劉寧，陳秀荔，黃欣

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070;2.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院，南寧 530021

核糖核酸酶(RNase A)是一類(lèi)在脊椎動(dòng)物中存在的核酸水解酶。很多研究表明該基因家族的幾個(gè)成員具有明顯的消化、水解RNA、抗菌及抗病毒的作用[1-4]。胰核糖核酸酶(RNase 1)屬于RNase A超家族，具有RNase A超家族的結(jié)構(gòu)特征，其蛋白序列包含1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子，在第2個(gè)外顯子上具有完整的CDS(coding sequence)區(qū)[5]，包含6～8個(gè)半胱氨酸形成的2個(gè)二硫鍵，具有特有的“CKXXNTF”氨基酸序列。有關(guān)RNase 1在哺乳動(dòng)物中研究很多，例如人類(lèi)(Homosapiens)[6]、牛(Bostaurus)[7]及葉猴(Pygathrixnemaeus)[8]等，特別是在其基因進(jìn)化以及生物學(xué)功能研究方向。RNase1基因在哺乳動(dòng)物中普遍存在基因拷貝，葉猴通過(guò)基因復(fù)制產(chǎn)生的RNase1B具有與小腸一致的較低pH環(huán)境，是其對(duì)植食性的一種適應(yīng)[8]。Yu等[9]發(fā)現(xiàn)食肉目鼬科(Mustelidae)RNase1出現(xiàn)基因復(fù)制，推測(cè)與它們的進(jìn)食快又多的特點(diǎn)相適應(yīng)。嚙齒類(lèi)和食肉類(lèi)動(dòng)物腸道中缺少幫助消化的微生物，消化結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，卻廣泛表現(xiàn)出RNase1基因拷貝現(xiàn)象，促使研究者們?nèi)ヌ接慠Nase1基因重復(fù)所產(chǎn)生的新功能[10-12]。隨著對(duì)高等脊椎動(dòng)物RNase1基因分子進(jìn)化機(jī)制及食性適應(yīng)性進(jìn)化研究的深入，低等脊椎動(dòng)物RNase1基因研究也在不斷開(kāi)展。

關(guān)于魚(yú)類(lèi)RNase 1的研究較少，目前僅在斑馬魚(yú)(Daniorerio)[13]、大西洋鮭(Salmosalar)[14]和團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[15-16]等有報(bào)道。鯉科魚(yú)類(lèi)是我國(guó)分布最廣、種類(lèi)最多的淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，它們的食性廣泛且存在差異。故本研究通過(guò)對(duì)基因組中不同食性鯉科魚(yú)類(lèi)的RNase1基因進(jìn)行序列和進(jìn)化分析，進(jìn)一步探討不同鯉科魚(yú)類(lèi)RNase1基因結(jié)構(gòu)及基因表達(dá)水平的差異，研究魚(yú)類(lèi)RNase 1結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，同時(shí)在不同食性魚(yú)類(lèi)之間闡釋RNase 1的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，旨在為進(jìn)一步研究魚(yú)類(lèi)RNase1基因提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

成年草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)、翹嘴鲌(Culteralburnus)、鳙(Hypophthalmichthysnobilis)和團(tuán)頭魴來(lái)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)鄂州水產(chǎn)實(shí)驗(yàn)基地。試驗(yàn)用魚(yú)在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)2周，暫養(yǎng)期間保證溶氧充足，水溫合適。樣品采集前用氨基甲酸乙酯對(duì)魚(yú)體進(jìn)行麻醉，75%的乙醇消毒，在冰上采集團(tuán)頭魴、草魚(yú)、鳙和翹嘴鲌的肌肉、肝臟、脾臟、性腺、心臟、腎臟、腸、腦、鰓和血液10種組織迅速放入凍存管，置于液氮罐，之后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱備用。

1.2 鯉科魚(yú)類(lèi)RNase 1基因的鑒定及序列特征分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載青鳉(Oryziaslatipes)、斑馬魚(yú)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)等RNase1基因序列作為比對(duì)序列，在團(tuán)頭魴、草魚(yú)、鯉(Cyprinuscarpio)、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙及翹嘴鲌的全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)分析，鑒定出7種魚(yú)類(lèi)的RNase1基因序列。鳡(Elopichthysbambusa)及黃尾鲴(Xenocyprisdavidi)的RNase1基因序列由筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期克隆保存。對(duì)9種鯉科魚(yú)類(lèi)的RNase 1蛋白序列進(jìn)行序列分析，首先利用BioEdit軟件進(jìn)行初級(jí)序列分析和氨基酸、核苷酸序列比對(duì)，然后在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez)上BLAST檢測(cè)氨基酸序列的相似性。使用在線軟件pI/Mw(http://web.expasy.org/compute_pi)測(cè)定RNase 1蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及分子質(zhì)量等基本物理化學(xué)性質(zhì)。用在線軟件SignalP 4.1對(duì)RNase 1進(jìn)行編碼信號(hào)肽序列的預(yù)測(cè)。用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)同源建模的方法對(duì)9種鯉科魚(yú)類(lèi)RNase 1的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，之后利用PyMOL軟件對(duì)鯉科魚(yú)類(lèi)RNase 1的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化。

