馬世林，李繼紅，馬倩倩，吳志豪，陳愿，張永安,3,4，周洋,3

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢430070； 2.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，武漢430072； 3.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；4.長(zhǎng)江經(jīng)濟(jì)帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心，武漢430070

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)屬于革蘭氏陰性菌，是一種重要的條件致病菌[1]。該菌在自然界廣泛分布，由其引起的魚類出血性敗血癥(MAS)給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。嗜水氣單胞菌的主要毒力因子包括胞外毒素(氣溶素、溶血素、腸毒素等)、胞外蛋白酶(金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶等)和黏附因子(S蛋白、菌毛、外膜蛋白等)等[3-4]。研究表明，嗜水氣單胞菌致病過(guò)程包含多個(gè)毒力因子的協(xié)同作用[5]，因此，解析嗜水氣單胞菌毒力因子的協(xié)同和調(diào)控機(jī)制顯得尤為重要。

雙組分系統(tǒng)(two-component system,TCS)是細(xì)菌感受、響應(yīng)和適應(yīng)環(huán)境改變或自身胞內(nèi)狀態(tài)的一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，細(xì)菌感應(yīng)的信號(hào)包括細(xì)菌細(xì)胞自身的氧化還原狀態(tài)、營(yíng)養(yǎng)狀況、外界環(huán)境的滲透壓和抗生素濃度等[6-7]。EnvZ/OmpR系統(tǒng)是經(jīng)典的雙組分系統(tǒng)之一，可響應(yīng)外界滲透壓的變化，其中EnvZ是定位于細(xì)胞膜上的組氨酸蛋白激酶，OmpR是位于細(xì)胞質(zhì)中具有轉(zhuǎn)錄活性的反應(yīng)調(diào)控因子，EnvZ感應(yīng)到外界信號(hào)后，通過(guò)磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移將信號(hào)傳遞給OmpR，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游外膜孔蛋白OmpF和OmpC的轉(zhuǎn)錄[8]。有研究者發(fā)現(xiàn)鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)EnvZ/OmpR雙組分系統(tǒng)在細(xì)菌滲透壓調(diào)節(jié)、運(yùn)動(dòng)和毒力調(diào)控上發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。致病性大腸桿菌(pathogenicEscherichiacoli)雙組份系統(tǒng)EnvZ/OmpR下游基因ompF和ompC缺失后顯著影響細(xì)菌對(duì)宿主的侵襲、定植和黏附能力[10]。目前，嗜水氣單胞菌中雙組分系統(tǒng)EnvZ/OmpR的功能未知，本研究通過(guò)同源重組的方法構(gòu)建了雙基因缺失株ΔenvZ/ompR，探究雙組分系統(tǒng)EnvZ/OmpR是否影響嗜水氣單胞菌生物被膜形成、抗血液殺傷、全身性侵襲性擴(kuò)散等過(guò)程，旨在為闡明EnvZ/OmpR在嗜水氣單胞菌致病過(guò)程中發(fā)揮的功能提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和實(shí)驗(yàn)試劑

嗜水氣單胞菌野生株ZYAH72于2014年分離自湖北荊州某漁場(chǎng)患病鯽，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存，NCBI序列號(hào)為NZ_CP016989.1。大腸桿菌χ7213感受態(tài)及自殺質(zhì)粒pRE112均為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。草魚腎細(xì)胞CIK細(xì)胞系(grass carp kidney cell line，CVCL_CV32)由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存并傳代，在含10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素-鏈霉素雙抗的M199培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

胎牛血清和M199培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；PrimeSTAR Max DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA Marker購(gòu)自諾唯贊公司；所有抗生素(青霉素-鏈霉素雙抗和氯霉素)均購(gòu)自海博生物試劑公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒GoScriptTMReverse Transcription System購(gòu)自美國(guó)Promega公司；熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(SYBR Green PCR master mix)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；試驗(yàn)中使用的引物(表1)，均由擎科生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物信息 Table 1 Primers information

