藥物的價(jià)格大幅下降，有力推動(dòng)了甾體激素藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用。

（3）成熟階段（20 世紀(jì)60—80 年代） 盡管薯蕷皂素資源分布廣泛，但含量高且適合開(kāi)發(fā)的品種卻十分有限。早期，甾體制藥工業(yè)依賴于墨西哥供應(yīng)原料，甾體制藥技術(shù)則被歐美壟斷，隨后，三個(gè)標(biāo)志性事件的發(fā)生，奠定了延續(xù)至今的甾體制藥工業(yè)格局。①1958 年，黃鳴龍教授以我國(guó)國(guó)產(chǎn)的薯蕷皂素為原料，開(kāi)創(chuàng)了國(guó)際領(lǐng)先的可的松七步法合成，由此推動(dòng)了腎上腺皮質(zhì)激素類藥物生產(chǎn)技術(shù)的進(jìn)步，地塞米松等先后在我國(guó)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)［22］。②1960 年，美國(guó) FDA 批準(zhǔn)了一種由異炔諾酮和炔雌醇復(fù)配而成的口服避孕藥，極大刺激了社會(huì)對(duì)甾體藥物的需求［20］。在黃鳴龍教授的領(lǐng)導(dǎo)下，我國(guó)也在60年代陸續(xù)實(shí)現(xiàn)甲地孕酮、炔諾酮和氯地孕酮等口服避孕藥的合成，因此，黃鳴龍教授被譽(yù)為“中國(guó)甾體口服避孕藥之父”［22］。③隨著甾體制藥工業(yè)的快速發(fā)展，對(duì)原料的需求日益增加，而對(duì)野生薯蕷皂素資源的野蠻開(kāi)采導(dǎo)致其日趨枯竭。為解決此問(wèn)題，我國(guó)于1984年首先實(shí)現(xiàn)了對(duì)野生薯蕷屬植物黃姜的“野轉(zhuǎn)家”人工栽培，高峰時(shí)期僅我國(guó)的種植面積即高達(dá)4000 萬(wàn)畝，年產(chǎn)薯蕷皂素約5000 t，可滿足全球的生產(chǎn)需求。至此，甾體制藥工業(yè)徹底擺脫了對(duì)野生資源的依賴，產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨于健康平衡，基于Marker 降解的“薯蕷皂素-雙烯”工業(yè)體系也隨之走向成熟（圖1）［23］。

圖1 基于Marker降解的甾體半合成工藝體系［24］Fig.1 The semi-synthesis of steroids based on the Marker degradation technology

（4）轉(zhuǎn)型升級(jí)階段（20世紀(jì)90年代至今） 隨著野生薯蕷皂素資源趨于枯竭，人們還嘗試進(jìn)行了替代性資源的開(kāi)發(fā)工作。最成功的當(dāng)屬以植物甾醇為原料，通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)雄甾-4-烯-3，17-二酮（AD）、雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮（ADD）、9α-羥基雄甾-4-烯-3，17-二酮（9α-OHAD）、21-羥基-23，24-二降膽-4-烯-3-酮（HBC）等中間體，再經(jīng)化學(xué)修飾生產(chǎn)目標(biāo)甾體藥物工藝的建立（圖2）。相較之前的“薯蕷皂素-雙烯”體系，依賴微生物轉(zhuǎn)化的新體系具有原料來(lái)源穩(wěn)定、反應(yīng)路線短、收率高、生產(chǎn)成本低且更環(huán)保等顯著優(yōu)勢(shì)。實(shí)際上早在1944 年，即已發(fā)現(xiàn)微生物具有轉(zhuǎn)化甾醇生成有用代謝產(chǎn)物的能力，然而直到80 年代末，該技術(shù)才在德國(guó)先令制藥公司等得到應(yīng)用，我國(guó)則是在2010 年左右取得突破，并迅速完成了對(duì)“薯蕷皂素-雙烯”體系的取代。在此期間，基于合成生物學(xué)開(kāi)發(fā)甾體藥物的微生物全合成技術(shù)也已開(kāi)始萌芽 。 在 1998 年 和 2003 年 ，Pompon 及 Dumas 課 題組通過(guò)在酵母引入異源基因，改變內(nèi)源的麥角甾醇合成路線，實(shí)現(xiàn)了黃體酮和氫化可的松等甾體激素的微生物全合成［25-26］。雖然從產(chǎn)量來(lái)看，這種策略還僅僅是一種創(chuàng)新性的概念，但此工作有力證實(shí)了利用人工生物合成甾體藥物的可行性，自此甾體制藥技術(shù)迎來(lái)一個(gè)全新階段。

圖2 基于甾醇微生物轉(zhuǎn)化的甾體半合成工藝體系［24］Fig.2 The semi-synthesis of steroids based on the microbial transformation of sterols

2 甾體生物催化轉(zhuǎn)化酶的挖掘及改造

甾體大都具有相同的母核結(jié)構(gòu)，取代基的位置和構(gòu)型，是決定藥物功效的關(guān)鍵。例如，氫化可的松與表氫化可的松僅存在11 位羥基構(gòu)型的不同，但前者可與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合發(fā)揮功能，后者則無(wú)法正常結(jié)合此類受體［27］，導(dǎo)致二者的藥用價(jià)值差異巨大。在甾體藥物的生產(chǎn)中，通常需對(duì)母核的部分惰性位點(diǎn)進(jìn)行特定取代基的構(gòu)建。鑒于化學(xué)合成法存在選擇性差、反應(yīng)復(fù)雜、產(chǎn)物得率低等問(wèn)題，常需借助生物催化轉(zhuǎn)化，以實(shí)現(xiàn)功能化修飾反應(yīng)。當(dāng)前，甾體制藥工業(yè)具有重要應(yīng)用價(jià)值的生物催化反應(yīng)主要有三類，分別是立體選擇性羥基化、區(qū)域選擇性脫氫和酮基不對(duì)稱還原［28-30］。由于均為氧化還原反應(yīng)，涉及復(fù)雜的電子傳遞系統(tǒng)，異源高效表達(dá)難度較大，因此長(zhǎng)久以來(lái)工業(yè)多采用微生物活細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方式，實(shí)現(xiàn)上述的功能化反應(yīng)。近幾年，隨著基因組挖礦和編輯技術(shù)的成熟，高催化活性和高選擇性的新工程菌得以不斷開(kāi)發(fā)，具有反應(yīng)時(shí)間短、副產(chǎn)物少、產(chǎn)品易精制等突出優(yōu)勢(shì)的酶法催化，也得到越來(lái)越多的應(yīng)用。

2.1 甾體羥化酶的挖掘及改造

通過(guò)向母核引入特定構(gòu)型的羥基化基團(tuán)，可賦予甾體不同的應(yīng)用價(jià)值，其中尤以11β、11α、9α、7β位的羥基化產(chǎn)物價(jià)值最為突出。甾體羥基化多由P450 單氧化酶催化，該酶多以跨膜或細(xì)胞膜錨定的形式存在，需要復(fù)雜的電子傳遞系統(tǒng)［31］，因此很難在微生物細(xì)胞高活性表達(dá)［32］。由于絲狀真菌具有復(fù)雜的次級(jí)代謝，并且通常含百余個(gè)甚至幾百個(gè)P450 氧化酶，因此工業(yè)上常使用絲狀真菌來(lái)執(zhí)行甾體的羥基化反應(yīng)。

11β位羥基是氫化可的松、地塞米松、倍他米松等糖皮質(zhì)激素藥物的關(guān)鍵基團(tuán)，可由絲狀真菌新月彎孢霉（Curvularia lunata，有性態(tài)Cochliobolus lunatus）或藍(lán)色犁頭霉（Absidia coerulea）催化實(shí)現(xiàn)，然而此步驟的整體效率低，立體選擇性也較差。2019 年，Beatriz Galán 等首次在C. lunatus中鑒定了一個(gè)11β-羥基化酶CYP103168 及其還原酶CPR64795，并成功在谷氨酸棒桿菌實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，使副產(chǎn)物的生成顯著降低，產(chǎn)品得率相應(yīng)得到提升［33］。隨后，張學(xué)禮課題組從犁頭霉A.orchidis獲得了另一種11β-羥基化酶CYP5311B2 及其氧化還原酶。由于該酶在催化11β-羥化的過(guò)程中，會(huì)伴隨生成20%的11α-羥化副產(chǎn)物，通過(guò)蛋白質(zhì)工程改造，使突變體的活性提升了約3倍，結(jié)合對(duì)菌體的優(yōu)化改造，最終獲得一株可高效轉(zhuǎn)化11-脫氧皮質(zhì)醇，生成氫化可的松的基因工程菌，培養(yǎng)48 h的產(chǎn)量達(dá)1060 mg/L，最高產(chǎn)率為667 mg（/L·d）［34］。

