汪慶卓，宋萍，黃和

（南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210046）

據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)，2019年我國(guó)原油和石油對(duì)外依存度雙破70%，大豆進(jìn)口量更是突破8000 萬(wàn)噸。為避免因國(guó)際環(huán)境變化（如疫情、戰(zhàn)爭(zhēng)或其他事件爆發(fā)）導(dǎo)致外部資源進(jìn)口遭到封鎖，我國(guó)必須建設(shè)、補(bǔ)充和完善能源、糧油供給的新方式。生物質(zhì)是眾多可再生資源（如太陽(yáng)能、風(fēng)能、水能、地?zé)崮艿龋┲形ㄒ灰活愐蕴紴榛A(chǔ)的實(shí)物性資源，因此以豐富、廉價(jià)的生物質(zhì)原料（如木質(zhì)纖維素）替代化石原料生產(chǎn)燃料、大宗化學(xué)品、食用油脂和功能性油脂等在保障國(guó)家能源安全、糧食安全方面意義重大［1］。

相比于植物和動(dòng)物來(lái)源油脂，微生物來(lái)源的油脂因具有生產(chǎn)周期短，場(chǎng)地靈活、占地少，不受氣候變化影響，易于大規(guī)模生產(chǎn)，原料來(lái)源豐富、成本低廉，易于菌種改良與基因改造，定向生產(chǎn)特定產(chǎn)物等優(yōu)勢(shì)倍受重視［2］。然而，如何獲取生產(chǎn)效率高且魯棒性強(qiáng)的微生物油脂細(xì)胞工廠，面臨著使能工具有限、油脂產(chǎn)量不高、油脂組分難以控制等問(wèn)題［3］。幸運(yùn)的是，合成生物學(xué)的迅猛發(fā)展有力促進(jìn)了油脂細(xì)胞工廠的開(kāi)發(fā)。產(chǎn)油微生物研究在遺傳操作工具創(chuàng)制、代謝途徑改造以及高附加值產(chǎn)品開(kāi)發(fā)等方面不斷獲得突破。本文中，筆者聚焦關(guān)鍵技術(shù)瓶頸，闡述了合成生物技術(shù)驅(qū)動(dòng)天然的真核油脂細(xì)胞工廠開(kāi)發(fā)的研究進(jìn)展，力圖為后續(xù)研究提供借鑒。

1 微生物合成油脂的途徑和底盤菌株

細(xì)菌、酵母、霉菌、微藻等多種微生物能利用木質(zhì)纖維素類、糖類、淀粉類、甘油甚至一碳化合物等合成脂肪酸［4-6］。如圖1 所示，微生物攝取各種生物質(zhì)后，在產(chǎn)油酵母線粒體及胞質(zhì)內(nèi)經(jīng)各種途徑合成的乙酰CoA，進(jìn)一步羧化生成丙二酸單酰CoA；然后乙酰CoA 和丙二酸單酰CoA 經(jīng)脂肪酸合成酶合成丙二酸單酰ACP，接著再與丙二酸單酰CoA 反應(yīng)生成新的脂酰ACP。每與丙二酸單酰CoA 反應(yīng)一次，脂酰ACP 的碳鏈延長(zhǎng)2 個(gè)碳原子；各種脂酰ACP 經(jīng)硫酯酶催化合成不同鏈長(zhǎng)的脂肪酸。當(dāng)脂肪酸有過(guò)量積累時(shí)，被快速轉(zhuǎn)化為脂酰CoA，然后經(jīng)過(guò)β-氧化途徑分解成乙酰CoA［2，7-8］。在產(chǎn)油微生物中，脂肪酸通常會(huì)以甘油三酯（triacylglycerol， TAG）的形式儲(chǔ)存在胞內(nèi)，形成脂滴。

圖1 微生物合成脂肪酸及其衍生物的途徑Fig.1 Pathways of microbial synthesis of fatty acids and derivatives

在胞內(nèi)，脂肪酸也可以被轉(zhuǎn)化為各種高附加值產(chǎn)品。當(dāng)有內(nèi)源的或者異源引入的去飽和酶系存在時(shí)，會(huì)生成各種類型的不飽和脂肪酸，包括ω-6系列的γ-亞麻酸（γ-linoleic acid）和花生四烯酸（arachidonic acid，ARA），以及ω-3系列的α-亞油酸（linoleic acid）、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid， EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexenoic acid，DHA）等［9-11］。雙鍵的位置和數(shù)目不同使得不同脂肪酸具有不同的生理功能，多種脂肪酸在醫(yī)學(xué)和功能性食品領(lǐng)域備受青睞。脂肪酸還可以被內(nèi)源的或者異源引入的酰基轉(zhuǎn)移酶（ACP transferase）催化酯化，與甲醇或者乙醇合成脂肪酸甲酯（fatty acid methyl ester，F(xiàn)AME）或者脂肪酸乙酯（fatty acid ethyl esters，F(xiàn)AEE），從而實(shí)現(xiàn)生物柴油的體內(nèi)合成［6］。另外，有報(bào)道稱在大腸桿菌或者釀酒酵母中引入脂酰輔酶A 還原酶（fatty acyl-coenzyme a reductase）或脂酰ACP 還原酶（fatty acyl-ACP reductase）基因和醛脫羰基酶（aldehyde decarbonylase）基因時(shí)，細(xì)胞能合成脂肪醇、脂肪烷烴、烯烴類化合物［12-13］，而它們正是汽油、柴油、航空煤油的主要成分。

表1列舉了主流的幾種微生物生產(chǎn)油脂的研究進(jìn)展?？梢钥闯?，目前比較主流的幾種油脂合成微生物細(xì)胞工廠包括大腸桿菌（Escherichia coli）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、 圓 紅 冬 孢 酵 母 （Rhodosporidium toruloides）、斯達(dá)氏油脂酵母（Lipomyces starkeyi）和裂殖壺菌（Schizochytriumsp.）等。

表1 近幾年主流的微生物油脂細(xì)胞工廠的研究進(jìn)展Tab.1 Research progress of microbial lipid cell factories in recent years

大腸桿菌和釀酒酵母在自然條件下并不會(huì)生成油脂，但是因?yàn)槠浠虿僮骱透脑毂容^容易，因此也常被用于生產(chǎn)油脂。大腸桿菌在生產(chǎn)脂肪酸及其衍生物等領(lǐng)域（例如脂肪酸、激素和烷烴） 均取得了重要進(jìn)展［17-19］。但是，大腸桿菌對(duì)木質(zhì)纖維素水解液中的抑制物的耐受性不足，這可能會(huì)限制其碳源范圍。釀酒酵母通過(guò)合成生物學(xué)改造，在脂肪酸和烷烴等產(chǎn)物的生產(chǎn)方面也獲得了較好結(jié)果［20］，但油脂產(chǎn)量整體偏低（目前最高33.4 g/L），副產(chǎn)物乙醇?xì)埩糨^多，且木糖利用效率較低（即使經(jīng)過(guò)戊糖代謝改造），這可能會(huì)降低油脂轉(zhuǎn)化率。