1.2 ΔenvZ/ompR缺失株的構(gòu)建

ΔenvZ/ompR缺失株構(gòu)建策略如圖1所示，以嗜水氣單胞菌ZYAH72全基因組為模板，用P1/P2和P3/P4引物分別進(jìn)行PCR以擴(kuò)增上下游同源臂，再用P1/P4引物經(jīng)融合PCR連接上下游同源臂。經(jīng)XbaⅠ和SacⅠ雙酶切后連接到自殺性質(zhì)粒pRE112對(duì)應(yīng)多克隆位點(diǎn)，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌χ7213。將構(gòu)建的χ7213-pRE112-envZ/ompR作為供體菌，嗜水氣單胞菌ZYAH72作為受體菌，進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移。具體操作如下：供體菌和受體菌分別培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用無(wú)菌PBS洗滌2次后混合均勻。將混合液小心加到提前放置在無(wú)抗LA平板上的無(wú)菌硝酸纖維素膜上，28 ℃靜置6 h后用LB培養(yǎng)基沖洗，適當(dāng)梯度稀釋后涂布于氯霉素抗性平板上。28 ℃培養(yǎng)待結(jié)合子長(zhǎng)出后，用P1/P4引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。驗(yàn)證為陽(yáng)性的單交換子在7%蔗糖LB培養(yǎng)基中連續(xù)傳代后檢測(cè)氯霉素抗性。對(duì)于氯霉素敏感菌株用P5/P6引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，PCR鑒定結(jié)果為陰性即表明ΔenvZ/ompR缺失株構(gòu)建成功。

圖1 ΔenvZ/ompR缺失株構(gòu)建策略Fig.1 Construction strategy of ΔenvZ/ompR

1.3 NaCl脅迫實(shí)驗(yàn)

分別配制含有0.25%、1.00%、2.00% NaCl的培養(yǎng)基，將嗜水氣單胞菌以體積比1∶100轉(zhuǎn)接到鹽脅迫培養(yǎng)基中，混勻后轉(zhuǎn)接至96孔板，每孔200 μL，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。28 ℃條件下培養(yǎng)，每0.5 h測(cè)OD600 nm值，連續(xù)培養(yǎng)30 h。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)

使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript TMRT Kit)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，2×TSINGKE Master qPCR Mix-SYBR進(jìn)行熒光定量PCR。其中嗜水氣單胞菌ZYAH72的內(nèi)參為16S rRNA，草魚的內(nèi)參為β-actin。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，分析方法采用2-ΔΔCt法[11]。

1.5 生物被膜生成量檢測(cè)

取10 μL菌液和100 μL LB至96孔板中，28 ℃培養(yǎng)36 h。吸出菌液并用無(wú)菌水洗去未附著菌體，用100 μL 0.2%結(jié)晶紫染色5 min。無(wú)菌水洗滌后放置于37 ℃培養(yǎng)箱烘干，用33%冰醋酸溶解生物被膜，分光光度計(jì)測(cè)定每孔的OD600 nm值。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.6 全血?dú)麑?shí)驗(yàn)

采集健康成年草魚血液，用EDTA作抗凝處理，調(diào)節(jié)菌濃度為105CFU/mL，菌和血液以體積1∶9比例混勻置于28 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。作用1 h后取100 μL菌-血液混合物，使用無(wú)菌PBS進(jìn)行10倍梯度稀釋后涂布平板，28 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，第2天進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.7 斑馬魚攻毒實(shí)驗(yàn)

斑馬魚購(gòu)自武漢東湖生態(tài)旅游風(fēng)景區(qū)萬(wàn)物生水族經(jīng)營(yíng)部，于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)基地暫養(yǎng)1周后進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。根據(jù)菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果，用PBS將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的嗜水氣單胞菌洗滌2次，置于冰上備用。注射感染組斑馬魚用無(wú)菌注射器經(jīng)腹腔注射，設(shè)置6個(gè)攻毒濃度，每組10尾斑馬魚，每尾10 μL，同時(shí)注射PBS組作為空白對(duì)照。浸泡感染組的斑馬魚背鰭前方小片鱗片用手術(shù)刀片刮掉，分別浸泡在6個(gè)濃度梯度菌液的魚缸中，20 min后撈出并用曝氣水清洗，放到干凈水源的魚缸中。設(shè)置刮傷后PBS浸泡組為空白對(duì)照組。所有斑馬魚感染后持續(xù)觀察14 d，記錄死亡數(shù)據(jù)，采用Karber法計(jì)算LD50[12]。