11α位羥基是依普利酮、脫氧孕烯等藥物的重要基團(tuán)［30，35］，通常由黑根霉（Rhizopus nigricans）、赭曲霉（Aspergillus ochraceus）等絲狀真菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化而來(lái)。針對(duì)該酶的挖掘，天津科技大學(xué)路福平教授課題組做出了突出貢獻(xiàn)，近幾年陸續(xù)完成了對(duì)工業(yè)用11α羥化菌株關(guān)鍵酶的鑒定。2016年，該課題組在黑根霉TCCC 41047中篩選鑒定出3個(gè)可以轉(zhuǎn)化16，17α-環(huán)氧孕酮的11α羥化酶［36］。2017年，又從藍(lán)色犁頭霉AS3.65 中鑒定出新的11α羥化酶CYP5311B1，然而表征結(jié)果顯示，該酶僅限于催化 16，17α-環(huán)氧孕酮底物［37］。隨后在 2020 年，該課題組進(jìn)一步從赭曲霉TCCC41060 分離得到了兩個(gè)受甾體化合物強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)的P450 酶CYP68L8和CYP68J5，其中CYP68J5能特異性地針對(duì)16，17α-環(huán)氧孕酮進(jìn)行11α羥化［38］，這一系列的工作為改良現(xiàn)用工業(yè)菌種，或開(kāi)發(fā)高效的11α羥化酶基因工程菌奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)（表1）。

表1 甾體化合物羥基化反應(yīng)的類型Tab.1 Types of steroidal hydroxylation

借助9α羥基化酶的催化在9α位引入氟等鹵素，可用于制造地塞米松、倍他米松等高端甾體。以此為基礎(chǔ)，結(jié)合化學(xué)轉(zhuǎn)化引入9（11）雙鍵，或在 11 位引入酮基、11β或 11α羥基等，通?？色@得更理想的上羥收率。9α羥化酶多源于分枝桿菌、紅球菌等放線菌，該酶是一種雙組分ⅠA 型單加氧酶，包括Rieske 型單加氧酶（KshA）和鐵氧還蛋白還原酶（KshB）。由于KshA 發(fā)揮功能需與還原伴侶KshB共表達(dá)，導(dǎo)致9α羥化酶系的異源活性表達(dá)難度較大。為解決此問(wèn)題，天津科技大學(xué)路福平教授課題組在大腸桿菌中構(gòu)建了一種高活性的人工9α羥化酶系統(tǒng)。通過(guò)重構(gòu)NADH 的再生系統(tǒng)，利用來(lái)自普提達(dá)假單胞菌F117 的甲苯2，3-氧化還原酶TDO-R 代替KshB，與一個(gè)Rieske［2Fe-2S］鐵氧還蛋白TDO-F的融合表達(dá)后，使電子轉(zhuǎn)移效率提高176.3%，在以雄甾-4-烯-3，17-二酮為底物時(shí)，最終可產(chǎn)5.24 g/L的9-OHAD［36］。

7β羥化產(chǎn)物及其衍生物，具有良好的神經(jīng)保護(hù)和抗炎活性，可用于治療慢性神經(jīng)元損傷等。然而微生物對(duì)7β羥化的選擇性較低，同時(shí)因副產(chǎn)物較多等，工業(yè)酶的開(kāi)發(fā)難度較大。2020 年，通過(guò)對(duì)巨大芽孢桿菌源的單加氧酶P450-BM3 活性中心15 個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變，湖北大學(xué)李愛(ài)濤課題組篩選獲得了一種對(duì)C19甾體分子具有高區(qū)域和立體選擇性的突變體［39］。此外，7β羥基也是膽酸類甾體藥物的關(guān)鍵基團(tuán)，2021年，德國(guó)的Bornscheuer教授課題組篩選獲得了一種可以廉價(jià)的石膽酸為底物進(jìn)行7β羥基化直接生成熊去氧膽酸的鏈霉菌源CYP107D1，隨后通過(guò)半理性設(shè)計(jì)，成功獲得了區(qū)域和立體選擇性接近完美的突變體，為熊去氧膽酸等膽酸類藥物合成路線的革新提供了可能［40］。

除在甾核上的羥化反應(yīng)之外，在甾體側(cè)鏈或角甲基等位置的羥化反應(yīng)，也具有極重要的工業(yè)價(jià)值。例如，維生素D 是一類甾體型維生素，其側(cè)鏈25 位羥基基團(tuán)是發(fā)揮功能的關(guān)鍵，而在已鑒定的25-羥化酶中，來(lái)自Streptomyces griseolus的CYP105A1和放線菌Pseudonocardia autotrophica的CYP107-Vdh 均具有良好的催化表現(xiàn)［41］。2013 年 ，Tamura 課題組通過(guò)蛋白質(zhì)工程獲得了一個(gè)Vdh 的突變體VdhT107A，隨后通過(guò)在Rhodococcus erythropolis的異源表達(dá)、NADH 重生和細(xì)胞壁合成抑制等優(yōu)化手段，最終獲得一種可在2 h 內(nèi)實(shí)現(xiàn)催化轉(zhuǎn)化573 mg/L 產(chǎn)物的高效催化劑［42］。又如甾體的 19 位羥基化反應(yīng)，可用于米非司酮、炔諾酮和雌激素等藥物的生產(chǎn)。2018 年，朱敦明課題組報(bào)道了一種來(lái)源于Thanatephorus cucumerisNBRC 6298 的P450 酶STH10，通過(guò)在畢赤酵母的異源重構(gòu)表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)脫氧可的松C19 位和C11 位的羥基化反應(yīng)，這也是首次報(bào)道能夠在C19 位甲基上羥的P450 酶［43］。隨后，武漢大學(xué)瞿旭東課題組利用此酶進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化重建，通過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化及底物的結(jié)構(gòu)修飾，實(shí)現(xiàn)了利用可托多松高選擇性催化合成19-羥化可托多松，由此出發(fā)借助化學(xué)合成獲得了多種19-羥甾體藥物［44］，為開(kāi)發(fā)合成甾體19位羥基化的高效細(xì)胞工廠提供了新的候選途徑。

2.2 甾體脫氫酶的挖掘及改造

雙鍵是大部分甾體藥物的必需官能團(tuán)，如4（5）雙鍵、5（6）雙鍵、1（2）雙鍵、7（8）雙鍵和9（11）雙鍵等。在甾體的半合成中，選用薯蕷皂素或甾醇為原料，原因之一在于這類分子具有5（6）位雙鍵，而此雙鍵很容易易位到4（5）位，可省去在 4（5）或 5（6）位引入雙鍵的復(fù)雜步驟。工業(yè)上常借助生物催化實(shí)現(xiàn)向甾核引入雙鍵的反應(yīng)，其中以C1，2位的轉(zhuǎn)化脫氫最為重要。在自然界，以分枝桿菌和節(jié)桿菌為代表的放線菌等，均可催化實(shí)現(xiàn)C1，2位脫氫，但此類微生物對(duì)甾體的降解能力較強(qiáng)，因此只有個(gè)別喪失此能力的菌株才可用于工業(yè)生產(chǎn)。此過(guò)程中，發(fā)揮核心催化功能的是一種FAD依賴型黃素酶，即3-酮基甾體-Δ1-脫氫酶（KstD）。近些年，隨著對(duì)KstD的不斷挖掘和異源高效表達(dá)研究，采用酶催化實(shí)現(xiàn)脫氫正在逐步替代微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化的脫氫技術(shù)。2018年，天津科技大學(xué)路福平教授課題組對(duì)來(lái)自簡(jiǎn)單節(jié)桿菌的KstD3進(jìn)行分子對(duì)接和定點(diǎn)飽和突變，有效擴(kuò)大了酶與底物的結(jié)合口袋，減輕了空間干擾，使突變體對(duì)AD等底物的催化效率提高近3倍，而采用酶催化和靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方式可分別獲得71%和95%的ADD得率，相比對(duì)照菌則分別提高了33%和20%［45］。同年，張保國(guó)課題組從新金分枝桿菌DSM 1381 中篩選了3種KstD，其中酶活力最高的KstD2工程菌可在15 h 內(nèi)以高達(dá)99%的轉(zhuǎn)化率將8 g/L AD 轉(zhuǎn)化為ADD［46］。2020年，王敏教授課題組從簡(jiǎn)單節(jié)桿菌中鑒定出了通用性更高的KstD5，該酶不僅底物譜寬，還可催化多種重要的甾體藥物，同時(shí)具有良好的有機(jī)溶劑耐受性，因此可通過(guò)在反應(yīng)體系添加有機(jī)溶劑助溶甾體底物，大幅提高底物的投料濃度［47］。

