李向來，申曉林，王佳，袁其朋，孫新曉

（北京化工大學(xué)，化工資源有效利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029）

隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，生物合成已成為化學(xué)品制造的重要方式［1］。理論上，途徑已知的任何化學(xué)品都可通過生物合成由廉價(jià)碳源實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)。傳統(tǒng)上，微生物合成化學(xué)品以單菌株培養(yǎng)為主，即單一細(xì)胞攜帶完整的代謝途徑。目前通過單培養(yǎng)已實(shí)現(xiàn)許多化學(xué)品的工業(yè)化生產(chǎn)，但在合成長途徑及復(fù)雜途徑化學(xué)品時(shí)還存在較大挑戰(zhàn)，生產(chǎn)性能往往達(dá)不到工業(yè)應(yīng)用要求。代謝負(fù)擔(dān)和代謝壓力是影響生產(chǎn)性能的重要障礙：合成途徑與細(xì)胞生長競爭有限的資源；途徑的引入可能會打破宿主原有的物質(zhì)能量代謝平衡；終產(chǎn)物及中間體的積累可能會產(chǎn)生細(xì)胞毒性。另外，由于宿主細(xì)胞缺乏內(nèi)膜結(jié)構(gòu)及翻譯后修飾系統(tǒng)，無法為某些外源酶的功能表達(dá)提供合適的細(xì)胞微環(huán)境。針對上述問題，借鑒自然界中的共生現(xiàn)象，研究者開發(fā)了共培養(yǎng)技術(shù)，通過在同一體系中培養(yǎng)兩種或多種細(xì)胞實(shí)現(xiàn)勞動(dòng)分工及代謝分區(qū)。與單培養(yǎng)相比，共培養(yǎng)在減輕宿主代謝負(fù)擔(dān)［2-3］、提供合適的酶催化環(huán)境［4］以及復(fù)雜/混合/非常規(guī)底物利用［5-9］等方面具有顯著優(yōu)勢，甚至可以合成通過單培養(yǎng)無法合成的化學(xué)品［10-11］。

1 微生物共培養(yǎng)減輕代謝負(fù)擔(dān)生產(chǎn)化學(xué)品

目標(biāo)產(chǎn)物合成與細(xì)胞自身代謝競爭前體和能量等資源。在單一菌株中引入復(fù)雜途徑可能會導(dǎo)致嚴(yán)重的代謝負(fù)擔(dān)。將途徑拆分并分配至不同細(xì)胞可分擔(dān)代謝壓力。此外，各模塊可單獨(dú)進(jìn)行表達(dá)優(yōu)化，通過菌株比例的調(diào)節(jié)可實(shí)現(xiàn)模塊間的平衡。近來，在共培養(yǎng)減輕代謝負(fù)擔(dān)生產(chǎn)化學(xué)品方面取得諸多研究進(jìn)展（表1）。

表1 共培養(yǎng)生產(chǎn)化學(xué)品的代表性研究進(jìn)展匯總Tab.1 Summary of representative research progresses on microbial co-culture to produce chemicals

在生物合成黃烷醇的過程中，研究者基于對輔因子和前體的不同需求，將途徑拆分為上游丙二酰輔酶A 依賴性模塊和下游NADPH 依賴性模塊，并分配到兩個(gè)大腸桿菌菌株中。通過啟動(dòng)子文庫對上游途徑進(jìn)行表達(dá)優(yōu)化，并對組成下游途徑的基因進(jìn)行組合優(yōu)化。接著，對共培養(yǎng)體系的誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、接種比例和碳源4個(gè)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，并基于初始優(yōu)化數(shù)據(jù)建立了經(jīng)驗(yàn)尺度的高斯模型，預(yù)測最佳生產(chǎn)條件，最終產(chǎn)量達(dá)到40.7 mg/L，較單培養(yǎng)產(chǎn)量提高970倍［12］。