不同于大腸桿菌、釀酒酵母等非天然產(chǎn)油菌株，產(chǎn)油酵母（oleaginous yeast）如解脂耶氏酵母、圓紅冬孢酵母和斯達(dá)氏油脂酵母，以及海洋真菌裂殖壺菌、破囊壺菌等能夠天然地積累過(guò)量油脂，特別適用于油脂及其衍生物的合成［21-22］。2017 年Qiao 等利用合成生物學(xué)手段對(duì)解脂耶氏酵母進(jìn)行了系統(tǒng)改造，獲得的最優(yōu)菌株生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)1.2 g（/L·h），油脂得率0.27 g/g 葡萄糖，油脂產(chǎn)量創(chuàng)紀(jì)錄地達(dá)到98.7 g/L［22］；圓紅冬孢酵母和斯達(dá)氏油脂酵母在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下（加上營(yíng)養(yǎng)限制或者環(huán)境脅迫），胞內(nèi)油脂含量可達(dá)細(xì)胞干重50%～70%［2，4-5，34］；裂殖壺菌、破囊壺菌不僅生物量高（可達(dá)200 g/L），油脂含量高（可達(dá)70%），更難得的是其中高附加值的多不飽和脂肪酸（尤其是DHA）占比極高［25-26］。以上產(chǎn)油真菌還具有顯著的工業(yè)微生物的特征，如能廣泛利用各種碳源（包括己糖和戊糖）和氮源，可高密度培養(yǎng)，抗逆性強(qiáng)（可直接發(fā)酵木質(zhì)纖維素水解液）等［4-5］。

總的來(lái)說(shuō)，真核生物較原核生物（主要是大腸桿菌）在油脂產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度上有明顯優(yōu)勢(shì)。在真核生物中，天然產(chǎn)油真菌的產(chǎn)油水平遠(yuǎn)高于非天然的模式菌株如釀酒酵母。尤為重要的是，經(jīng)過(guò)遺傳改造后，天然產(chǎn)油真菌的油脂產(chǎn)量可有大幅提升［11，22］，這充分說(shuō)明了這些天然產(chǎn)油菌株的油脂開(kāi)發(fā)潛力。

2 合成生物學(xué)為油脂細(xì)胞工廠開(kāi)發(fā)提供了豐富的使能工具

高效的遺傳操作技術(shù)是油脂細(xì)胞工廠開(kāi)發(fā)的前提條件，然而天然產(chǎn)油真菌往往不是模式菌株，這意味著其遺傳操作技術(shù)發(fā)展難度更大，很難從根本的遺傳層面改善其油脂合成水平。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，近10年來(lái)高通量測(cè)序成本急劇降低，越來(lái)越多的產(chǎn)油微生物的基因組被陸續(xù)測(cè)序，其染色體結(jié)構(gòu)、基因編碼、蛋白功能、代謝途徑等信息日漸清晰，深化了學(xué)界對(duì)產(chǎn)油真菌的認(rèn)知。另外，轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究在一定程度上促進(jìn)了合成生物學(xué)元件（如啟動(dòng)子、終止子等）的挖掘和表征。同時(shí)，遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的進(jìn)步使得更多的產(chǎn)油菌株能被改造；最重要的是，CRISPR/Cas 系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)已在部分產(chǎn)油真菌中被成功開(kāi)發(fā)，徹底改寫了產(chǎn)油真菌的遺傳操作技術(shù)發(fā)展格局（圖2）。

圖2 合成生物學(xué)驅(qū)動(dòng)產(chǎn)油真菌使能工具開(kāi)發(fā)Fig.2 Synthetic biology drives the development of enabling tools for lipid producing fungi

2.1 產(chǎn)油真菌合成生物學(xué)元件的挖掘與表征

合成生物學(xué)元件，包括啟動(dòng)子、終止子、篩選標(biāo)記、復(fù)制子等，是對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行遺傳操作的載體或工具。解脂耶氏酵母是遺傳操作研究比較成熟的產(chǎn)油真菌之一，目前已積累了很多可用的基因表達(dá)元件，包括嚴(yán)謹(jǐn)性不同的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如PLEU2、PG3P、PICL1、PPOT1、PPOX1、PPOX2和 PPOX5［35-36］，強(qiáng)度不同的組成型啟動(dòng)子如 PTEF、PEXP1、PGPAT、PGPD、PYAT1、PFBA和PGPM1［37-38］，以及終止子如 Txpr2t、Tlip2t、Tmig1t、Tpex20t和 Tpox3t等［9，39］。有趣的是，釀酒酵母基因組中的終止子如Tcyc1t和Tpho5t也可以在解脂耶氏酵母中發(fā)揮功能［36，39］。在篩選標(biāo)記方面，營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記如URA3/ura3d4（尿嘧啶）、LEU2（亮氨酸）、TRP1（色氨酸）和HisG（組氨酸）等在解脂耶氏酵母中應(yīng)用較多［40-41］，而抗生素抗性標(biāo)記使用較少，僅有博來(lái)霉素（bleomycin/phleomycin）抗性基因phleoR和潮霉素（hygromycin B）抗性基因hph可用于少數(shù)株系［42］。至于復(fù)制子，它一般來(lái)自于菌株的內(nèi)生性游離質(zhì)?；蛘呷旧w上的自主復(fù)制序列。由于解脂耶氏酵母中無(wú)游離質(zhì)粒，目前研究多以解脂耶氏酵母基因組上的自主復(fù)制序列（autonomously replicating sequences， ARS） ARS18、ARS68 或者著絲粒（CEN）序列CEN1-227&ORI1 001 作為游離質(zhì)粒的復(fù)制元件，但拷貝數(shù)極低，難以實(shí)現(xiàn)目的基因的高拷貝、超表達(dá)功能［43-44］。幸運(yùn)的是，在解脂耶氏酵母染色體上存在串聯(lián)重復(fù)核糖體DNA（tandemly repeated ribosomal DNA，rDNA）位點(diǎn)，部分菌株染色體上還存在分散的重復(fù)Ylt1反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子位點(diǎn)以及約束Ylt1 的zeta 因子位點(diǎn)（一個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)序列），可作為整合靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)多拷貝重組［44-45］。

相比于解脂耶氏酵母，其他產(chǎn)油真菌的元件挖掘及表征的研究相對(duì)滯后。在圓紅冬孢酵母中，已有較多的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（如PLDP1、PDAO1、PPHO89、PADH2和 PGAL1等［46-47］）、 組 成型 啟 動(dòng) 子 （如 PPGI、PPGK、PFBA、PTPI、PGPD、PACC1、和 PACL1等［48-49］）、終止子（如Thsp、Tgpd等［50］）等被相繼鑒定和表征。常用的抗性篩選標(biāo)記如HYG（潮霉素抗性）、BLE（博來(lái)霉素抗性）、NEO（新霉素抗性）、G418（遺傳霉素抗性），營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記如URA3、LEU2等，以及熒光素酶（luciferase）、綠色熒光蛋白（GFP）等報(bào)告基因也可在圓紅冬孢酵母中正常使用［51］。然而，目前尚未在圓紅冬孢酵母中發(fā)現(xiàn)任何內(nèi)生性游離質(zhì)粒，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何染色體上的自主復(fù)制序列或著絲粒序列可作為圓紅冬孢酵母中游離質(zhì)粒的復(fù)制子［52］，因此圓紅冬孢酵母的轉(zhuǎn)化載體基本上都是自殺型或者整合型的，對(duì)后續(xù)轉(zhuǎn)化效率有較高要求。