此外，7（8）位雙鍵是蛻皮激素等甾體的重要基團(tuán)，也是維生素D3前體7-脫氫膽固醇的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。然而，對(duì)甾體進(jìn)行7（8）脫氫十分困難，往往需經(jīng)過(guò)曲折復(fù)雜的化學(xué)轉(zhuǎn)化才能實(shí)現(xiàn)。2011 年，Yoshiyama-Yanagawa 等［48］在解析蛻皮激素合成路線的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了一種在無(wú)脊椎動(dòng)物高度保守的Rieske 型7（8）位脫氫酶，該酶在昆蟲(chóng)中被稱為Neverland，在線蟲(chóng)中被稱為DAF-36，在還原伴侶蛋白的作用下，Neverland/DAF-36（簡(jiǎn)稱NVD）可直接催化膽固醇生成7-脫氫膽固醇，這與脊椎動(dòng)物體內(nèi)的合成路線完全不同，這意味著如能在微生物中實(shí)現(xiàn)該酶的異源表達(dá)，將極大地提高維生素D3等相關(guān)化合物的生產(chǎn)效率。近幾年，路福平教授課題組通過(guò)深入的異源表達(dá)研究，于2019年在昆蟲(chóng)卵巢細(xì)胞Sf9 中成功實(shí)現(xiàn)果蠅來(lái)源NVD 的異源表達(dá)。此后，為實(shí)現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用目的，該課題組又測(cè)試了利用大腸桿菌異源活性表達(dá)NVD 的可能性，然而由于該酶發(fā)揮功能所需的還原伴侶蛋白尚未得到鑒定，NVD在大腸桿菌的表達(dá)主要以包涵體形式存在。隨后，通過(guò)在N末端嘗試添加麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）可溶性標(biāo)簽，該課題組最終成功獲得了純度為95.4%的可溶性NVD蛋白［49］。2020年，通過(guò)對(duì)融合蛋白特性的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，使用MBP標(biāo)簽可增加NVD的熱穩(wěn)定性［50］，由此為推動(dòng)NVD重組工程菌的開(kāi)發(fā)奠定了重要基礎(chǔ)。

2.3 甾體酮基還原酶的挖掘

在甾體制藥體系中，常常還會(huì)涉及在甾核C3、C11、C17 等位置進(jìn)行酮基與羥基的轉(zhuǎn)換反應(yīng)。由于甾核羥基具有特定的立體構(gòu)型，因此酮基與羥基間的轉(zhuǎn)換往往需保持高度的區(qū)域和立體選擇性。在自然界中分布廣泛的酮基還原酶，多為短鏈脫氫酶/還原酶（SDR）、中鏈脫氫酶/還原酶（MDR）或醛糖酮還原酶（AKR）蛋白超家族成員，可專一性催化實(shí)現(xiàn)甾體的酮基立體還原。 1956 年Marcus 等最早介紹了一種睪丸梭菌來(lái)源的3α-羥基甾體脫氫酶/羰基還原，該酶不僅具有氧化還原3α-羥基甾體底物的功能，而且可催化一些非甾體醛或非甾體酮的還原反應(yīng)［51］。由于酮基還原酶在醫(yī)藥中間體生產(chǎn)領(lǐng)域具有廣泛而深入的研究基礎(chǔ)，在此不再過(guò)多贅述。

3 微生物代謝轉(zhuǎn)化甾醇機(jī)制的解析及轉(zhuǎn)化細(xì)胞工廠的開(kāi)發(fā)

甾醇等甾體分子在動(dòng)植物和真菌中普遍存在，而大多數(shù)原核生物因缺乏角鯊烯單加氧酶和角鯊烯環(huán)化酶等關(guān)鍵酶，無(wú)法自主合成甾醇分子。然而有意思的是，自然界卻存在許多可徹底降解甾醇，為自體生長(zhǎng)和生理代謝提供碳源和能量的原核微生物，如芽孢桿菌屬（Bacillus）、短桿菌屬（Brevibacterium）、細(xì)桿菌屬（Microbacterium）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、 諾卡氏菌屬（Nocardia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、紅球菌屬（Rhodococcus）以及鏈霉菌屬（Streptomyces）等［11，52-60］，其中以分枝桿菌屬和紅球菌屬的甾醇代謝能力最強(qiáng)?；诖耍ㄟ^(guò)對(duì)微生物甾醇降解途徑的代謝工程改造，可獲得一系列具有積累甾體醫(yī)藥中間體能力的微生物細(xì)胞工廠（圖2、圖3），如C19型甾體［61-62］、C22型甾體［63］和A環(huán)降解物等。從這些分子出發(fā)，結(jié)合化學(xué)或微生物修飾衍生，可完全代替基于Marker 降解的“薯蕷皂素-雙烯”工業(yè)體系，用于腎上腺皮質(zhì)激素、孕激素、性激素等幾乎所有臨床用甾體激素藥物的生產(chǎn)。

3.1 甾醇微生物代謝途徑解析與途徑工程改造

微生物對(duì)甾醇的降解途徑可分為兩類，即好氧代謝和厭氧代謝［64］。由于厭氧代謝效率低，工業(yè)常利用好氧代謝轉(zhuǎn)化甾醇生產(chǎn)甾體醫(yī)藥中間體。2007 年，van der Geize 等［65］在紅球菌和結(jié)核分枝桿菌中首次發(fā)現(xiàn)了甾醇降解基因簇。該基因簇由223個(gè)基因組成，其間散布著51個(gè)與降解高度相關(guān)的基因，這為理解微生物對(duì)甾醇的氧化代謝機(jī)制，以及通過(guò)理性的代謝工程改造開(kāi)發(fā)高效轉(zhuǎn)化甾醇的細(xì)胞工廠鋪平了道路［66-67］。此外，研究表明在分枝桿菌中除上述基因簇之外，還有一些小的基因簇同樣也參與了甾醇的降解，這些小簇通常負(fù)責(zé)編碼限速步驟的同工酶，可對(duì)這些步驟起強(qiáng)化作用。由于這些同工酶在微生物間差別較大，從而可賦予菌株差異明顯的降解能力［61，68］。以膽固醇為例，微生物對(duì)甾醇的降解，大致分為母核裂解和 C17 位側(cè)鏈的β-氧化［66-67］，這兩部分混雜進(jìn)行［69-70］，為了更清晰地闡述甾醇的代謝機(jī)制，我們將按圖3這種簡(jiǎn)化方式進(jìn)行描述。

3.1.1 甾體母核降解途徑及改造

微生物對(duì)甾醇的降解，始于膽固醇氧化酶（ChO）催化3 位的β羥基生成膽甾-4-烯-3-酮，此為甾醇分解代謝的限速步驟［71-73］。隨后，在KstD和3-甾酮-9α-羥基化酶Ksh 的共同作用下，甾體母核B 環(huán)開(kāi)裂，所產(chǎn)生的開(kāi)裂物最終被降解為丙酰CoA 和丙酸鹽等短鏈分子［66，74］。在不干擾 C17 位側(cè)鏈降解的前提下，對(duì)母核降解途徑的改造，可獲得兩類重要的甾體醫(yī)藥中間體（圖3）：C19型甾體，如 AD、ADD、9α-OHAD 等；A 環(huán)降解物，如谷內(nèi)酯（HIL）等。C19型甾體是甾醇微生物轉(zhuǎn)化體系的主要部分，可用于腎上腺皮質(zhì)激素和性激素的生產(chǎn)。為開(kāi)發(fā)高效的C19型甾體微生物細(xì)胞工廠，通常需集中改造母核降解途徑中由ChO、KstD 和Ksh催化的三步關(guān)鍵反應(yīng)［75］。