除了線性途徑，共培養(yǎng)策略在非線性途徑的平衡優(yōu)化方面也具有突出優(yōu)勢。例如，迷迭香酸（RA）是一種植物多酚類活性天然產(chǎn)物，其合成途徑屬于分支-匯聚型。RA 的兩種結(jié)構(gòu)單元咖啡酸（CA）和丹酚酸（SAA）均來自同一前體酪氨酸，存在競爭關(guān)系；另外兩者按等摩爾比酯化生成RA，又存在協(xié)同關(guān)系。單培養(yǎng)策略很難達(dá)到兩個(gè)模塊之間的微妙平衡，以實(shí)現(xiàn)代謝資源的合理分配。為此，研究者將RA 的生物合成途徑拆分為3個(gè)模塊（CA模塊、SAA模塊以及RA模塊）并分配到3 種大腸桿菌工程菌株中。CA 模塊包含3 種酶，將4-羥基苯丙酮酸轉(zhuǎn)化為CA；SAA 模塊包含羥化和還原兩步反應(yīng)，將4-羥基苯丙酮酸催化為SAA；RA 模塊先將CA 轉(zhuǎn)化為咖啡酰輔酶A，然后迷迭香酸合成酶催化咖啡酰輔酶A 和SAA 生成RA。為了增加體系的穩(wěn)定性，通過改造使得CA和RA合成菌株優(yōu)先利用葡萄糖生長，而SAA合成菌株利用木糖生長，優(yōu)化接種比例后RA 產(chǎn)量達(dá)到172 mg/L，較單培養(yǎng)提高38倍［13］。

當(dāng)單獨(dú)優(yōu)化的菌株進(jìn)行物理混合和共培養(yǎng)時(shí)，菌群比例經(jīng)常發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。由于生長競爭和代謝壓力，共存狀態(tài)可能會崩潰。除了上述碳源的選擇性利用，研究者還通過建立互利共生關(guān)系來提高菌株比例的穩(wěn)定性。例如，Liu 等［14］建立了交叉喂養(yǎng)的共培養(yǎng)體系用于紅景天苷的生物合成。前期的研究表明大腸桿菌單培養(yǎng)合成紅景天苷效率低下，大量中間體酪醇未被糖基化。為此，將其合成途徑分為酪醇生產(chǎn)模塊以及UDP-葡萄糖和紅景天苷生物合成模塊，并分別導(dǎo)入代謝木糖的苯丙氨酸缺陷菌株和代謝葡萄糖的酪氨酸缺陷菌株。通過酪氨酸和苯丙氨酸的營養(yǎng)共生，形成了穩(wěn)定的大腸桿菌共培養(yǎng)系統(tǒng)，紅景天苷最終產(chǎn)量達(dá)6.03 g/L，較單培養(yǎng)提高20倍。

此外，共培養(yǎng)策略還成功應(yīng)用于木質(zhì)醇、黏糠酸、苯酚、白藜蘆醇等化合物的生物合成［15-23］。

2 微生物共培養(yǎng)利用復(fù)雜、混合及非常規(guī)底物生產(chǎn)化學(xué)品

聯(lián)合生物加工（CBP）旨在直接將木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為燃料及化學(xué)品。然而，工業(yè)生產(chǎn)菌株往往不具有木質(zhì)纖維素降解能力，而木質(zhì)纖維素降解菌株生產(chǎn)能力較弱或者缺乏遺傳操作工具。研究者嘗試構(gòu)建可將纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇或其他燃料的單一菌株。例如，表面展示纖維小體的釀酒酵母可利用微晶纖維素生產(chǎn)乙醇［24］。然而，單菌株既要分泌纖維素酶又要合成產(chǎn)物，代謝負(fù)擔(dān)往往較重，影響最終產(chǎn)量。為此，研究者嘗試共培養(yǎng)策略進(jìn)行勞動(dòng)分工，其中一種菌株分泌纖維素酶，另一菌株將水解產(chǎn)生的單糖轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。例如，可水解纖維素的梭狀芽孢桿菌和產(chǎn)乙醇的嗜熱厭氧菌混合培養(yǎng)，乙醇產(chǎn)量較單培養(yǎng)提高 4.4 倍［25］。Nakayama 等［26］設(shè)計(jì)嗜熱厭氧梭菌和淀粉產(chǎn)丁醇梭菌的共培養(yǎng)體系，直接由纖維素生產(chǎn)丁醇。然而，由于兩種菌株最適生長溫度不匹配，需要進(jìn)行高溫糖化和中溫發(fā)酵兩階段培養(yǎng)，增加了過程能耗及復(fù)雜性。為此，Wang等［6］通過富集培養(yǎng)獲得了中溫條件下穩(wěn)定高效降解纖維素的微生物菌群N3，并對組成菌株進(jìn)行了分類鑒定，其中快生梭菌N3-2 具有最佳的纖維素降解效率，進(jìn)而分別建立了N3 和N3-2 與丙酮丁醇梭菌的共培養(yǎng)體系，結(jié)果表明前者具有較高的丁醇生產(chǎn)效率，產(chǎn)量可達(dá)3.73 g/L。其他的應(yīng)用實(shí)例還包括里氏木霉/大腸桿菌共培養(yǎng)產(chǎn)異丁醇、里氏木霉/德氏根霉共培養(yǎng)產(chǎn)富馬酸等［7，27］。