類似于圓紅冬孢酵母，其他研究較多的產(chǎn)油真菌如斯達(dá)氏油脂酵母、裂殖壺菌、破囊壺菌等的合成生物學(xué)元件開(kāi)發(fā)在啟動(dòng)子、終止子及篩選標(biāo)記等方面也有很大進(jìn)展，但主要遭遇缺少獨(dú)立復(fù)制元件的問(wèn)題［8，53-57］。另外，在基因編輯工具中常用的核定位信號(hào)（nuclear localization sequence，NLS）以及Ⅲ型RNA 聚合酶可識(shí)別的啟動(dòng)子（可啟動(dòng)sgRNA 這樣的小RNA），也有待進(jìn)一步鑒定和擴(kuò)充［2，58-59］。

2.2 產(chǎn)油真菌遺傳轉(zhuǎn)化方法的開(kāi)發(fā)與優(yōu)化

將攜帶有各種合成生物學(xué)功能元件以及外源基因的穿梭載體成功導(dǎo)入是產(chǎn)油真菌遺傳操作系統(tǒng)開(kāi)發(fā)的起點(diǎn)，意味著該菌能被遺傳改造，可在基因?qū)用婊虼x途徑水平進(jìn)行理性設(shè)計(jì)。另外，遺傳轉(zhuǎn)化也直接關(guān)系到遺傳改造（尤其是基因編輯）的成敗，因?yàn)榇蟛糠诌z傳操作工具的效果嚴(yán)重依賴于轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化子數(shù)目越多，獲得正突變株的可能性越大［2］。一般來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)化效率與載體類型、轉(zhuǎn)化方法、菌株特性等因素高度相關(guān)。

如前所述，解脂耶氏酵母的遺傳操作技術(shù)相對(duì)成熟，早在1985 年就有成功轉(zhuǎn)化的報(bào)道［60］。目前主要有化學(xué)轉(zhuǎn)化法、電轉(zhuǎn)化和YLOS試劑盒轉(zhuǎn)化等方法。解脂耶氏酵母的化學(xué)轉(zhuǎn)化法借鑒于釀酒酵母的醋酸鋰轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化效率一般可達(dá)104CFU/μg DNA［60-61］。特別地，質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)化效率會(huì)明顯提升。電穿孔轉(zhuǎn)化方法的轉(zhuǎn)化效率與醋酸鋰轉(zhuǎn)化基本接近。有意思的是，在電轉(zhuǎn)前使用醋酸鋰等或硫代化合物如DTT 等處理感受態(tài)，可使轉(zhuǎn)化效率進(jìn)一步提升［62］。YLOS 轉(zhuǎn)化試劑盒由YEASTERN 生物技術(shù)公司研制，優(yōu)化了感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化流程，轉(zhuǎn)化效率也較傳統(tǒng)的化學(xué)轉(zhuǎn)化和電轉(zhuǎn)化有所提升，但價(jià)格昂貴，僅在常規(guī)轉(zhuǎn)化效率較低時(shí)會(huì)用到。

圓紅冬孢酵母的外源基因轉(zhuǎn)化方法與解脂耶氏酵母幾乎同年被開(kāi)發(fā)出來(lái)，由聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率約103CFU/μg DNA［63］，外源基因主要以隨機(jī)插入方式被整合至基因組上。由于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化步驟煩瑣且高度依賴于操作技能，近年來(lái)圓紅冬孢酵母轉(zhuǎn)化主要采用同樣是隨機(jī)插入但操作比較簡(jiǎn)單的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法（Agrobacterium tumefaciensmediated transformation，ATMT）［64］。然而，ATMT轉(zhuǎn)化有一定的宿主依賴性，而且轉(zhuǎn)化效率相對(duì)較低（約40～1000 CFU/μg DNA）。近幾年陸續(xù)報(bào)道了更簡(jiǎn)單的電穿孔和其他化學(xué)轉(zhuǎn)化方法，但轉(zhuǎn)化效率有時(shí)甚至低于ATMT，有待進(jìn)一步優(yōu)化［20，65］。

相比于解脂耶氏酵母和圓紅冬孢酵母，其他產(chǎn)油真菌的遺傳操作系統(tǒng)開(kāi)發(fā)較晚。裂殖壺菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系最早見(jiàn)諸專利［66］，后來(lái)陸續(xù)有經(jīng)同行評(píng)議的電轉(zhuǎn)化及農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的報(bào)道［67-68］。雖經(jīng)多年發(fā)展，實(shí)際操作中裂殖壺菌的轉(zhuǎn)化效率有很高的株系依賴性，同種質(zhì)粒在不同株系之間的轉(zhuǎn)化效率差別很大［56，58，67，69］，另一個(gè)重要的產(chǎn)油真菌斯達(dá)氏油脂酵母，直到2014 年其醋酸鋰轉(zhuǎn)化方法才被開(kāi)發(fā)出來(lái)［70］。值得慶幸的是，近幾年，斯達(dá)氏油脂酵母的遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展迅速，目前PEG 介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化以及ATMT 轉(zhuǎn)化方法也可用于該菌，盡管轉(zhuǎn)化效率還不太高［53-54，71］。

綜上，在產(chǎn)油真菌中，轉(zhuǎn)化效率的低下嚴(yán)重限制了遺傳操作工具在產(chǎn)油真菌中的開(kāi)發(fā)與使用［20］。因此，新的轉(zhuǎn)化方法探索及轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化等工作應(yīng)是產(chǎn)油真菌遺傳轉(zhuǎn)化研究后續(xù)的關(guān)注重點(diǎn)。

2.3 產(chǎn)油真菌基因編輯方法的開(kāi)發(fā)與優(yōu)化

高效、可靠的遺傳操作工具是產(chǎn)油真菌代謝工程改造的利器。遺傳操作工具借助載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入胞內(nèi)，因此其功能的發(fā)揮嚴(yán)重依賴于載體類型（自主復(fù)制型或自殺型、整合型等）以及載體轉(zhuǎn)化效率。除此之外，遺傳操作工具功能的發(fā)揮也與宿主的DNA 修復(fù)能力（尤其是同源重組效率）密切相關(guān)。