圖3 甾醇的微生物分解途徑Fig.3 The catabolic pathway of sterols in microorganisms

ChO 是一類界面酶，通常定位于細(xì)胞膜，需FAD 輔基的參與才能發(fā)揮催化活性，根據(jù)二者結(jié)合方式的不同，ChO 可分為FAD 非共價(jià)結(jié)合型（Ⅰ型）［76-78］和 FAD 共價(jià)結(jié)合型（Ⅱ型）。2013 年，通過(guò)挖掘Mycolicibacterium neoaurumATCC 25795的基因組信息，兩個(gè)分別定位于胞內(nèi)和胞外的ChO 同工酶ChoM1 和ChoM2 被發(fā)現(xiàn)，這種定位模式使位于細(xì)胞外膜的甾醇可被高效地氧化為膽甾-4-烯-3-酮，實(shí)現(xiàn)從不溶性甾醇顆粒上的快速解離；此外，已進(jìn)入膜內(nèi)的甾醇分子，在內(nèi)膜ChO 的催化下迅速脫離細(xì)胞膜的束縛，可更快地進(jìn)入胞質(zhì)啟動(dòng)后續(xù)的氧化降解。因此，ChO 的活性是決定甾醇轉(zhuǎn)化的第一個(gè)限速因素。在構(gòu)建AD 等生產(chǎn)菌種時(shí)，通過(guò)代謝強(qiáng)化ChoM1 和ChoM2 的表達(dá)，可使工程菌的生產(chǎn)能力提高約50%［68］。值得一提的是，在分枝桿菌等微生物中，除了ChO 之外，3β-羥基甾體脫氫酶（3β-HSD）也能氧化甾醇生成膽甾-4-烯-3-酮，并且在結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌等微生物中，3β-HSD 甚至可取代ChO 發(fā)揮主要的催化功能［71-73］。

KstD 和Ksh 則是決定C19型甾體能否生成和產(chǎn)物選擇性的關(guān)鍵酶，C19型甾體具有完整的母核結(jié)構(gòu)，為阻止母核發(fā)生降解，KstD 和Ksh 不可共存，至少需選擇性地阻斷其中之一的活性，同時(shí)還需根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物有針對(duì)地強(qiáng)化KstD 或Ksh 活性，以減少副產(chǎn)物的生成。具體來(lái)說(shuō)，為獲得特定的C19型甾體產(chǎn)物，需對(duì)KstD和Ksh進(jìn)行如下改造：①對(duì)于AD 生產(chǎn)菌種的開(kāi)發(fā)，需同時(shí)失活KstD、Ksh 及其同工酶；②對(duì)于9α-OHAD 生產(chǎn)菌種的開(kāi)發(fā)，則需在保留Ksh 的同時(shí)，使KstD 及其同工酶徹底失活，此外根據(jù)副產(chǎn)物AD 的積累情況，還需強(qiáng)化Ksh的表達(dá)，以保證AD能夠完全轉(zhuǎn)化為9α-OHAD；③而對(duì)于ADD 生產(chǎn)菌種的開(kāi)發(fā)，則需在保留KstD的同時(shí)，使Ksh及其同工酶徹底失活，根據(jù)副產(chǎn)物AD 的積累情況，視情況強(qiáng)化Ksh 的表達(dá)，以保證AD能完全轉(zhuǎn)化為ADD［62］。

在甾醇降解過(guò)程中，KstD 是催化3-酮-4-烯類甾體生成 3-酮-1，4-二烯型甾體的關(guān)鍵酶［46，61］。通常微生物源KstD 會(huì)有3 個(gè)以上的同工酶，這種特征很可能賦予菌株作用于多種底物，以及更強(qiáng)的甾醇降解能力［79-81］。然而此情況也導(dǎo)致在開(kāi)發(fā)AD和9α-OHAD 等工程菌的過(guò)程中，需挖掘并采用同源重組等方法敲除所有的KstD 功能酶基因，以降低副產(chǎn)物的生成，確保整體收率［61］。Ksh 是負(fù)責(zé)催化3-酮基生成9α-羥基化產(chǎn)物的關(guān)鍵酶，可單獨(dú)用于甾體藥物的催化轉(zhuǎn)化［82］。Ksh 酶活性的不足也是目前9α-OHAD 生產(chǎn)菌存在的重要問(wèn)題之一，會(huì)導(dǎo)致AD 等副產(chǎn)物的生成。與KstD 類似，Ksh在微生物中也會(huì)存在多達(dá)2～5 個(gè)同工酶［83］，因此在涉及AD 和ADD 等菌株的開(kāi)發(fā)中，需對(duì)其進(jìn)行徹底敲除；而針對(duì)9α-OHAD 生產(chǎn)菌種的開(kāi)發(fā)，則需強(qiáng)化多種KshA 酶的活性。谷內(nèi)酯是在母核降解過(guò)程的另外一種重要代謝產(chǎn)物，可用于米菲司酮和雌激素等19-去甲甾體藥物的合成。該物質(zhì)由母核A 環(huán)降解后轉(zhuǎn)化生成，失活?；?CoA 脫氫酶FadE30-33 等，可阻斷其下游的降解步驟（圖3），實(shí)現(xiàn)谷內(nèi)酯的積累生產(chǎn)［84］。

3.1.2 甾醇側(cè)鏈的降解途徑及改造

在好氧微生物中，甾醇C17側(cè)鏈的氧化降解始于 P450 酶對(duì)膽甾-3-酮-4-烯 C17 側(cè)鏈末端 C26 或C27 位的羥基化和連續(xù)氧化，在生成膽甾-4-烯-3-酮-26-羧酸后，經(jīng)?；?CoA連接酶（如FadD19［85］）的催化酯化，生成膽甾-4-烯-3-酮-26-羧酸CoA，隨后進(jìn)入一種類似于脂肪酸β-氧化降解的過(guò)程［66］。在厭氧微生物中，甾醇側(cè)鏈的代謝則明顯不同，其降解始于C25 位的羥化［86］，再轉(zhuǎn)移為 C26 位羥基，隨后才以一種類似于好氧代謝的過(guò)程進(jìn)行［69］。

以谷甾醇為例（圖3），除側(cè)鍵末端的氧化反應(yīng)外，主要由?；?CoA 脫氫、烯酰-CoA 水合、β-羥酰-CoA 脫氫、β-酮酰-CoA 硫解等β-氧化反應(yīng)組成，經(jīng)四輪β-氧化，共產(chǎn)生2 分子丙酰CoA 和2 分子乙酰CoA［87］。此外，由于受母核結(jié)構(gòu)的影響，甾醇側(cè)鏈β-氧化最后一輪的特異性要顯著高于前幾輪［88-89］。美國(guó)石溪大學(xué)的Sampson課題組對(duì)催化此過(guò)程的關(guān)鍵酶鑒定和表征做出了重要貢獻(xiàn)［90-92］，由該課題組首先鑒定的操縱子igr，包含了多個(gè)影響側(cè)鏈最后一輪β-氧化的重要基因，為更好地理解最后一輪β-氧化機(jī)制奠定了基礎(chǔ)［93-94］。甾醇C17位側(cè)鏈經(jīng)完全降解生成C17位酮基，該步驟是通過(guò)阻斷母核降解生產(chǎn)C19型甾體和A 環(huán)降解物等有用產(chǎn)物的重要前提，也是活化后續(xù)降解的關(guān)鍵步驟。在分枝桿菌和紅球菌中此步反應(yīng)主要由CYP142 和CYP125 催化完成，二者在側(cè)鏈末端上羥后均能繼續(xù)氧化生成膽甾-4-烯-3-酮-26-羧酸［95-96］，其中以CYP125 更為關(guān)鍵，在該酶發(fā)生功能缺失時(shí)，菌體可經(jīng)膽甾-4-烯-3-酮誘導(dǎo)，上調(diào)CYP142 的表達(dá)，以提高相應(yīng)的催化能力［96］。鑒于CYP125對(duì)側(cè)鏈降解的重要性，通過(guò)強(qiáng)化表達(dá)可提高轉(zhuǎn)化甾醇生產(chǎn)有用代謝產(chǎn)物的效率［97］。