木質(zhì)纖維素水解液含有葡萄糖、木糖和阿拉伯糖等單糖。葡萄糖效應(yīng)的存在限制了碳源共利用。通過定向進(jìn)化及表達(dá)相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可實(shí)現(xiàn)單菌株同時(shí)利用葡萄糖和木糖［28-30］。此外，通過共培養(yǎng)策略也可實(shí)現(xiàn)碳源共利用。例如，3 種工程酵母菌株共培養(yǎng)可以發(fā)酵葡萄糖-木糖-阿拉伯糖的混合物，與可代謝3種糖的單菌株相比，馴化后的共培養(yǎng)菌株在長時(shí)間重復(fù)批次培養(yǎng)時(shí)具有更穩(wěn)定的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)［31］。共培養(yǎng)策略還用于甲烷、CO 等非常規(guī)碳源的利用。例如，Hill 等［32］設(shè)計(jì)了藍(lán)細(xì)菌-甲烷氧化菌共培養(yǎng)體系，實(shí)現(xiàn)光合作用與甲烷氧化相偶聯(lián)，將溫室氣體CH4和CO2等轉(zhuǎn)化為微生物生物量，通過光照控制可以實(shí)現(xiàn)體系的連續(xù)穩(wěn)態(tài)運(yùn)行。該體系在沼氣和天然氣等混合氣體中生長良好，且與傳統(tǒng)的甲烷異養(yǎng)菌單培養(yǎng)相比，不需要輸入CH4/O2混合氣體，提高了過程的安全性。重要的是上述兩種細(xì)菌均可進(jìn)行代謝工程改造，因此該平臺可進(jìn)行擴(kuò)展，以CH4為廉價(jià)原料合成各種化學(xué)品。Lee 等［33］設(shè)計(jì)了檸檬酸桿菌與卵形鼠孢菌的共培養(yǎng)體系用于CO 轉(zhuǎn)化。檸檬酸桿菌可通過CO 脫氫酶將 CO 和 H2O 轉(zhuǎn)化成 CO2和 H2，卵形鼠孢菌進(jìn)而將CO2和H2轉(zhuǎn)化成乙酸，共培養(yǎng)乙酸產(chǎn)量較卵形鼠孢菌單培養(yǎng)提高82%。另外，通過自養(yǎng)微生物（藍(lán)細(xì)菌等）和異養(yǎng)微生物（細(xì)菌、酵母及真菌等）共培養(yǎng)可以直接通過光合作用固定CO2合成化學(xué)品［34-39］。