1.3 鯉科魚(yú)類(lèi)RNase 1的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為分析硬骨魚(yú)類(lèi)和哺乳動(dòng)物RNase 1的進(jìn)化關(guān)系，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分別下載陸生哺乳動(dòng)物、水生哺乳動(dòng)物RNase 1序列，大西洋鮭(Salmosalar)和虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的RNase1基因序列從Cho等[13]的研究中獲得，將上述序列與本研究鑒定的9種鯉科魚(yú)類(lèi)的RNase 1序列采用CLC Sequence Viewer 6軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，利用MEGA 5.0[17]使用最大似然法(ML)和最大簡(jiǎn)約法(MP)，重復(fù)檢測(cè) 1 000次，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 鯉科魚(yú)類(lèi)RNase 1基因表達(dá)分析

用TRIZOL裂解法提取團(tuán)頭魴、鳙、翹嘴鲌和草魚(yú)的心臟、腦、腎、肌肉、鰓、血液、脾臟、性腺、腸和肝臟的總RNA。然后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，并使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific，美國(guó))測(cè)量濃度。利用PrimeScript RT reagent KIT(TaKaRa，日本)試劑盒將每種魚(yú)類(lèi)不同組織總RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用PRIMER 5.0根據(jù)CDS區(qū)設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(表1)。qRT-PCR反應(yīng)使用Light Cycler 480(Roche，瑞士)，以β-actin作為內(nèi)參基因。qRT-PCR條件為95 ℃預(yù)變性45 s；95 ℃模板變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后繪制熔解曲線。基因表達(dá)定量采用ΔΔCt 相對(duì)定量法計(jì)算。

表1 RNase 1基因的引物序列信息 Table 1 Primer sequence ofRNase 1 genes

2 結(jié)果與分析

2.1 鯉科魚(yú)類(lèi)RNase 1的同源性和理化性質(zhì)

經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索比對(duì)、鑒定與注釋?zhuān)罱K獲得9種魚(yú)的完整RNase1基因序列。鯉科魚(yú)類(lèi)基因組中只存在1個(gè)RNase1基因。利用Bio-Edit軟件對(duì)9種魚(yú)RNase 1序列同源性進(jìn)行分析比對(duì)，結(jié)果顯示9種鯉科魚(yú)類(lèi)的RNase 1氨基酸序列相似度較高(圖1A)，其中鰱與其他魚(yú)類(lèi)相似度范圍最高(0.686～0.992)，鯉與其他魚(yú)類(lèi)的RNase 1氨基酸序列的相似度最低(0.594～0.695)。對(duì)RNase 1蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分子質(zhì)量等基本物理化學(xué)性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，9種鯉科魚(yú)類(lèi)RNase 1蛋白質(zhì)序列的物理化學(xué)特征非常相似，等電點(diǎn)在8.85～9.24、分子質(zhì)量在14.46～14.90 ku；9種鯉科魚(yú)類(lèi)帶正電的殘留總數(shù)為18～21個(gè)(圖1B)。

Cc：鯉 Cyprinus carpio； Xd：黃尾鲴 Xenocypris davidi； Hn：鳙 Hypophthalmichthys nobilis； Hm：鰱 Hypophthalmichthys molitrix； Ci：草魚(yú) Ctenopharyngodon idella； Ma：團(tuán)頭魴 Megalobrama amblycephala； Eb：鳡 Elopichthys bambusa； Ca：翹嘴鲌 Culter alburnus； Dr：斑馬魚(yú) Danio rerio； pI：等電點(diǎn) Isoelectric point； Mw：分子質(zhì)量 Molecular weight； K No.：賴(lài)氨酸的數(shù)量 Number of Lys； R No.：精氨酸的數(shù)量 Number of Arg； Total：帶正電的殘留總數(shù)(賴(lài)氨酸和精氨酸) Total number of positively charged residues (Lys+Arg).