在阻斷母核降解的同時(shí)，針對(duì)側(cè)鏈降解基因的改造，也可獲得一系列有用的側(cè)鏈不完全降解產(chǎn)物，如 4-HBC、1，4-HBC 等 C22型甾體［63］，可用于孕激素、腎上腺皮質(zhì)激素等甾體藥物的生產(chǎn)。2016 年，在對(duì)C22型甾體轉(zhuǎn)化機(jī)制的研究中，一個(gè)具有雙功能的短鏈脫氫酶Hsd4A得以鑒定，該酶既具有17β-羥基甾體脫氫酶活性，可轉(zhuǎn)化AD 生成睪酮，又具有β-羥酰-CoA脫氫酶功能，是側(cè)鏈降解第3輪的關(guān)鍵酶（圖3）。隨后，通過(guò)失活該酶，有效阻斷了側(cè)鏈的β-氧化，使甾醇降解被導(dǎo)向“HBC 代謝支路”。先前，HBC 是源于AD 等生產(chǎn)過(guò)程的一種副產(chǎn)物，純化難度大，生產(chǎn)成本高。通過(guò)對(duì)Hsd4A、KstD以及Ksh 基因的組合改造，可分別獲得積累4-HBC、1，4-HBC和9α-OHHBC等代謝產(chǎn)物的工程菌株，有效用于黃體酮等甾體藥物的生產(chǎn)過(guò)程。

3.2 甾醇轉(zhuǎn)化微生物細(xì)胞工廠的優(yōu)化改造

在自然界，分枝桿菌等之所以能有效降解甾醇，一方面是因其內(nèi)含甾醇降解途徑，另一方面則是得益于菌株的特殊被膜結(jié)構(gòu)［91-92，98-99］。該結(jié)構(gòu)的核心是一層由分枝酰-阿拉伯半乳聚糖-肽聚糖復(fù)合體組成的不對(duì)稱共價(jià)結(jié)構(gòu)，在此之外還分布著一層極性的脂質(zhì)被膜，包括海藻糖單霉菌酸酯（TMM）、海藻糖雙霉菌酸酯（TDM）及多聚糖等［92］。這種結(jié)構(gòu)既賦予了細(xì)胞表面的親脂性，有利于對(duì)疏水甾體顆粒的捕捉黏附，但同時(shí)也造就了細(xì)胞被膜的高度致密性，不利于甾醇分子向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，特別是在AD 等產(chǎn)物過(guò)量積累的情況下，分枝桿菌等常通過(guò)調(diào)整細(xì)胞壁的厚度增加致密性，導(dǎo)致甾醇向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)效率降低［6，100］。鑒于在甾醇轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，通過(guò)添加細(xì)胞被膜合成相關(guān)的抑制劑，可顯著提高細(xì)胞對(duì)甾醇的攝取效率［52，101-103］。受此啟發(fā)，針對(duì)性優(yōu)化改造細(xì)胞被膜結(jié)構(gòu)，可開(kāi)發(fā)高效攝取轉(zhuǎn)化甾醇的微生物細(xì)胞工廠。研究表明，膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MmpL3 參與了分枝桿菌細(xì)胞被膜結(jié)構(gòu)的組裝合成［92，104］，通過(guò)敲除對(duì)應(yīng)的編碼基因mmpL3，可明顯提高細(xì)胞的通透性，增加菌體對(duì)甾醇底物的轉(zhuǎn)化速率［97］。隨后的多項(xiàng)研究表明，破壞分枝菌酸合成的關(guān)鍵基因kasB［8］，以及阿拉伯半乳聚糖合成的關(guān)鍵基因embC［105］，均可在一定程度上抑制細(xì)胞被膜的合成，有效增強(qiáng)分枝桿菌對(duì)甾醇類底物的轉(zhuǎn)化效率，9α-OHAD的產(chǎn)率可增加11.2%～34.5%。

甾醇代謝機(jī)制十分復(fù)雜，涉及中心代謝、細(xì)胞被膜合成和能量代謝等多方面的適應(yīng)性變化，通過(guò)多組學(xué)的系統(tǒng)比對(duì)，更清晰地了解細(xì)胞的生理代謝變化，可為優(yōu)化甾醇轉(zhuǎn)化細(xì)胞工廠的性能提供更多備選靶點(diǎn)［83，106-107］?；谵D(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，SigD 因子的轉(zhuǎn)錄與分枝桿菌代謝甾醇的過(guò)程具有一定的相關(guān)性，刪除該基因可顯著提升9α-OHAD 等中間體的生產(chǎn)效率［108］。隨后，通過(guò)失活SigD 級(jí)聯(lián)調(diào)控通路上游的調(diào)控因子Rip1，獲得了更明顯的產(chǎn)量提升效果［109］。經(jīng)進(jìn)一步的分析顯示，此類轉(zhuǎn)錄因子的失活，影響了菌體被膜合成及代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，鑒于其對(duì)甾醇轉(zhuǎn)化的促進(jìn)可能是一種綜合性的表現(xiàn)，相關(guān)的代謝機(jī)制仍有待深入研究。此外，由于甾醇降解是一個(gè)產(chǎn)能過(guò)程，以谷甾醇為底物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)9α-OHAD 為例，1 mol 的谷甾醇可產(chǎn)生約 10 mol 的 FADH2和 16～18 mol 的NADH［74］。天津科技大學(xué)王敏教授課題組經(jīng)研究證實(shí)，NAD+/NADH 的比率是影響分枝桿菌轉(zhuǎn)化甾醇的重要因素，通過(guò)表達(dá)強(qiáng)化NADH 氧化酶等輔因子的手段提高NAD+/NADH比率，維持細(xì)胞的氧化還原平衡，可大幅提高菌體對(duì)甾醇的轉(zhuǎn)化［32］。此外，由于甾醇代謝所涉及的輔因子氧化再生等過(guò)程，會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基ROS，造成嚴(yán)重的細(xì)胞毒性，降低菌體細(xì)胞的生存能力，進(jìn)而嚴(yán)重制約甾醇向甾體藥物中間體的轉(zhuǎn)化。為此，通過(guò)組合強(qiáng)化過(guò)氧化氫酶、分支硫醇和麥角硫因這三種抗氧化劑的表達(dá)，有效猝滅甾醇降解過(guò)程所產(chǎn)生的ROS、維持胞內(nèi)ROS 水平的穩(wěn)定，最終使分枝桿菌細(xì)胞的存活率提高54.2%，甾醇轉(zhuǎn)化生成4-HBC的能力提高達(dá)47.5%［110］。

綜上，在甾醇途徑改造工程的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)代謝過(guò)程中細(xì)胞生理的綜合改造，可使微生物細(xì)胞工廠具備更好的應(yīng)用性能。雖然從多角度出發(fā)的優(yōu)化方案，已取得了一定的效果，但這些改造方案的集成和協(xié)同機(jī)制復(fù)雜，有待進(jìn)行更深入的探索研究，以期能進(jìn)一步提高工業(yè)菌種的生產(chǎn)性能。

4 微生物從頭合成甾體人工路線的創(chuàng)建

當(dāng)前，普遍使用的甾體藥物，多以天然甾體分子為骨架，經(jīng)人工半合成而來(lái)。因此，如能以微生物為底盤，全合成相關(guān)甾體型天然產(chǎn)物，或?qū)崿F(xiàn)進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化衍生，則很可能顛覆當(dāng)前復(fù)雜的生產(chǎn)體系，真正實(shí)現(xiàn)甾體藥物的綠色生物制造。相對(duì)于半合成體系，甾體的生物合成有以下優(yōu)勢(shì)：①無(wú)需從動(dòng)植物提取甾體分子，可徹底解決原料來(lái)源不足等問(wèn)題；②減少重金屬催化劑和易燃易爆有機(jī)溶劑的使用，降低反應(yīng)過(guò)程的危險(xiǎn)性和污染物排放；③簡(jiǎn)化甾體的半合成路線，減少生產(chǎn)步驟，縮短生產(chǎn)周期。以氫化可的松的生產(chǎn)為例，如采用半合成模式，從原料到產(chǎn)品一般需8～10步的轉(zhuǎn)化步驟，而經(jīng)人工體系理論上只需1步即可實(shí)現(xiàn)氫化可的松的合成［26］。