3 微生物共培養(yǎng)擴(kuò)大化學(xué)品多樣性

微生物是各種活性化合物的重要來源。通過基因組測序分析后發(fā)現(xiàn)微生物中天然產(chǎn)物基因簇的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過實(shí)驗(yàn)室條件下檢測到的化合物的數(shù)量，原因之一是單培養(yǎng)條件下缺乏生物或化學(xué)刺激，導(dǎo)致合成途徑處于沉默狀態(tài)［40］。自然條件下，微生物共生形成群落，相互之間存在物質(zhì)及信息交流。研究表明共培養(yǎng)可顯著影響微生物代謝［41］。近年來，液質(zhì)聯(lián)用等分析技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了共培養(yǎng)誘導(dǎo)天然產(chǎn)物合成的研究［42］。通過共培養(yǎng)技術(shù)已發(fā)現(xiàn)包括聚酮、大環(huán)內(nèi)酯及二萜等數(shù)百種新化合物［43-48］。例如，通過共培養(yǎng)土棲棘殼孢（Setophoma terrestris）和解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquifaciens），Arora 等［49］分離到一種新的聚酮化合物Blennolide K。從稻黑孢霉（Nigrospora oryzae）和白囊耙齒菌（Irpex lacteus）的共培養(yǎng)體系中，Zhou 等［50］分離到5 種新的倍半萜烯化合物。

如上所述，共培養(yǎng)技術(shù)在化學(xué)品的生產(chǎn)和發(fā)現(xiàn)方面取得了重要進(jìn)展。為了更好地預(yù)測及控制菌株比例，近年來研究者在調(diào)控工具開發(fā)及計(jì)算機(jī)模擬方面開展工作，以推動(dòng)共培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步。

4 群體感應(yīng)調(diào)控菌群比例

在微生物共培養(yǎng)中，成員之間的密度比例是系統(tǒng)功能的決定因素之一，影響到系統(tǒng)穩(wěn)定、基因表達(dá)以及生產(chǎn)效率，因此控制共培養(yǎng)中種群密度比例的方法至關(guān)重要。由于多細(xì)胞共培養(yǎng)各成員之間復(fù)雜的相互作用，往往共培養(yǎng)環(huán)境中一個(gè)微小的變化就會引起密度比例的大幅波動(dòng)。因此，想要在實(shí)際生產(chǎn)中構(gòu)建出符合人們期望比例的或者比例能夠隨生產(chǎn)環(huán)境變化而變化的共培養(yǎng)系統(tǒng)還面臨巨大挑戰(zhàn)。目前，關(guān)于控制共培養(yǎng)種群密度比例的研究還比較少，最常用的手段包括調(diào)節(jié)接種比例、微流體以及固定化培養(yǎng)等。這些方法還難以實(shí)現(xiàn)群體比例的過程控制。為此，研究者嘗試?yán)萌后w感應(yīng)（QS）等策略實(shí)現(xiàn)群體比例的自主調(diào)控（圖1）。

圖1 基于群體感應(yīng)的共培養(yǎng)體系Fig.1 A quorum sensing-based co-culture system

QS 系統(tǒng)由于其簡單的遺傳結(jié)構(gòu)和天然的多樣性，已廣泛用于工程化細(xì)胞間的通信，其中代表性的是以小分子?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHL）為信號分子的QS 系統(tǒng)。AHL 由?；呓z氨酸內(nèi)酯合成酶合成，不同來源的合成酶產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)的AHL信號分子，并響應(yīng)不同的QS 系統(tǒng)。在運(yùn)用QS 的微生物共培養(yǎng)系統(tǒng)中，一種微生物經(jīng)過工程化設(shè)計(jì)可以合成某種特定的AHL 信號分子。該信號分子可在細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境中擴(kuò)散并與對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)合并形成活化的復(fù)合物，激活特定的QS 啟動(dòng)子并啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄［51］。來自費(fèi)氏弧菌和銅綠假單胞菌的lux 和las 系統(tǒng)是最常用的QS 系統(tǒng)，均有著靈敏的信號響應(yīng)性、對同源AHL 信號分子的特異性以及與大腸桿菌的相容性，已被廣泛應(yīng)用于合成生物學(xué)［52］。為了擴(kuò)大QS系統(tǒng)的多樣化運(yùn)用，tra、rpa、rhl、cin 和 esa 等新型 QS 系統(tǒng)得到開發(fā)［53-54］。