一般來(lái)說(shuō)，位于自主復(fù)制型載體上的遺傳操作工具的功能發(fā)揮幾乎不受限于轉(zhuǎn)化效率，因?yàn)榧词罐D(zhuǎn)化后僅獲得一個(gè)攜帶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，也能通過(guò)該轉(zhuǎn)化子的傳代、擴(kuò)增來(lái)豐富轉(zhuǎn)化子的多樣性，以完成后續(xù)遺傳操作和正轉(zhuǎn)化子篩選工作。這在一定程度上解釋了為何在眾多的天然產(chǎn)油真菌中，解脂耶氏酵母的遺傳操作工具最為完備［34，72-73］，根本原因在于解脂耶氏酵母中有復(fù)制型質(zhì)?？捎茫?3-44］。目前在解脂耶氏酵母中已可成功實(shí)現(xiàn)基于同源重組的靶標(biāo)基因的無(wú)痕刪除或整合（等位基因替換）［74］，重組酶介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組［75-76］，多片段體內(nèi)/體外組裝［77-78］，基于 zeta 因子或者 rDNA 序列的目的基因多拷貝整合［45，79］，基于 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的基因編輯［74，80-83］，以及由CRISPR/Cas 系統(tǒng)輔助的堿基編輯［84］等多種操作。然而，一個(gè)潛在的問(wèn)題是，解脂耶氏酵母傾向于啟動(dòng)非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）而不是同源重組（homologous recombination，HR）來(lái)進(jìn)行 DNA 修復(fù)［85］，這導(dǎo)致在解脂耶氏酵母中進(jìn)行精確的基因編輯時(shí)需設(shè)置長(zhǎng)達(dá)1 kb 左右的上下游序列（同源臂），以方便同源重組［80］。在敲除與NHEJ 修復(fù)方式密切關(guān)聯(lián)的KU70基因后，解脂耶氏酵母的NHEJ 修復(fù)能力降低，相應(yīng)地，同源重組能力被刺激增強(qiáng)［80，86-87］。較高的同源重組能力不僅有助于宿主借助同源臂修復(fù)由Cas9、nCas9 以及重組酶造成的DNA 斷裂，而且可以大幅提升體內(nèi)多片段組裝的成功率，同時(shí)減少非特異性的修復(fù)或者非靶向插入。

除解脂耶氏酵母外，大部分產(chǎn)油真菌中無(wú)可用的復(fù)制型質(zhì)粒，外源基因只能被裝載在自殺質(zhì)?；蛘哒闲唾|(zhì)粒［如配合根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化（ATMT）使用的Ti 質(zhì)粒］上，也就是說(shuō)質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后，質(zhì)粒上的非整合元件僅能在一個(gè)細(xì)胞分裂周期內(nèi)起作用，故而遺傳操作工具的作用（同源重組或隨機(jī)插入等重組行為）效率嚴(yán)重依賴于轉(zhuǎn)化效率。畢竟在重組概率一定的情況下，轉(zhuǎn)化子越多，獲得正轉(zhuǎn)化子的可能性就越大。以圓紅冬孢酵母為例，目前可在該酵母中使用的幾種CRISPR/Cas 系統(tǒng)均放置在自殺質(zhì)粒或者整合型的Ti 質(zhì)粒上以醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化或ATMT 方式轉(zhuǎn)化進(jìn)入胞內(nèi)［58-59，88］。CRISPR/Cas 系統(tǒng)中的 Cas9 表達(dá)盒多被整合在宿主基因組上，但引導(dǎo)Cas9 切割的sgRNA 均以瞬時(shí)表達(dá)獲得，Cas9 切割及同源臂修復(fù)需要在細(xì)胞分裂前完成。上述連續(xù)多步驟的DNA/蛋白質(zhì)互作過(guò)程必須在一個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)完成，難度較大，故而圓紅冬孢酵母基因編輯的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的數(shù)目較少，而且整合型的Cas9 可能會(huì)引起潛在的脫靶問(wèn)題［88］。對(duì)于部分可重復(fù)利用而又被整合在染色體上的基因元件（如抗性標(biāo)記、營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、報(bào)告基因等），需以特殊方法進(jìn)行回收。由Cre/loxP、FLP/FRT、I-SceI 等重組酶系統(tǒng)介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組已經(jīng)被引入圓紅冬孢酵母用于目的片段的回收［89-91］。影響基因編輯效率的另一個(gè)因素是圓紅冬孢酵母的DNA 修復(fù)系統(tǒng)。和解脂耶氏酵母類似，它也傾向于使用NHEJ而不是HR修復(fù)DNA，因此有必要在底盤菌株水平抑制NHEJ 或刺激 HR。Koh 等［92］發(fā)現(xiàn)KU70基因缺失后，圓紅冬孢酵母的CAR2基因的同源重組敲除株的比例可由10.5%提升至75.8%，顯示了較好的底盤可塑性。

在其他產(chǎn)油真菌中，遺傳操作工具的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用盡管受制于復(fù)制元件缺乏、轉(zhuǎn)化效率低下、同源重組能力較弱等因素，但也在不斷發(fā)展，目前已能夠?qū)崿F(xiàn)基本的異源基因過(guò)表達(dá)，靶標(biāo)基因敲除等操作［20］。表2 總結(jié)了目前可在各種產(chǎn)油真菌中使用的遺傳操作工具及其效果。在CRISPR/Cas 系統(tǒng)出現(xiàn)之前，等位基因替換一直是產(chǎn)油真菌精細(xì)基因編輯的首選，但是現(xiàn)在正逐步被CRISPR/nCas9 或者CRISPR/Cpf1 以及它們輔助的堿基編輯技術(shù)替代。目前來(lái)看，CRISPR-Cas 系統(tǒng)是一種顛覆性技術(shù)，有力加速了產(chǎn)油真菌的遺傳操作技術(shù)發(fā)展，但部分產(chǎn)油真菌缺乏可用的復(fù)制型質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化效率低、同源重組能力弱等仍是限制基因編輯效率的瓶頸。

表2 典型產(chǎn)油真菌遺傳操作工具研究進(jìn)展Tab.2 Research progress on genetic tools of typical lipid producing fungi

3 產(chǎn)油真菌代謝工程研究進(jìn)展

組學(xué)數(shù)據(jù)加深了科學(xué)家對(duì)產(chǎn)油真菌的遺傳背景、生理、代謝方面的理性認(rèn)識(shí)；質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和遺傳操作技術(shù)，以及啟動(dòng)子、終止子、篩選標(biāo)記和報(bào)告系統(tǒng)，為代謝工程改造提供了工具。利用代謝工程改造解脂耶氏酵母、圓紅冬孢酵母、裂殖壺菌、斯達(dá)氏油脂酵母等在脂肪酸及其衍生產(chǎn)品開(kāi)發(fā)［102］、類胡蘿卜素的產(chǎn)量提升、胞內(nèi)產(chǎn)物外排/分泌、底物譜拓展以及菌株抗逆研究等方面已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，顯示了進(jìn)一步分子遺傳改造的巨大潛力。如前所述，解脂耶氏酵母的遺傳操作工具發(fā)展最為成熟，因此其代謝工程改造研究也最為系統(tǒng)和完善［103-104］。本節(jié)以解脂耶氏酵母為例，詳細(xì)介紹產(chǎn)油真菌代謝工程的策略及研究進(jìn)展。