4.1 甾體的生物合成途徑

在自然界，天然甾體的合成路線大致相同。以三萜合成途徑為基礎(chǔ)，利用環(huán)氧角鯊烯為關(guān)鍵前體合成甾醇類化合物（圖4），再經(jīng)氧化、糖化等后修飾，最終生成各種甾型天然產(chǎn)物。在動(dòng)物體內(nèi)，甾體由環(huán)氧角鯊烯出發(fā)經(jīng)羊毛甾醇、酵母甾醇等中間體轉(zhuǎn)化合成，并在不同的器官根據(jù)機(jī)體需要，合成各種內(nèi)分泌甾體激素（圖5）。在植物體內(nèi)，往往也能經(jīng)此途徑合成甾醇，并進(jìn)一步生成皂苷等甾體次生代謝產(chǎn)物，但除此之外，在植物體內(nèi)還有一條更為重要的植物甾醇合成途徑，即從環(huán)氧角鯊烯出發(fā)，經(jīng)環(huán)阿屯醇生成菜油甾醇、谷甾醇和豆甾醇等多種植物甾醇，再生成蕓苔素內(nèi)酯等植物激素。在真核微生物中，從環(huán)氧角鯊烯出發(fā)，可通過(guò)類似于膽固醇的代謝途徑生成麥角甾醇，再經(jīng)轉(zhuǎn)化修飾生成一系列的甾型次級(jí)代謝產(chǎn)物［111-112］。具體而言，甾體的生物合成途徑可分為三個(gè)模塊：角鯊烯合成模塊、甾醇合成模塊和甾體轉(zhuǎn)化修飾模塊。

圖4 不同生物體內(nèi)的甾醇合成路線Fig.4 The biosynthetic pathway of sterols in organisms

圖5 甾體激素生物合成途徑Fig.5 The biosynthesis pathway of steroidal hormones

（1）角鯊烯合成模塊［圖4（a）］［113-114］角鯊烯是一個(gè)典型的三萜化合物，其合成過(guò)程可細(xì)分為兩部分：①異戊烯焦磷酸（IPP，C5）的合成。IPP 是萜類化合物的基本單元，可從乙酰輔酶A 出發(fā)由甲羥戊酸途徑（MVA 途徑）合成，或從丙酮酸和甘油醛-3-磷酸出發(fā)，通過(guò)5-磷酸-D-脫氫木酮糖/2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸酯途徑（DOXP/MEP途徑）合成。②從IPP 至角鯊烯（C30）的合成。IPP在異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶（IDI）的催化下，可轉(zhuǎn)化為同分異構(gòu)體甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP），二者經(jīng)法尼基焦磷酸合成酶（FPPS）的催化縮合，可依次形成牻牛兒基焦磷酸（GPP，C10）和法尼基焦磷酸（FPP，C15），隨后2 分子FPP 在鯊烯合成酶的催化下，形成1分子的鯊烯。近期，利用釀酒酵母為底盤，本課題組采用過(guò)氧化物酶體區(qū)室化策略，結(jié)合多酶組裝表達(dá)技術(shù)，成功構(gòu)建了一株可高產(chǎn)角鯊烯的酵母平臺(tái)，在5 L 生物反應(yīng)器分批補(bǔ)料的培養(yǎng)條件下，角鯊烯的最高產(chǎn)量可達(dá)11.0 g/L［115］。進(jìn)一步地，通過(guò)結(jié)合線粒體區(qū)室化策略，目前的產(chǎn)量已突破25 g/L，干細(xì)胞的角鯊烯含量最高達(dá)50%（結(jié)果尚未發(fā)表）。

（2）甾醇合成代謝模塊［圖（4b）～（e）］［116-118］從角鯊烯出發(fā)，經(jīng)角鯊烯環(huán)氧化酶催化生成2，3-環(huán)氧角鯊烯，再經(jīng)環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶催化，生成三萜甾醇化合物（C30）（一般來(lái)說(shuō)，在動(dòng)物和真菌中為羊毛甾醇，經(jīng)修飾轉(zhuǎn)化為膽固醇或麥角甾醇；在植物中為環(huán)阿屯醇，再經(jīng)衍生為植物甾醇）。由于麥角甾醇、膽固醇和植物甾醇等，在結(jié)構(gòu)和合成路線上的高度相似性，因此可利用含有麥角甾醇合成路線的酵母等真核底盤，對(duì)甾醇合成模塊進(jìn)行改造重建，從而獲得可生產(chǎn)一系列甾醇分子的基因工程菌。2011年，Riezman等在釀酒酵母中通過(guò)功能性失活C24位甲基化和C22位脫氫的關(guān)鍵酶ERG5 和ERG6，徹底阻斷麥角甾醇的合成，隨后通過(guò)引入C7位還原酶基因DHCR7，獲得了可穩(wěn)定生產(chǎn)菜油甾醇的基因工程菌株。進(jìn)一步通過(guò)繼續(xù)引入DHCR24 基因，該課題組成功創(chuàng)建了可穩(wěn)定合成膽固醇的工程化釀酒酵母［119］。

（3）甾體轉(zhuǎn)化修飾模塊 從特定的甾醇分子出發(fā)，經(jīng)不同生物差異化的修飾衍生，從而產(chǎn)生了天然甾體的多樣性［120］。例如，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，膽固醇可由CYP11A1經(jīng)三步連續(xù)的羥化氧化，使C20—C22 鍵發(fā)生斷裂形成孕烯醇酮［121］，此時(shí)如再經(jīng)3β-HSD 的催化，即可生成黃體酮，而孕烯醇酮和黃體酮被運(yùn)輸至不同腺體后，經(jīng)C11β、C17α羥基化、C17β酮基還原、C21 側(cè)鏈裂解等，又可形成不同類型的甾體激素（圖5）。顯而易見(jiàn)的是，這些修飾酶的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值巨大，如能高效地實(shí)現(xiàn)異源活性表達(dá)，則可有效用于甾體藥物的轉(zhuǎn)化。另外，如利用此類酶組裝級(jí)聯(lián)反應(yīng)，對(duì)接甾醇合成模塊，即可構(gòu)建直接合成甾體藥物的細(xì)胞工廠。值得一提的是，在動(dòng)物體內(nèi)，從膽固醇出發(fā)除能轉(zhuǎn)化合成甾體激素外，還有兩類重要的非激素甾體功能分子，即維生素D3和膽酸。維生素D3是由膽固醇經(jīng)7位脫氫生成7-脫氫膽固醇再經(jīng)紫外線照射轉(zhuǎn)化生成，需經(jīng)25-羥化酶（CYP2R1或CYO27A1） 以及 1α-羥化酶 （CYP27B1） 的催化，生成其活性形式，即25-羥維生素D3和1，25-二羥維生素 D3［122-123］。 此 外， 維 生素 D3經(jīng)CYP11A1 的催化，可啟動(dòng)另一條非典型的活化途徑［123-124］，即在 7-脫氫膽固醇和維生素 D3的 C20 或C22 位發(fā)生羥基化，再經(jīng)CYP27A1、CYP24A1、CYP2R1 或CYP3A4 的選擇性羥基化，從而形成結(jié)構(gòu)多樣的活性維生素D3衍生物［125-126］。膽酸的合成也是由P450 酶所主導(dǎo)，在CYP7B1、CYP8B1和CYP27A1 等的聯(lián)合作用下，最終生成膽酸及其衍生物等［127-128］。