Chen 等［55］使用兩種不同的 QS 系統(tǒng)來構(gòu)建“激活”菌株和“阻遏”菌株，其中“激活”菌株（rhl 系統(tǒng)）在rhl-AHL 信號分子存在下可激活兩種菌株中目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，而“阻遏”菌株（cin 系統(tǒng)）在cin-AHL 信號分子存在下通過表達(dá)阻遏物L(fēng)acI 同時(shí)降低兩種菌株中靶基因的轉(zhuǎn)錄。此外，cin-AHL 還將直接激活A(yù)iiA 的表達(dá)，該酶可降解上述兩種信號分子，起到負(fù)反饋?zhàn)饔?。?dāng)兩種菌株共培養(yǎng)時(shí)，這兩種信號調(diào)控機(jī)制會共同在種群水平上產(chǎn)生耦合的正反饋和負(fù)反饋調(diào)節(jié)，并且由于AiiA 的存在，這種負(fù)反饋的引入將緊密調(diào)節(jié)阻遏物的濃度，對共培養(yǎng)系統(tǒng)的種群密度穩(wěn)定具有關(guān)鍵作用。而最終的結(jié)果表明，采用這種雙QS 系統(tǒng)構(gòu)建的共培養(yǎng)體系具有很強(qiáng)的魯棒性，與啟動(dòng)子工程結(jié)合后可成功實(shí)現(xiàn)種群密度的動(dòng)態(tài)調(diào)控。

Scott 等［56］利用 lux 和 rpa QS 系統(tǒng)成功設(shè)計(jì)出以兩個(gè)菌株同步裂解為動(dòng)態(tài)調(diào)控核心的共培養(yǎng)系統(tǒng)。兩種菌株分別攜帶lux 和rpa 系統(tǒng)，并表達(dá)對應(yīng)的信號分子lux-AHL 和rpa-AHL。隨著共培養(yǎng)菌株密度的增長，當(dāng)兩個(gè)菌株中各自的AHL 分子濃度達(dá)到一定的閾值時(shí)，將分別激活對應(yīng)的啟動(dòng)子并促使細(xì)胞裂解蛋白X174 的表達(dá)，造成菌株裂解，以達(dá)到調(diào)控種群密度的目的。之后，未裂解的菌株將會繼續(xù)生長，并在達(dá)到下一次閾值時(shí)開始裂解循環(huán)。當(dāng)維持兩種信號分子處于低濃度時(shí)，共培養(yǎng)系統(tǒng)將發(fā)生恒定裂解，即生長與裂解持平，而種群密度將保持在特定的比例。

McCardell等［57］設(shè)計(jì)大腸桿菌共培養(yǎng)體系，通過兩個(gè)正交的QS 系統(tǒng)控制毒素的產(chǎn)生，以維持特定的種群比例。通過誘導(dǎo)劑IPTG 或aTc 的誘導(dǎo)，兩種菌株產(chǎn)生不同的AHL 分子，在激活自身CcdB的表達(dá)（一種細(xì)菌毒蛋白，可促使DNA 裂解并阻止轉(zhuǎn)錄）的同時(shí)還將激活另一菌株中CcdA 的表達(dá)（一種抗毒素，可抑制CcdB）。在人工添加相應(yīng)誘導(dǎo)劑的情況下，高密度菌株表達(dá)CcdB 抑制自身生長，同時(shí)促進(jìn)另一菌株表達(dá)CcdA 而繼續(xù)正常生長。通過改變IPTG 和aTc 誘導(dǎo)劑的濃度，可以調(diào)節(jié)兩種菌株的密度達(dá)到特定比值。