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）屬半子囊菌類，嚴(yán)格好氧，是食品安全級(jí)菌株［7，105］。作為應(yīng)用最廣泛、研究最多的非常規(guī)酵母之一，解脂耶氏酵母具有理化特征和遺傳背景較清晰、分子操作相對(duì)成熟、代謝調(diào)控可控等優(yōu)勢(shì)［106］，已被廣泛地認(rèn)作是脂質(zhì)合成微生物的模式菌株。由于其抗逆性強(qiáng)、耐酸堿環(huán)境、底物譜廣、胞內(nèi)乙酰輔酶A和三羧酸循環(huán)代謝通量高等特殊的理化性質(zhì)和代謝特征，被廣泛地認(rèn)為具有卓越的生物技術(shù)工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，因此已被開(kāi)發(fā)作為諸多精細(xì)化學(xué)品和天然產(chǎn)物的潛在微生物細(xì)胞工廠。目前產(chǎn)品包括二十二碳六烯 酸［9］、 赤 蘚 糖 醇［107］、 檸 檬 酸［108］、 2-苯 乙醇［109-110］、番茄紅素［111］、蝦青素［112］、法呢烯［113］、芳樟醇［114］、花生四烯酸［115-116］、紫色桿菌素［109］和超長(zhǎng)鏈蠟酯［117］等。特別地，解脂耶氏酵母的脂質(zhì)積累量能達(dá)到細(xì)胞干重的38%［118-120］。

在解脂耶氏酵母油脂合成途徑中，三酰基甘油酯（TAGs）首先被合成，隨后通過(guò)一系列化學(xué)修飾包括氧化、碳鏈延伸、復(fù)分解或碳?xì)浠罨芍|(zhì)終產(chǎn)物［121］。近年來(lái)隨著合成生物學(xué)及代謝工程技術(shù)的發(fā)展，解脂耶氏酵母也被賦予了合成非常規(guī)脂肪酸及脂肪酸衍生物的能力，如多不飽和脂肪酸和γ-癸內(nèi)酯等［122］。具體來(lái)說(shuō)，在外界環(huán)境中氮源含量較低的情況下，解脂耶氏酵母細(xì)胞會(huì)激活、協(xié)調(diào)不同的代謝途徑以葡萄糖或其他碳源（如有機(jī)酸、醇等）為底物合成三酰基甘油酯［122］。其代謝機(jī)理是氮限制導(dǎo)致解脂耶氏酵母胞內(nèi)AMP濃度迅速下降，低水平的AMP抑制了異檸檬酸脫氫酶（IDH）的活性，進(jìn)而下調(diào)三羧酸循環(huán)（TCA）的代謝通量，導(dǎo)致檸檬酸在線粒體中積累；過(guò)量積累的檸檬酸會(huì)在線粒體膜轉(zhuǎn)換蛋白作用下轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，之后通過(guò)ATP 檸檬酸裂解酶（ACL）將檸檬酸裂解為胞質(zhì)乙酰輔酶A 和草酰乙酸，胞質(zhì)乙酰輔酶A 是脂質(zhì)的合成直接前體。式（1）為解脂耶氏酵母中脂肪酸（?；o酶A）

合成的總化學(xué)計(jì)量關(guān)系式（其中n和m分別表示鏈長(zhǎng)和不飽和度）［122］：

進(jìn)一步，3 分子?；o酶A 與1 分子甘油-3-磷酸（G3P）在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂質(zhì)體表面通過(guò)Kennedy 途徑縮合形成三?；视王?，并儲(chǔ)存于脂質(zhì)體（lipid body）中，具體反應(yīng)如下：首先，在甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶（SCT1）的作用下消耗1分子?；o酶A ?；视?3-磷酸形成溶血磷脂酸（LPA）；進(jìn)一步，消耗1 分子?；o酶A，血磷脂酸被血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶（SLC1）酰化生成酸鈦酸（PA）；酸鈦酸被酸鈦酸磷酸酶（PAP）去磷酸化釋放二酰基甘油（DAG）；最后，以1 分子?；o酶A 為最終?；w通過(guò)DAG ?；D(zhuǎn)移酶（DGA1 或DGA2）合成三?；视?，或以甘油磷脂為酰基供體通過(guò)磷脂DAG?；D(zhuǎn)移酶（LRO1）合成［122-123］。

基于清晰的脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)（圖3），通過(guò)工程手段理性地進(jìn)行合成途徑設(shè)計(jì)、前體強(qiáng)化供給、途徑表達(dá)優(yōu)化、降解途徑抑制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)編輯重構(gòu)等技術(shù)能有效地改善、提高解脂耶氏酵母合成脂質(zhì)產(chǎn)物的能力［124］。其中，最成功、典型的案例是美國(guó)杜邦公司通過(guò)引入多個(gè)拷貝的異源延長(zhǎng)酶和去飽和酶基因，同時(shí)對(duì)解脂耶氏酵母自身的脂質(zhì)合成途徑進(jìn)行重構(gòu)，包括過(guò)表達(dá)C16/18延伸酶、Δ12 去飽和酶、降低過(guò)氧化物體β-氧化活性等，最終工程菌株能生產(chǎn)占總細(xì)胞干重的25%的二十碳五烯酸（EPA），成功實(shí)現(xiàn)了EPA 微生物發(fā)酵法商業(yè)生產(chǎn)［9］。此外，麻省理工學(xué)院Stephanopoulos 團(tuán)隊(duì)重構(gòu)解脂耶氏酵母胞內(nèi)NADPH 的合成網(wǎng)絡(luò)，有效地促進(jìn)了油脂的合成，最終油脂達(dá)到98.9 g/L，產(chǎn)量再創(chuàng)紀(jì)錄［22］。下面結(jié)合近年來(lái)微生物合成油脂進(jìn)展（表3），通過(guò)代謝工程角度主要從脂質(zhì)合成途徑優(yōu)化、輔因子工程、降解途徑抑制和分泌等方面進(jìn)行介紹如何設(shè)計(jì)、構(gòu)建解脂耶氏酵母脂質(zhì)細(xì)胞工廠。

表3 代謝工程改造Yarrowia lipolytica合成油脂及衍生品的研究進(jìn)展Tab.3 Research progress in metabolic engineering of Yarrowia lipolytica synthesizing lipids and derivatives

續(xù)表

圖3 產(chǎn)油真菌胞內(nèi)脂質(zhì)合成代謝網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Lipid biosynthesis network of oil producing fungi