基于上述三個(gè)模塊的特點(diǎn)，利用微生物底盤創(chuàng)建甾體藥物合成細(xì)胞工廠的思路即已非常清晰。①選擇合適的底盤。盡管“角鯊烯合成模塊”普遍存在，但“甾醇合成代謝模塊”通常只存在于酵母和絲狀真菌等微生物中，加之合成的甾體分子為真核來(lái)源，因此酵母或絲狀真菌等均可作為候選底盤。②途徑的整體設(shè)計(jì)與改造。需根據(jù)目標(biāo)甾體分子，選擇具體的甾醇前體，通過(guò)對(duì)底盤菌麥角甾醇途徑的改造，創(chuàng)建可合成特定甾醇分子的工程菌。③構(gòu)建“甾體轉(zhuǎn)化修飾模塊”。該模塊所涉及的P450 氧化酶等，通常難以在微生物細(xì)胞高效表達(dá)，這也是限制甾體微生物全合成細(xì)胞工廠開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵瓶頸之一。針對(duì)此問(wèn)題，除需加強(qiáng)對(duì)已知?jiǎng)又参镌碢450 酶的工程化表達(dá)和優(yōu)化改造，提出更行之有效的改造策略和方法之外，還可通過(guò)加強(qiáng)對(duì)微生物源P450 酶元件的挖掘，以取代這些難以表達(dá)的真核來(lái)源P450酶。

4.2 甾體微生物全合成的進(jìn)展

隨著合成生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，甾體的微生物全合成研究已經(jīng)取得了多項(xiàng)重要進(jìn)展。由于釀酒酵母自體擁有麥角甾醇的合成能力，因此可作為從頭全合成甾體的良好底盤。早在1998 年，Pompon 課題組即利用該菌，通過(guò)破壞甾醇C22 位脫氫酶ERG5，阻斷麥角甾醇的合成，同時(shí)利用引入的擬南芥源C7-脫氫酶、牛源膽固醇側(cè)鏈降解酶系統(tǒng)（P450scc、ADR和ADX）等，成功實(shí)現(xiàn)了孕烯醇酮的微生物全合成。隨后，借助人源3β-HSD酶的催化，又進(jìn)一步創(chuàng)建了從簡(jiǎn)單碳源到孕酮的人工從頭合成途徑，開(kāi)創(chuàng)了利用微生物直接合成甾體藥物活性成分的研究［25］。2003 年，在Sanofi-Aventis 公司的資助下，Dumas 等［26］通過(guò)向酵母引入多達(dá)十余個(gè)基因，改變內(nèi)源的麥角甾醇合成路線，實(shí)現(xiàn)了氫化可的松的人工微生物全合成。這兩項(xiàng)工作有力證實(shí)了利用微生物從頭全合成甾體藥物的可行性，開(kāi)啟了甾體綠色生物制造研究的新局面。此后十余年，利用人工生物系統(tǒng)陸續(xù)在萜類［129-130］、 糖 苷 類［131-132］、黃酮類［133-134］及有機(jī)酸［135-136］等天然產(chǎn)物的合成方面取得了一系列的重要成果，但在利用微生物一步發(fā)酵合成甾體藥物（中間體）等領(lǐng)域，突破性進(jìn)展卻十分有限，一直未見(jiàn)成功的產(chǎn)業(yè)化案例，關(guān)鍵原因可能在于甾體的合成路線過(guò)于復(fù)雜，且涉及多步難以有效異源表達(dá)重建的P450 酶氧化反應(yīng)。值得一提的是，2018年，Corinne等基于Dumas的工作，對(duì)P450scc、ADX、P450c11 和3β-HSD 等功能基因進(jìn)行了多拷貝基因整合表達(dá)，成功將氫化可的松的產(chǎn)量提升到了120 mg/L［137］，這也是目前歐洲生產(chǎn)氫化可的松的主要路線。

在國(guó)內(nèi)，天津大學(xué)的元英進(jìn)院士課題組，在利用甾醇途徑向下游延伸合成的領(lǐng)域深耕數(shù)年，也取得了多項(xiàng)重要進(jìn)展。2015 年，通過(guò)阻斷內(nèi)源性麥角固醇合成途徑，引入異源24-脫氫膽固醇還原酶DHCR24，該課題組首次在釀酒酵母實(shí)現(xiàn)了從葡萄糖到7-DHC（合成維生素D3的重要前體）的從頭合成［138］。隨后，在先行失活C22 位脫氫酶ERG5 的前提下，通過(guò)挖掘鑒定非洲爪蟾等不同來(lái)源高活性DHCR7，該課題組利用解脂耶氏酵母底盤建立了菜油甾醇的合成途徑，在以葵花籽油作為碳源時(shí)，目標(biāo)產(chǎn)物菜油甾醇的最高產(chǎn)量可達(dá)（453±24.7）mg/L［139］。緊接著，通過(guò)進(jìn)一步強(qiáng)化上游途徑的過(guò)氧物酶體酰基CoA 氧化酶2，同時(shí)以具有更高活性的斑馬魚(yú)來(lái)源DHCR7 替換先前使用的爪蟾DHCR7，使得菜油甾醇的產(chǎn)量被提升至942 mg/L［140］。2019 年，利用上述平臺(tái)菌株為基礎(chǔ)，通過(guò)引入由CYP11A1、皮質(zhì)鐵氧還蛋白Adx以及相應(yīng)的皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶AdR 組成一個(gè)細(xì)胞色素P450 側(cè)鏈裂解酶系統(tǒng)，同時(shí)結(jié)合元器件的適配優(yōu)化等策略，元英進(jìn)院士課題組成功創(chuàng)建了一株孕烯醇酮產(chǎn)量為78.0 mg/L 的解脂耶氏酵母工程菌［141］。除此之外，通過(guò)失活釀酒酵母的ERG5，使底盤菌積累麥角素-5，7-二烯醇-3β-醇，由此產(chǎn)物出發(fā)，借助引入的C24位還原酶DHCR24的催化，鄭裕國(guó)院士課題組也于2018 年實(shí)現(xiàn)了7-DHC 的微生物全合成［142］。由此可見(jiàn)，近些年國(guó)內(nèi)在甾體活性成分的人工微生物全合成領(lǐng)域，也取得了一系列具有投產(chǎn)潛力的重要進(jìn)展。然而相比之下，歐美發(fā)達(dá)國(guó)家早在20 多年前即已成功構(gòu)建了孕酮、氫化可的松等代表性甾體藥物的微生物全合成平臺(tái)。因此，作為甾體藥物工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)，亟待加強(qiáng)針對(duì)甾體藥物人工微生物菌株創(chuàng)建的基礎(chǔ)研發(fā)投入，以確保未來(lái)我國(guó)在此領(lǐng)域激烈的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)中不落下風(fēng)。

除甾體激素藥物之外，利用微生物合成高附加值的稀有甾體型植物天然產(chǎn)物也備受關(guān)注，并取得了十分理想的效果。例如，傳統(tǒng)中藥人參和三七的主要活性成分皂苷Rg1、Rh2及衍生物CK等，具有活血化瘀、預(yù)防心血管疾病和抗腫瘤等藥用活性。從人參或三七提取此類皂苷，不僅周期長(zhǎng)，產(chǎn)物收率低，提取過(guò)程還伴隨產(chǎn)生大量的化學(xué)試劑污染等。鑒于此，利用微生物全合成生產(chǎn)甾體皂苷成為一個(gè)研究熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)多個(gè)課題組在此領(lǐng)域做出了突出貢獻(xiàn)。例如，天津工業(yè)生物技術(shù)研究所的張學(xué)禮團(tuán)隊(duì)在釀酒酵母成功合成了原人參二醇、原人參三醇等高端人參皂苷化合物［143］。天津大學(xué)盧文玉團(tuán)隊(duì)利用解脂耶氏酵母為底盤，從木糖出發(fā)合成了原人參二醇等［144］。中國(guó)科學(xué)院分子植物研究中心的周志華課題組，則在甾體皂苷糖苷化修飾基因的挖掘和細(xì)胞工廠的優(yōu)化改造等方面，開(kāi)展了更為系統(tǒng)而深入的研究，最近該課題組以前期構(gòu)建的原人參二醇工程酵母為底盤，結(jié)合酶工程和代謝工程優(yōu)化了人參來(lái)源的細(xì)胞色素P450 酶CYP716A53v2 的活性和表達(dá)水平，獲得一株產(chǎn)量可達(dá)5 g/L 以上原人參三醇的酵母細(xì)胞工廠［145］。隨后，該課題組通過(guò)引入從人參和三七中鑒定表征的多功能UGT-糖苷轉(zhuǎn)移酶，以及擬南芥的UDP-木糖生物合成途徑，將PPT 高效轉(zhuǎn)化為皂苷Rg1、Ng1和Ng2，產(chǎn)量分別達(dá)1.95 g/L、1.62 g/L和1.25 g/L［146］。此外，基于對(duì)UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶UGTPg1 的鑒定結(jié)果，該課題組于2014 年實(shí)現(xiàn)了從葡萄糖到CK 的人工途徑的構(gòu)建［147］。為有效提高CK 的產(chǎn)量，通過(guò)優(yōu)化UGTPg1 的表達(dá)水平，提高UDP-葡萄糖的生物合成，減少UDP-葡萄糖的消耗等，最終使CK 的產(chǎn)量達(dá)到了5.74 g/L。這些富有成效的工作，使這些稀有甾體皂苷的產(chǎn)量達(dá)到了世界領(lǐng)先水平，為通過(guò)微生物全合成法生產(chǎn)稀有的甾體皂苷奠定了基礎(chǔ)［148］。