2.2 鯉科魚(yú)類(lèi)RNase 1氨基酸多序列比對(duì)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

多序列比對(duì)結(jié)果顯示，鯉科魚(yú)類(lèi)的氨基酸數(shù)均在150個(gè)左右，具有RNase A超家族的結(jié)構(gòu)特征：N端有由20多個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列、His-Lys-His催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)、6個(gè)保守的半胱氨酸殘基及“CKXXNTF” motif序列(圖2A)。利用Swiss-Model在線軟件對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模，發(fā)現(xiàn)這9種鯉科魚(yú)類(lèi)RNase 1的三級(jí)結(jié)構(gòu)非常相似，均由3個(gè)α螺旋、6個(gè)β折疊形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)和6個(gè)Loop區(qū)域組成，保守位點(diǎn)分布在α螺旋和β折疊上(圖2B)。

2.3 RNase 1的系統(tǒng)發(fā)育分析

為了更好地了解不同脊椎動(dòng)物RNase 1的進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建哺乳動(dòng)物和硬骨魚(yú)基于RNase 1蛋白質(zhì)序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖3、圖4所示：哺乳動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物及硬骨魚(yú)RNase 1明顯分為不同的進(jìn)化支。大多數(shù)嚙齒動(dòng)物和陸生哺乳動(dòng)物的RNase1基因都存在多拷貝，這是基因復(fù)制的結(jié)果，然而海洋哺乳動(dòng)物及硬骨魚(yú)的RNase1基因均為單拷貝(圖3A、圖4A)。鯉科魚(yú)類(lèi)RNase 1的MP與ML進(jìn)化樹(shù)顯示，團(tuán)頭魴與翹嘴鲌聚為一支，這與物種進(jìn)化關(guān)系相符；MP進(jìn)化樹(shù)顯示鳡與黃尾鲴聚為一支(圖3B、圖4B)。

圖3 哺乳動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)RNase 1(A)與9種鯉科魚(yú)類(lèi)的RNase 1(B)的ML的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.3 ML phylogenetic trees of RNase 1 in mammals and fishes(A) and nine of cyprinid fish(B)

圖4 哺乳動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)RNase 1(A)與9種鯉科魚(yú)類(lèi)的RNase 1(B)的MP的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.4 MP phylogenetic trees of RNase 1 in mammals and fishes(A) and nine of cyprinid fish(B)

6個(gè)半胱氨酸(活動(dòng)-位點(diǎn)殘基)用藍(lán)色圓圈標(biāo)記，3個(gè)催化殘基用紅色三角形顯示；3個(gè)α螺旋(α1-α3)和6個(gè)β轉(zhuǎn)角(β1-β6)分別用紅色和黃色表示。The six structural cysteines (active-site residues) are marked with blue circle and three catalytic residues showed with red triangles. Locations of three α-helices (α1-α3) and six β-turns (β1-β6) are shown in red and yellow.

2.4 鯉科魚(yú)RNase 1基因的組織表達(dá)模式

選取植食性的團(tuán)頭魴和草魚(yú)、雜食性的鳙和肉食性的翹嘴鲌進(jìn)行不同食性魚(yú)類(lèi)RNase1基因在不同組織中的表達(dá)模式的研究。qRT-PCR結(jié)果顯示(圖5)，RNase1基因在4種魚(yú)不同組織中的表達(dá)模式各不相同，其中在肝臟組織中的相對(duì)表達(dá)量高，差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。除肝臟外，團(tuán)頭魴RNase1基因在鰓和腎臟中也高表達(dá)，差異極顯著(P<0.01)，在心臟、血液、脾臟和性腺中也有表達(dá)(圖5A)；翹嘴鲌的RNase1基因只在肝臟和脾臟中高表達(dá)(P<0.01)，其他組織中均不表達(dá)(圖5B)；在鳙中，RNase1基因主要在肝臟和血液中表達(dá)，差異極顯著(P<0.01)，在其他組織中均不表達(dá)(圖5C)。與團(tuán)頭魴不同的是，草魚(yú)RNase1只在肝臟中高表達(dá)，在其他組織中均不表達(dá)(圖5D)。

A:團(tuán)頭魴 M. amblycephala； B:翹嘴鲌 C. alburnus； C:鳙 H. nobilis； D:草魚(yú) C. Idella. M:肌肉 Muscle; H:心臟 Heart； B:腦 Brain； K ：腎 Kidney； G ：鰓 Gill； D： 血液 Blood； S：脾臟 Spleen； O：性腺 Gonad；I：腸 Intestine；L:肝臟 Liver.