3.1 前體合成途徑優(yōu)化

解脂耶氏酵母胞質(zhì)中乙酰輔酶A 是由ATP 檸檬酸裂解酶（ACL）裂解檸檬酸產(chǎn)生，其作為乙?；w，是脂肪酸酰基鏈延伸的基本單位。然而，過(guò)表達(dá)或異源表達(dá)的ATP 檸檬酸裂解酶均未顯著提高解脂耶氏酵母的脂肪酸產(chǎn)量［136-137］，可能是由于解脂耶氏酵母的胞質(zhì)乙酰輔酶A 合成與氮饑餓存在代謝偶聯(lián)。為此，Xu 等［20］設(shè)計(jì)了5 種胞質(zhì)乙酰輔酶A的合成方式以解除胞質(zhì)乙酰輔酶A的合成與氮饑餓的代謝偶聯(lián)，包括丙酮酸-乙酸途徑、丙酮酸-乙醛途徑、丙酮酸甲酸裂解酶、乙酰輔酶A穿梭回路和非氧化磷酸戊糖途徑，結(jié)果表明構(gòu)建乙酰輔酶A 穿梭回路和非氧化磷酸戊糖途徑能顯著地增加了油脂的產(chǎn)量。此外，引入釀酒酵母來(lái)源的乙酰輔酶A 合成酶（ACS2）也能有效促進(jìn)脂油脂的合成［138］。特別是，乙酸攝取途徑可以作為乙酰輔酶A 合成供給的捷徑，以乙酸為碳源同時(shí)強(qiáng)化乙酸合酶能顯著提高胞質(zhì)乙酰輔酶A 的水平［139］。

乙酰輔酶A 羧化酶ACC 能催化乙酰輔酶A 生成丙二酰輔酶A，丙二酰輔酶A是肪酸?；溠由斓墓羌堋ai 等［140］過(guò)表達(dá)解脂耶氏酵母自身的乙酰輔酶A 羧化酶ACC，能促使脂肪酸的產(chǎn)量增加2 倍，表明強(qiáng)化乙酰輔酶A 羧化酶的表達(dá)也是促進(jìn)脂質(zhì)合成的關(guān)鍵。

3.2 輔因子工程

脂質(zhì)是還原度較高的代謝產(chǎn)物，來(lái)源于乙酰輔酶A 的乙?；–H3—CO—）只能通過(guò)NADPH還原后，才能成為脂肪酸的?；湥?2］。研究表明，NADPH 供給是解脂耶氏酵母脂質(zhì)合成的重要限速步驟，且NADPH 的供給方式會(huì)影響底物/產(chǎn)物電子傳遞效率，進(jìn)而改變脂質(zhì)產(chǎn)量和得率［22］。通常來(lái)說(shuō)，在產(chǎn)油真菌中胞質(zhì)NADPH 的供應(yīng)有2 種方式，分別是磷酸戊糖途徑和蘋果酸酶［141］。Wasylenko 等采用13C 同位素標(biāo)記法對(duì)脂肪酸高/低產(chǎn)解脂耶氏酵母工程菌株進(jìn)行代謝流分析，確定胞質(zhì)NADPH 主要通過(guò)磷酸戊糖途徑供給［142］。與此同時(shí)，Dulermo 和Zhang 等分別對(duì)解脂耶氏酵母中蘋果酸酶編碼基因MAE1進(jìn)行失活和過(guò)表達(dá)，皆未顯著影響油脂的合成［133，143］，進(jìn)一步佐證了解脂耶氏酵母胞質(zhì)NADPH 主要通過(guò)磷酸戊糖途徑供給的結(jié)論。強(qiáng)化表達(dá)解脂耶氏酵母磷酸戊糖途徑中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶ZWF1，油脂產(chǎn)量能較出發(fā)菌株提高41%［129］。值得一提的是，Qiao 等通過(guò)設(shè)計(jì)、引入人工合成途徑重構(gòu)胞質(zhì)NADPH 供給，打破解脂耶氏酵母自身NADPH 代謝的桎梏，實(shí)現(xiàn)將糖酵解途徑產(chǎn)生的NADH 轉(zhuǎn)化為NADPH，最終油脂產(chǎn)量達(dá)98.9 g/L，此產(chǎn)量為目前報(bào)道最高［22］。

3.3 降解途徑抑制

當(dāng)碳底物耗盡時(shí)，脂質(zhì)會(huì)通過(guò)再活化（remobilization）或β-氧化降解方式以維持細(xì)胞正常代謝［141］。解脂耶氏酵母的脂質(zhì)再活化是由脂肪酶TGL4 催化，該酶定位于脂質(zhì)體表面，敲除該基因能將脂肪酸產(chǎn)量提高2 倍［144］。解脂耶氏酵母的β-氧化發(fā)生在過(guò)氧化物酶體中，共包括四個(gè)反應(yīng)，最終將?；溈s短兩個(gè)碳，釋放一個(gè)乙酰輔酶A分子［122］。β-氧化途徑第一步反應(yīng)是由6 種?；o酶A 氧化酶（POX1-6）催化，其可識(shí)別不同鏈長(zhǎng)的酰基輔酶A；第二步和第三步反應(yīng)是由雙功能過(guò)氧化物酶（MFE2）完成；最后一步反應(yīng)由3-酮酰輔A 硫醇化酶（POT1）實(shí)現(xiàn)，抑制β-氧化是防止脂質(zhì)降解、促進(jìn)脂質(zhì)進(jìn)一步積累的主要工程靶點(diǎn)。比如，Dulermo等失活基因POX1-6和MFE1，同時(shí)優(yōu)化解脂耶氏酵母的脂肪酸合成途徑，最終脂質(zhì)積累量能達(dá)到細(xì)胞干重的65%～75%［119］。此外，敲除過(guò)氧化物酶體中PEX3、PEX10和PEX311基因（編碼過(guò)氧化物酶體基質(zhì)蛋白），能破壞過(guò)氧化物酶體的形成，抑制β-氧化，有效增加脂質(zhì)的產(chǎn)量［9，21，145］。

3.4 脂肪酸的分泌

盡管相比于野生菌株，工程解脂耶氏酵母菌株合成脂質(zhì)產(chǎn)物的能力取得了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展［122］，但到目前為止，只有高附加值脂質(zhì)產(chǎn)物EPA 實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)［9］，因此為了進(jìn)一步推動(dòng)微生物脂質(zhì)工業(yè)，工程菌株合成脂質(zhì)的能力亟待進(jìn)一步提高。脂質(zhì)分泌合成為構(gòu)建高效微生物油脂細(xì)胞工廠提供新的契機(jī)，將脂質(zhì)產(chǎn)物分泌至胞外，不僅能增加產(chǎn)量，也能避免中間代謝物積累對(duì)細(xì)胞造成毒性，同時(shí)還可以減少產(chǎn)物回收的成本。為此，Amaro等首先將參與脂肪酸再活化和降解相關(guān)的兩個(gè)基因（FAA1和MFE2）缺失，缺失后的細(xì)胞不再能將脂肪酸轉(zhuǎn)化為?；o酶A或進(jìn)行β-氧化，并進(jìn)一步消除脂質(zhì)體的形成以釋放游離脂肪酸。最終，工程菌株的胞外的游離脂肪酸濃度為10.4 g/L，相當(dāng)于每克細(xì)胞合成1.2 g 的脂質(zhì)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)細(xì)胞的存儲(chǔ)極限［120］。