AI-2 是一種存在于許多細(xì)菌中的自動(dòng)誘導(dǎo)分子，能廣泛響應(yīng)細(xì)菌的種群密度［58］。Stephens等［59］基于 AI-2 的誘導(dǎo)特性，在E.coli中構(gòu)建了一種新型的共培養(yǎng)系統(tǒng)，并成功實(shí)現(xiàn)種群密度比例的動(dòng)態(tài)調(diào)控以及預(yù)測。該系統(tǒng)首先構(gòu)建了一個(gè)能感應(yīng)AI-2 并能將其轉(zhuǎn)化為正交QS 信號AI-1 的菌株。產(chǎn)生的AI-1信號自由擴(kuò)散進(jìn)第2種菌株，并激活PtsH 蛋白表達(dá)，通過增強(qiáng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)細(xì)胞生長，通過動(dòng)態(tài)控制第2種菌株生長速率達(dá)到調(diào)節(jié)菌群比例的目的。最后，以初始AI-2 的不同響應(yīng)濃度為函數(shù)的主要變量，創(chuàng)建出能預(yù)測最終種群比例的數(shù)學(xué)模型，并在該模型指導(dǎo)下，證明這種新型的調(diào)控系統(tǒng)在一定種群比例范圍內(nèi)的可靠性。

5 計(jì)算機(jī)模擬工具預(yù)測菌群動(dòng)態(tài)變化

生物系統(tǒng)具有復(fù)雜性，通常需要計(jì)算模型指導(dǎo)代謝網(wǎng)絡(luò)的設(shè)計(jì)改造，以使工程菌株按照設(shè)計(jì)執(zhí)行功能。共培養(yǎng)體系的功能分析可以借助典型的微生物組工具，包括細(xì)胞群落特定組分分析、宏基因組測序、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)和宏蛋白質(zhì)組學(xué)等。此外，微流體細(xì)胞分選技術(shù)可以分離單個(gè)物種［60］，用于研究它們的DNA、RNA 或蛋白質(zhì)特征。同時(shí)，對代謝物的實(shí)時(shí)監(jiān)測還可以研究共培養(yǎng)組分的整體動(dòng)態(tài)變化。結(jié)合這些數(shù)據(jù)分析手段，越來越多的微生物群落的計(jì)算機(jī)模擬工具被成功開發(fā)。

基因組規(guī)模模型（GSMs）是一種基于全基因組序列的模擬方法。該方法將目前所有已知的調(diào)控代謝的反應(yīng)合并到合適的數(shù)學(xué)分析網(wǎng)絡(luò)中，再結(jié)合菌株生產(chǎn)目標(biāo)以及相關(guān)的約束條件進(jìn)行共培養(yǎng)模擬，用以預(yù)測菌株在不同底物上的生長情況、特定基因敲除對細(xì)胞代謝的影響以及菌株間可能的相互作用等微生物功能。目前，GSMs 已被應(yīng)用于微生物共培養(yǎng)模式及其相互作用機(jī)制的研究。例如，Koch等［61］利用化學(xué)計(jì)量模型預(yù)測微生物群落的組成，并應(yīng)用于沼氣生產(chǎn)過程。通過模擬得到3種微生物分別在單培養(yǎng)、雙培養(yǎng)和三培養(yǎng)情況下的全部化學(xué)反應(yīng)，并利用分級優(yōu)化的方法對生長速率、底物利用率以及產(chǎn)量進(jìn)行逐級優(yōu)化，成功預(yù)測了在不同底物下的種群組成、不同生長速率對最大甲烷產(chǎn)量的影響以及實(shí)現(xiàn)最大甲烷產(chǎn)量的最佳營養(yǎng)成分。更重要的是，GSMs 操作簡便，易將單培養(yǎng)模型推及雙培養(yǎng)甚至三培養(yǎng)，有利于實(shí)現(xiàn)能量、物質(zhì)的最佳化共用以及多物種間復(fù)雜相互作用的研究。結(jié)合基因表達(dá)或翻譯數(shù)據(jù)作為反應(yīng)限制條件， 這些模型還可用以捕獲DNA→RNA→蛋白質(zhì)的信息傳遞，已被用于研究未經(jīng)人工培養(yǎng)的共生菌并鑒定其代謝缺陷［62-63］。