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，硬骨魚(yú)與哺乳動(dòng)物的RNase 1分為不同的進(jìn)化支。在哺乳動(dòng)物進(jìn)化支中，大多數(shù)RNase1基因存在多個(gè)拷貝，特別是在草食性的葉猴和牛身上，然而魚(yú)類(lèi)進(jìn)化支上RNase1均為單拷貝基因，沒(méi)有發(fā)生復(fù)制，這表明RNase1基因復(fù)制是對(duì)其消化生理的一種適應(yīng)[18]。魚(yú)類(lèi)的RNase1基因在基因組中為單拷貝，一方面說(shuō)明魚(yú)類(lèi)RNase1進(jìn)化過(guò)程中比較保守，另一方面說(shuō)明RNase1在低等脊椎動(dòng)物中適應(yīng)性分化為特定功能。此外，不同食性鯉科魚(yú)類(lèi)的RNase1進(jìn)化顯示，相同食性的魚(yú)類(lèi)并未聚類(lèi)在一起，從進(jìn)化角度說(shuō)明鯉科魚(yú)類(lèi)的RNase 1的進(jìn)化與物種食性的關(guān)聯(lián)性不大，但符合物種進(jìn)化的規(guī)律。

本研究中，9種不同食性的鯉科魚(yú)類(lèi)RNase 1帶正電的氨基酸比例高。研究者們發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物中，具有抗菌作用的RNase1具有較高的等電點(diǎn)[19-20]。Cho等[13]對(duì)斑馬魚(yú)RNase 1重組蛋白功能的研究發(fā)現(xiàn)，RNase 1蛋白具有較強(qiáng)的消化活性和抗菌功能，斑馬魚(yú)的RNase 1重組蛋白的等電點(diǎn)不高，但與雞一樣，帶正電的氨基酸比例很高。筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)團(tuán)頭魴RNase 1重組蛋白的研究也得出同樣的結(jié)論[21]。因此根據(jù)進(jìn)化保守性，推測(cè)其在鯉科魚(yú)類(lèi)中可能普遍具有抗菌功能。

目前對(duì)于RNase 1的生物學(xué)功能假設(shè)都集中于消化活性上。我們對(duì)RNase1在不同食性魚(yú)類(lèi)的不同組織中表達(dá)模式進(jìn)行研究，結(jié)果顯示不同食性的魚(yú)類(lèi)表達(dá)模式存在差異，同種食性魚(yú)類(lèi)相同組織的表達(dá)情況也不同。根據(jù)相對(duì)定量結(jié)果，不同食性鯉科魚(yú)類(lèi)的RNase1基因在肝臟中的相對(duì)表達(dá)量均高。以往研究表明魚(yú)類(lèi)的食性與其自身消化器官的構(gòu)造及內(nèi)源性消化酶的消化機(jī)能密切相關(guān)[22]。魚(yú)類(lèi)肝胰臟分泌內(nèi)源性消化酶，是魚(yú)類(lèi)重要的消化腺。而Cho等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚(yú)的成魚(yú)階段RNase1基因主要在肝臟和腸道中表達(dá)，其重組蛋白R(shí)Nase 1的活性顯示出較強(qiáng)的抗菌功能，消化活性不強(qiáng)。在大西洋鮭中曾有報(bào)道，RNase的抗菌功能與消化活性之間沒(méi)有必然關(guān)系，它們互不影響，彼此獨(dú)立[23]。因此，4種鯉科魚(yú)類(lèi)肝臟中高表達(dá)，其他組織中不表達(dá)或低表達(dá)，可能與斑馬魚(yú)一致，主要是在能量代謝方面發(fā)揮作用，是否具有消化活性，需要在今后的試驗(yàn)中進(jìn)行進(jìn)一步基因功能驗(yàn)證；同種食性的草魚(yú)和團(tuán)頭魴在其他組織的表達(dá)存在顯著差異，表明RNase 1在同食性的魚(yú)類(lèi)中可能具有不同的功能，故從基因表達(dá)水平也推測(cè)RNase1基因進(jìn)化與其物種本身的食性相關(guān)性不大。在翹嘴鲌和團(tuán)頭魴中，RNase1基因在脾臟中表達(dá)量較高，推測(cè)RNase 1可能與其免疫機(jī)能相關(guān)。RNase1基因在鳙血液中高表達(dá)，推測(cè)其可能參與了系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)過(guò)程，特別是血管穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。綜上所述，RNase1基因在不同組織中的表達(dá)模式各不相同，它們具體行使怎樣的生物學(xué)功能，還需要在進(jìn)一步的試驗(yàn)中進(jìn)行深入探究。