相比于解脂耶氏酵母，其他典型產(chǎn)油真菌如圓紅冬孢酵母、裂殖壺菌、破囊壺菌及斯達(dá)氏油脂酵母的代謝工程研究還處于起步階段［11，53，100-101，125］，基本停留在油脂合成途徑關(guān)鍵基因的超表達(dá)階段，旁路途徑的弱化或敲除都還比較少見(jiàn)，暗示目前的代謝工程改造研究仍在初級(jí)階段，缺乏系統(tǒng)性和大局觀。因此，開(kāi)發(fā)新型遺傳操作工具助推代謝工程研究是當(dāng)務(wù)之急。代謝工程研究的另一個(gè)迫切需求是升級(jí)目標(biāo)產(chǎn)物。目前的代謝工程改造主要以油脂高產(chǎn)為目的。事實(shí)上，很多油脂的衍生產(chǎn)品如不飽和脂肪酸、烷烴、脂肪醇等屬于高附加值產(chǎn)品，也值得大力開(kāi)發(fā)。

4 產(chǎn)油真菌產(chǎn)品高值化研究進(jìn)展

以不飽和脂肪酸、長(zhǎng)鏈烷烴、脂肪醇、萜類為代表的高值化學(xué)品由于應(yīng)用領(lǐng)域廣、經(jīng)濟(jì)性高而具備良好的商業(yè)價(jià)值。代謝工程改造模式微生物如大腸桿菌、釀酒酵母用于高值化學(xué)品的合成已進(jìn)行廣泛的研究和綜述。近年來(lái)，越來(lái)越多研究者嘗試?yán)媒庵辖湍?、圓紅冬孢酵母、裂殖壺菌、破囊壺菌等產(chǎn)油真菌合成高值化合物。這些真核產(chǎn)油微生物在油脂產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度上有明顯優(yōu)勢(shì)，因此在上述高值化學(xué)品合成應(yīng)用中極具開(kāi)發(fā)潛力［146］。

破囊壺菌和裂殖壺菌由于具有生物量高，抗逆性強(qiáng)，底物譜廣、天然產(chǎn)油量高以及油脂中高附加值不飽和脂肪酸占比極高的特征［25-26］，適用于不飽和脂肪酸及相關(guān)高值衍生物的生產(chǎn)。破囊壺菌（Thraustochytrium）和裂殖壺菌屬于破囊壺菌科（Thraustochytriaceae），是一類單細(xì)胞海洋原生生物，常見(jiàn)于海水和紅樹(shù)林中，其中多種不飽和脂肪酸高產(chǎn)菌種已經(jīng)被鑒定［147-149］。由于早期研究中，裂殖壺菌和破囊壺菌的分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育研究存在一定混亂和交叉，以下介紹中以裂殖壺菌為主，包括部分破囊壺菌內(nèi)容。

裂殖壺菌的脂肪酸組成很簡(jiǎn)單，主要是以C14：0和 C16：0為代表的短鏈脂肪酸以及以 C22：5和 C22：6為主的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸［150］。在作為DHA生產(chǎn)菌的菌株篩選過(guò)程中，研究人員還發(fā)現(xiàn)了其他具有商業(yè)價(jià)值的化合物如類胡蘿卜素或角鯊烯的積累。這些化學(xué)品已被廣泛應(yīng)用于食品，飼料和藥品領(lǐng)域，以產(chǎn)油真菌作為細(xì)胞工廠合成相關(guān)高附加值化合物將極具應(yīng)用價(jià)值。

4.1 DHA

20 世紀(jì)80 年代中期開(kāi)始，人們開(kāi)始認(rèn)識(shí)到長(zhǎng)鏈多不飽和ω-3 脂肪酸（如EPA、DHA）的重要性［151］。DHA 是一種對(duì)人類健康必不可少的不飽和脂肪酸，可以促進(jìn)眼睛和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，且有利于成年人心血管健康，其最初的主要來(lái)源是深海魚油。裂殖壺菌能夠以三?；视偷男问椒e聚高水平的脂質(zhì)，其中DHA 含量可高達(dá)總脂質(zhì)的30%～70%，因此作為DHA 生產(chǎn)者極具競(jìng)爭(zhēng)力［150］。從裂殖壺菌種提取的富含DHA油脂已被美國(guó)FDA 授予公認(rèn)安全（Generally Recognized as Safe，GRAS）認(rèn)證用于商業(yè)化生產(chǎn)。

20 世紀(jì)90 年代初期，研究人員成功鑒定并開(kāi)始使用裂殖壺菌生產(chǎn)DHA［152］。幾年后，美國(guó)OmegaTech 公司將基于裂殖壺菌的富DHA 油進(jìn)行商業(yè)化，該公司后來(lái)被Martek 收購(gòu)，現(xiàn)在已成為DSM 的一部分［153］。

裂殖壺菌和破囊壺菌使用標(biāo)準(zhǔn)的脂肪酸合酶復(fù)合物來(lái)合成短鏈飽和脂肪酸，主要是C14：0和C16：0［154］。對(duì)于長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸，在自然界中存在兩種生物合成途徑：延長(zhǎng)去飽和酶途徑和聚酮合酶（PKS）途徑。延長(zhǎng)去飽和途徑從短鏈飽和脂肪酸出發(fā)，利用去飽和酶和延長(zhǎng)酶來(lái)產(chǎn)生多不飽和脂肪酸。而PKS 途徑可催化不飽和脂肪酸的從頭合成，在該過(guò)程中，通過(guò)還原、脫水、還原、縮合的循環(huán)合成長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸［155］。已有研究表明，裂殖壺菌及破囊壺菌通過(guò)PKS 途徑合成高水平的DHA［156］。相比于FAS途徑，通過(guò)PKS合成1分子DHA需消耗14分子還原力NADPH，相比延長(zhǎng)去飽和途徑節(jié)約了40%，同時(shí)副產(chǎn)物更少。

裂殖壺菌和破囊壺菌的油脂積累具有階段性的特征，在未經(jīng)基因工程改造的裂殖壺菌和破囊壺菌中，通過(guò)控制氮源、溶解氧實(shí)現(xiàn)的多階段發(fā)酵過(guò)程結(jié)合合適的發(fā)酵罐設(shè)計(jì)和放大策略，可顯著提高油脂和 DHA 產(chǎn)量［25，157-158］。而通過(guò)合適的發(fā)酵罐選擇和發(fā)酵放大策略，裂殖壺菌可實(shí)現(xiàn)生物量超過(guò)150 g/L，油脂產(chǎn)量103.6 g/L，DHA 產(chǎn)量44.3 g/L，DHA 產(chǎn)率369.08 mg（/L·h）［25］。在此基礎(chǔ)上，已有研究通過(guò)代謝工程手段對(duì)裂殖壺菌進(jìn)行改造以獲得更優(yōu)良的產(chǎn)油性能。如通過(guò)表達(dá)超氧化物歧化酶基因以減輕發(fā)酵過(guò)程中胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧，從而提升DHA產(chǎn)量［100］。