通量平衡分析（FBA）是一種在基因組規(guī)模模型基礎(chǔ)上建立的模擬代謝網(wǎng)絡(luò)的方法。該方法只需知道共培養(yǎng)中每個(gè)反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量系數(shù)，就可以對微生物群落中幾乎所有的代謝相互作用進(jìn)行建模，并使其適應(yīng)特定的環(huán)境變化。此外，F(xiàn)BA 還可用于預(yù)測在不同碳源中菌株的生長速度和某種代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)速度。例如，Stolyar 等［64］研究了以乳酸為唯一碳源和能源的脫硫弧菌和馬氏甲烷球菌的共生系統(tǒng)，通過FBA 模型將不同代謝物間的相互關(guān)系和代謝物在化學(xué)反應(yīng)中的通量以一系列的線性方程表示，以參與甲烷生產(chǎn)的170 個(gè)反應(yīng)為模型的核心反應(yīng)，并考慮不同共培養(yǎng)環(huán)境和物種遺傳干擾帶來的影響，將建模結(jié)果與在連續(xù)生物反應(yīng)器中共培養(yǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)該模型可準(zhǔn)確預(yù)測群落組成、代謝通量以及生長表型。

然而，F(xiàn)BA 是一種偽穩(wěn)態(tài)模型系統(tǒng)，其模型較為理想化。在處理多微生物群落的復(fù)雜時(shí)空動(dòng)態(tài)變化時(shí)，還需要采用動(dòng)態(tài)通量平衡分析（dFBA）。dFBA 是在FBA 的基礎(chǔ)上充分考慮共培養(yǎng)體系中各種可能的變化后建立的。其可以模擬各個(gè)穩(wěn)態(tài)模型在不同共培養(yǎng)時(shí)間階段的相互作用。此外，在dFBA 中，通過監(jiān)測關(guān)鍵中心代謝產(chǎn)物可以驗(yàn)證模型準(zhǔn)確性。目前已經(jīng)開發(fā)了針對多種微生物共培養(yǎng)的dFBA。例如，在纖維素分解梭菌和產(chǎn)溶劑丙酮丁醇梭菌的共培養(yǎng)模型中，dFBA 被用來預(yù)測動(dòng)態(tài)菌群比例、群落間相互作用以及基因表達(dá)水平［65］。常微分方程模型被用來模擬不同的共培養(yǎng)相互作用類型（互利共生、偏利共生等）。例如，Kong等［66］以營養(yǎng)成分、兩種菌株及各自所產(chǎn)生的相互作用分子為主要變量，結(jié)合生長速率、相互作用強(qiáng)度等因素，再通過模塊化途徑重構(gòu)與計(jì)算機(jī)模擬，構(gòu)建了6種不同作用方式的乳酸乳球菌雙菌株共培養(yǎng)體系，進(jìn)一步由簡至繁，推測出三菌株以及四菌株的共培養(yǎng)模型，并成功預(yù)測其種群動(dòng)態(tài)、種群行為以及相關(guān)的動(dòng)力學(xué)特征。另外，研究者基于Monod 微分方程開發(fā)了計(jì)算機(jī)模型，成功預(yù)測以碳源（有機(jī)酸）和氮源（銨）營養(yǎng)共生的大腸桿菌和沼澤紅假單胞菌的最佳發(fā)酵條件，并形成了穩(wěn)定的共培養(yǎng)體系［67］。模型結(jié)果表明，大腸桿菌產(chǎn)生的有機(jī)酸（如甲酸、乙酸和乳酸等）具有抑制作用，將會降低碳的利用效率和破壞種群平衡。