5 總結(jié)與展望

甾體藥物的工業(yè)化生產(chǎn)，事關(guān)民眾健康等眾多國(guó)計(jì)民生的保障需求。然而因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和精巧的構(gòu)型，導(dǎo)致甾體的生產(chǎn)高度依賴于步驟煩瑣、污染嚴(yán)重的半合成技術(shù)，此為甾體制造成本高居不下的重要原因之一。自1952 年發(fā)現(xiàn)微生物轉(zhuǎn)化可用于甾體的區(qū)域和立體選擇性羥基化起，經(jīng)過(guò)近70 年的發(fā)展，生物催化轉(zhuǎn)化已在甾體制造業(yè)建立了無(wú)法取代的地位。然而現(xiàn)行的“甾醇微生物轉(zhuǎn)化”半合成工藝，仍嚴(yán)重依賴于化學(xué)合成，鑒于甾體工業(yè)的目標(biāo)產(chǎn)物大多為自然界已有的天然產(chǎn)物，因此從理論上說(shuō)，有望升級(jí)建立一種以生物轉(zhuǎn)化為主、化學(xué)反應(yīng)為輔的綠色制造新體系。最近十年，“甾醇微生物轉(zhuǎn)化”工藝已迅猛顛覆了老舊的“薯蕷皂素-雙烯”體系，下一個(gè)十年，或許“甾體微生物全合成”技術(shù)又將再次革新甾體制藥行業(yè)。值得警惕的是，賽諾菲等制藥公司早在20 世紀(jì)90 年代即已開(kāi)始圍繞“甾體的微生物全合成”布局相關(guān)知識(shí)產(chǎn)權(quán)，目前已擁有數(shù)十項(xiàng)專利，如US5635369、US6117649、US10400261B2等。我國(guó)在此領(lǐng)域才剛剛起步，大多仍處于跟跑階段，因此需更加積極地應(yīng)對(duì)，以防少數(shù)公司在掌握關(guān)鍵技術(shù)后，對(duì)全球甾體制造業(yè)進(jìn)行新一輪的控制，使我國(guó)再現(xiàn)“卡脖子”難題。

目前，國(guó)外對(duì)甾體人工生物合成的研究，多以酵母為底盤，通過(guò)改變麥角甾醇途徑生成膽固醇或植物甾醇，再引入動(dòng)植物源的元器件“仿建天然甾體的合成途徑”。由于元器件數(shù)量有限，且缺乏行之有效的異源重構(gòu)技術(shù)等原因，進(jìn)展異常緩慢。例如，賽諾菲公司針對(duì)氫化可的松的從頭生物合成，雖已歷經(jīng)20 多年的持續(xù)研究，最高產(chǎn)量也僅達(dá)到110 mg/L（US10400261B2）。作為甾體制造業(yè)的主體，清晰的轉(zhuǎn)化路線和酶催化機(jī)制，可為開(kāi)發(fā)“甾體全合成”的微生物細(xì)胞工廠提供清晰的藍(lán)圖和功能元件。然而有關(guān)研究至今尚未取得重大突破，其中的關(guān)鍵瓶頸在于“甾體轉(zhuǎn)化修飾模塊”的創(chuàng)建難度較大，包括用于甾體激素轉(zhuǎn)化的酶元件，如P450氧化酶等，多來(lái)源于動(dòng)物，數(shù)量有限，缺乏其他來(lái)源的有效替代品，難以在人工細(xì)胞內(nèi)表達(dá)、組裝和優(yōu)化。針對(duì)這些問(wèn)題，如需推動(dòng)“甾體微生物全合成”技術(shù)的快速發(fā)展，可考慮從以下三點(diǎn)開(kāi)展系統(tǒng)研究：

①甾體轉(zhuǎn)化修飾途徑的解析和元器件挖掘。通過(guò)從植物、微生物和無(wú)脊椎動(dòng)物等來(lái)源，分析鑒定更多樣化的甾體轉(zhuǎn)化元器件及代謝新途徑，改造關(guān)鍵元器件的結(jié)構(gòu)與功能，揭示并利用甾體轉(zhuǎn)化的新機(jī)制，為甾體微生物從頭合成的設(shè)計(jì)與創(chuàng)建提供更多選擇。

②甾體生物合成模塊的設(shè)計(jì)與改造。依據(jù)“一條主途徑多產(chǎn)品衍生”的設(shè)計(jì)原則，在合適的底盤依次構(gòu)建“角鯊烯合成”“甾醇合成”“甾體修飾轉(zhuǎn)化”三大模塊，開(kāi)發(fā)不同甾體骨架的微生物細(xì)胞工廠。隨后，根據(jù)應(yīng)用需求，構(gòu)建即插即用型“甾體轉(zhuǎn)化衍生”模塊，實(shí)現(xiàn)多樣化的甾體生產(chǎn)。同時(shí)，還應(yīng)設(shè)計(jì)構(gòu)建與甾體合成相匹配的“能量供給”“代謝流分配”“代謝調(diào)控”等輔助模塊。此外，鑒于甾體合成過(guò)程的混雜性強(qiáng)、缺乏快速檢測(cè)評(píng)估的手段等，在途徑創(chuàng)建過(guò)程中，應(yīng)重視多酶組裝、傳感器實(shí)時(shí)監(jiān)控、代謝狀態(tài)精準(zhǔn)分析、轉(zhuǎn)錄開(kāi)關(guān)精細(xì)調(diào)控等使能技術(shù)，以保障各功能模塊的高效適配組裝。

③甾體從頭合成細(xì)胞工廠的創(chuàng)建與優(yōu)化。酵母和米曲霉等具有較強(qiáng)的麥角甾醇合成能力，操作工具較成熟，可優(yōu)先作為底盤菌株使用。然而麥角甾醇具有重要的生理功能，其在胞內(nèi)的合成代謝往往處于一種穩(wěn)態(tài)平衡，難以過(guò)量積累。針對(duì)此，需通過(guò)深入研究相關(guān)的調(diào)控機(jī)制，探索突破穩(wěn)態(tài)調(diào)控的有效方法。另外，在“甾醇微生物轉(zhuǎn)化”體系使用的分枝桿菌內(nèi)含萜類合成途徑，且具有強(qiáng)大的甾體耐受性和轉(zhuǎn)化修飾能力，一旦基于該菌構(gòu)建“甾醇合成模塊”的研究取得突破，即可貫通甾體的生物合成通路。

總體來(lái)說(shuō)，甾體藥物的合成路線較長(zhǎng)，調(diào)控關(guān)系復(fù)雜，表達(dá)重構(gòu)難度較大，需更多有效的異源表達(dá)新方式及策略支撐。通過(guò)創(chuàng)建甾體的微生物合成模式，采用一步發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)從葡萄糖等廉價(jià)原料直接合成活性的甾體分子，這必將簡(jiǎn)化生產(chǎn)過(guò)程、大幅降低三廢排放，真正實(shí)現(xiàn)甾體的高端綠色制造。當(dāng)下，國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)加劇，如何通過(guò)體系革新，大幅降低生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)甾體的綠色制造，是行業(yè)面臨的共同挑戰(zhàn)，也是決定企業(yè)和國(guó)家競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的關(guān)鍵所在。我國(guó)甾體制藥從業(yè)人員應(yīng)居安思危，致力于開(kāi)發(fā)具有特色的“甾體微生物全合成”技術(shù)，以充分保障我國(guó)甾體制藥行業(yè)健康發(fā)展。