4.2 角鯊烯

角鯊烯是固醇生物合成的中間體，被廣泛用作藥物乳劑中的賦形劑，用于遞送疫苗、藥物和其他藥用前體。角鯊烯可以改善免疫系統(tǒng)，因此可以用作癌癥治療中的保護(hù)劑，也可作為化妝品中的保濕劑和抗氧化劑［159］。從2014 年到2019 年，角鯊烯的全球銷量由4156.9 t增加至6547.2 t，復(fù)合年增長(zhǎng)率為9.80%，預(yù)計(jì)到2025 年，角鯊烯全球銷售額將達(dá)到1.64億美元。

由于存在甲羥戊酸（mevalonate，MVA）途徑和充裕的乙酰輔酶A 供應(yīng)，因此在裂殖壺菌和破囊壺菌中可通過(guò)MVA 途徑經(jīng)由法呢基二磷酸（farnesyl diphosphate， FPP） 合 成 角 鯊 烯 。 以Aurantiochytrium屬為代表的一些破囊壺菌，已被證明可積累超過(guò)30% DCW 的角鯊烯。其中菌株18 W-13a 和Yonez5-1 分別能夠生產(chǎn)占總脂質(zhì)69%和94%的角鯊烯［160-161］，但產(chǎn)量較低（約1 g/L）。裂殖壺菌CCTCC M209059 可在生長(zhǎng)和脂質(zhì)積累階段前期積累大量角鯊烯，達(dá)到總脂質(zhì)38%，滴度最高可達(dá)約3 g/L［162］，而在脂質(zhì)積累后期角鯊烯濃度會(huì)逐漸降低。

由于缺乏生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)研究，破囊壺菌和裂殖壺菌的角鯊烯合成水平暫時(shí)相對(duì)較低，后續(xù)提升空間很大。而相對(duì)明確的、線性的生物合成途徑和也提示基因工程改造可能是提高產(chǎn)油真菌角鯊烯產(chǎn)量的有效策略。

4.3 類胡蘿卜素

類胡蘿卜素是一類天然色素的總稱，可分為葉黃素和胡蘿卜素。商業(yè)上最重要的類胡蘿卜素是葉黃素中的蝦青素、雞油菌素、葉黃素和玉米黃素，以及胡蘿卜素中的β-胡蘿卜素和番茄紅素。類胡蘿卜素的主要用途是在食品和飼料中用作著色劑，也由于具有抗氧化功能在營(yíng)養(yǎng)，藥品和化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用不斷增加［163］。目前由于微生物合成法不具有成本優(yōu)勢(shì)，大多數(shù)類胡蘿卜素目前仍由化學(xué)合成或通過(guò)植物提取獲得。

類胡蘿卜素的合成與角鯊烯類似，均通過(guò)MVA途徑合成，并且以FPP為共同前體。已有研究表明破囊壺菌ONC-T18可同時(shí)合成β-胡蘿卜素和蝦青素、玉米黃質(zhì)等類胡蘿卜素，總含量約為30 μg/g DCW［164］。破囊壺菌 CHN-1 和Aurantiochytriumsp.KH105都被報(bào)道可以合成少量蝦青素［165-166］。迄今為止報(bào)道類胡蘿卜素天然產(chǎn)量最高的產(chǎn)油真菌是破囊壺菌AS4-A1，可合成高達(dá)0.3～0.45 g/L 蝦青素［167］。

解脂耶氏酵母由于同樣具備MVA 途徑及充裕的乙酰輔酶A 供給，已被用于代謝工程改造合成類胡蘿卜素如β-胡蘿卜素［168-169］、番茄紅素［170］或蝦青素［112］。也可借鑒相應(yīng)策略用于提升裂殖壺菌和破囊壺菌的類胡蘿卜素類化合物產(chǎn)量。

5 總結(jié)與展望

微生物油脂作為重要化工原料及潛在的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物，在保障我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、糧食安全、能源安全等方面有重要作用。相比于細(xì)菌，天然產(chǎn)油真菌在油脂產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度上有巨大優(yōu)勢(shì)，有潛力被進(jìn)一步改造為油脂細(xì)胞工廠。當(dāng)前天然產(chǎn)油真菌改造的主要瓶頸在于缺乏遺傳操作工具。幸運(yùn)的是，合成生物學(xué)的飛速發(fā)展有力推動(dòng)了該領(lǐng)域的研究。天然產(chǎn)油真菌在合成生物學(xué)元件挖掘、外源基因轉(zhuǎn)化方法以及遺傳工具開(kāi)發(fā)等方面已取得重要進(jìn)展。而且，隨著基因組和轉(zhuǎn)錄組研究深入，越來(lái)越多的內(nèi)源基因元件如啟動(dòng)子、終止子、篩選標(biāo)記、復(fù)制子等會(huì)被鑒定和使用。另外，很多在模式菌株如釀酒酵母或者絲狀真菌中已經(jīng)成功應(yīng)用的轉(zhuǎn)化方法、遺傳工具、篩選標(biāo)記或者報(bào)告系統(tǒng)也開(kāi)始被引入產(chǎn)油真菌。 以上努力將促成產(chǎn)油真菌遺傳操作技術(shù)尤其是基因編輯技術(shù)的不斷改進(jìn)和迭代更新，有力推動(dòng)其代謝工程及產(chǎn)品升級(jí)研究。當(dāng)前的代謝工程及產(chǎn)品高值化研究與合成生物學(xué)思想聯(lián)系緊密，跨物種募集元件，超時(shí)空調(diào)試途徑及網(wǎng)絡(luò)已成為可能，但元件、途徑、裝置之間及它們與宿主系統(tǒng)的適配仍是當(dāng)前的主要難題，需要依賴可靠的模型或者算法指導(dǎo)，需要依托精確高效的基因編輯工具和先進(jìn)發(fā)酵控制系統(tǒng)。

可以預(yù)期，在合成生物學(xué)時(shí)代，未來(lái)的產(chǎn)油真菌的代謝工程將更多地與遺傳操作工具開(kāi)發(fā)和產(chǎn)品高值化升級(jí)相聯(lián)系。以人工智能和大數(shù)據(jù)技術(shù)挖掘和表征新型合成生物學(xué)元件，借鑒和引進(jìn)已經(jīng)在其他菌株中高效使用的遺傳轉(zhuǎn)化方法，開(kāi)發(fā)更多的高效基因編輯工具將成為常態(tài)；而代謝工程在基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型、流平衡分析算法以及更先進(jìn)模型算法的指引下，在多尺度智能過(guò)程控制裝備的協(xié)助下，有力推動(dòng)下一代產(chǎn)真核油脂細(xì)胞工廠的開(kāi)發(fā)。