6 挑戰(zhàn)和展望

隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，微生物共培養(yǎng)已成為化學(xué)品生物合成的新方法。利用該方法，不僅可以減輕代謝負(fù)擔(dān)實(shí)現(xiàn)復(fù)雜化合物的合成，還可以充分發(fā)揮不同物種的優(yōu)勢和能力，利用低劣生物質(zhì)以提高目標(biāo)產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)性。雖然微生物共培養(yǎng)已經(jīng)展現(xiàn)出許多優(yōu)勢，但目前仍存在一些問題和挑戰(zhàn)。首先，共培養(yǎng)體系是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的系統(tǒng)，難以實(shí)現(xiàn)長期的穩(wěn)定。由于成員生長速度不同或者異源物種不兼容，通常出現(xiàn)某一成員完全取代另一成員的情況，導(dǎo)致生產(chǎn)性能降低甚至共培養(yǎng)系統(tǒng)完全破壞。雖然已有許多研究通過QS 系統(tǒng)來保持種群的穩(wěn)定性，但是這些系統(tǒng)在進(jìn)行長時(shí)間的發(fā)酵時(shí)也表現(xiàn)欠佳。目前，保持種群穩(wěn)定性的最有效方法是建立個(gè)體成員間牢固的互利互惠或共生關(guān)系。其次，共培養(yǎng)體系各成員間可控的種群比例也是一個(gè)值得關(guān)注的問題?？煽氐姆N群比例對于生產(chǎn)途徑中的代謝通量平衡至關(guān)重要，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的最優(yōu)化生產(chǎn)。然而，共培養(yǎng)成員間的相互作用是復(fù)雜多樣的，往往一個(gè)微小的變化都會引起種群比例的巨大變化，從而導(dǎo)致通量平衡被破壞。盡管以前的研究通過表達(dá)裂解蛋白［56］、毒素蛋白［57］或其他負(fù)反饋抑制機(jī)制［55］來阻止細(xì)菌生長從而調(diào)控種群比例，但是這些研究不僅將產(chǎn)生額外的代謝壓力，這種抑制性的種群比例調(diào)控方式還將導(dǎo)致巨大的生物質(zhì)浪費(fèi)。同時(shí)，隨著共培養(yǎng)體系中所包含的成員越多，解決這個(gè)問題的難度將越來越大。目前，解決這個(gè)問題最可能有效的方法是通過QS 系統(tǒng)或其他常規(guī)小分子響應(yīng)器來正向調(diào)控共培養(yǎng)體系成員的生長，例如Stephens 等［59］的研究，而非阻止或殺死。此外，中間體的轉(zhuǎn)運(yùn)也是一個(gè)關(guān)鍵的問題［68］。途徑的拆分意味著中間體需要從一個(gè)菌株轉(zhuǎn)運(yùn)到另一個(gè)菌株。但是某些化合物不能自由通過細(xì)胞膜或者不能被第二菌株攝取。面對這種情況，通常需要表達(dá)額外的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。最后，異源菌株的共培養(yǎng)是面臨的另一挑戰(zhàn)。不同種屬的菌株有著不同的生物合成能力，例如，釀酒酵母具有完善的蛋白表達(dá)修飾機(jī)制和豐富的細(xì)胞內(nèi)膜，是表達(dá)細(xì)胞色素P450s 的理想宿主［69］，而枯草芽孢桿菌可利用自身合成的生物表面活性劑來提高疏水有機(jī)化合物的生物利用度，其已被廣泛應(yīng)用于原油的降解等［70-71］。因此，利用異種菌株的共培養(yǎng)來生產(chǎn)化學(xué)品前景廣闊，但不同種菌株的生長生產(chǎn)條件差異顯著，將造成物種間不兼容。未來，微生物共培養(yǎng)的發(fā)展將受益于合成生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的進(jìn)展，包括基因組工程、宏蛋白質(zhì)組學(xué)、宏代謝組學(xué)以及CRISPR/Cas 工具等。微生物共培養(yǎng)未來發(fā)展的一個(gè)方向是更廣泛地兼容多物種共培養(yǎng)，以利用不同物種的生物合成能力。這對于植物和真菌的天然產(chǎn)物生物合成具有特別意義，因?yàn)樵诠才囵B(yǎng)中使用真核生物對于植物和真菌天然產(chǎn)物途徑酶的功能性表達(dá)非常有益。未來發(fā)展的另一個(gè)方向是開發(fā)針對萜類化合物和生物堿等結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的化合物的高效合成共培養(yǎng)策略?？傮w而言，通過一系列元件、工具及模型的開發(fā)，上述問題和挑戰(zhàn)將逐步得到解決，未來將可設(shè)計(jì)復(fù)雜穩(wěn)定可控的共培養(yǎng)體系應(yīng)用于化學(xué)品的高效生產(chǎn)。

致謝：感謝國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFA0901800）及北京化工大學(xué)雙一流項(xiàng)目（XK1802-8，XK1902）對本研究的支持。