1.8 草魚攻毒實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)用草魚(體質(zhì)量20±10 g、體長(zhǎng)8～10 cm)購(gòu)自湖北仙桃市某草魚養(yǎng)殖基地，于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)基地暫養(yǎng)1周后進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。草魚感染劑量為2.0×105CFU/尾。感染24 h后，解剖草魚后取脾臟、頭腎和體腎組織，分別稱取其質(zhì)量。向組織中加入1 mL的PBS，使用研磨棒研磨組織獲得懸浮液，涂布平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，最后計(jì)算出每克組織中的載菌量。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜水氣單胞菌雙組分系統(tǒng)envZ/ompR基因組分析及ΔenvZ/ompR缺失株構(gòu)建

對(duì)嗜水氣單胞菌ZYAH72全基因組序列分析，發(fā)現(xiàn)envZ/ompR的同源序列，將其命名為envZ/ompR(BFW97_22565/ BFW97_22560)。為進(jìn)一步研究envZ/ompR功能，通過(guò)同源重組法構(gòu)建envZ/ompR雙基因缺失株，通過(guò)基因外部引物(P1/P4)PCR擴(kuò)增，野生型獲得3 080 bp產(chǎn)物，ΔenvZ/ompR產(chǎn)物為1 205 bp，通過(guò)基因內(nèi)部引物(P5/P6)PCR擴(kuò)增，野生型獲得535 bp產(chǎn)物，ΔenvZ/ompR無(wú)對(duì)應(yīng)片段因此無(wú)法獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果均與預(yù)期一致，表明ΔenvZ/ompR缺失株構(gòu)建成功(圖2)。

泳道1、3為野生型ZYAH72擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道2，4為缺失株envZ/ompR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道1、2引物為外引物P1/P4，泳道3、4引物為內(nèi)引物P5/P6。Lanes 1 and 3 are the amplified products of wild-type ZYAH72,lanes 2 and 4 are the amplified products of ΔenvZ/ompR,the primers of lanes 1 and 2 are P1/P4,and the primers of lanes 3,4 are P5/P6.

2.2 雙組分系統(tǒng)EnvZ/OmpR對(duì)ompF和ompC基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

滲透脅迫實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在低滲(0.25% NaCl)、等滲(1.00% NaCl)和高滲(2.00% NaCl)LB培養(yǎng)基中ΔenvZ/ompR與野生株生長(zhǎng)速度無(wú)顯著性差異(圖3)。對(duì)下游ompF和ompC基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)結(jié)果顯示，野生型菌株在低滲(0.25% NaCl)條件較等滲(1.00% NaCl)條件下ompF的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)了64.6%，envZ/ompR缺失后，ompF的轉(zhuǎn)錄水平顯著被抑制(圖4)。在高滲(2.00% NaCl)條件下，野生型菌株ompC的轉(zhuǎn)錄水平較等滲(1.00% NaCl)條件上調(diào)了48.2%，而envZ/ompR缺失后，ompC的上調(diào)表達(dá)被顯著抑制(圖5)。

A:0.25% NaCl; B:1.00% NaCl; C:2.00% NaCl.圖3 細(xì)菌在不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)LB培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of bacteria cultured in LB medium with different NaCl concentration

圖4 ompF在不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)LB培養(yǎng)條件下的轉(zhuǎn)錄水平Fig.4 Transcription level of ompF under differentNaCl concentration LB culture conditions

圖5 ompC在不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)LB培養(yǎng)條件下的轉(zhuǎn)錄水平Fig.5 Transcription level of ompC under different NaCl concentration LB culture conditions

2.3 雙組分系統(tǒng)EnvZ/OmpR在嗜水氣單胞菌生物被膜形成和抗全血?dú)械淖饔?/h3>

通過(guò)檢測(cè)體外生成生物被膜的生成量，探究雙組分系統(tǒng)EnvZ/OmpR是否參與嗜水氣單胞菌生物被膜形成過(guò)程，結(jié)果顯示ΔenvZ/ompR的生物被膜形成能力較野生型下調(diào)19.9%(圖6)。此外，ΔenvZ/ompR在抗宿主免疫清除方面也表現(xiàn)出缺陷。野生型在與草魚全血孵育1.0 h后，細(xì)菌數(shù)量為起始菌量的3.82倍，而ΔenvZ/ompR被草魚全血有效殺傷，孵育1.0 h后菌量?jī)H為起始菌量的90.1%(圖7)，表明envZ/ompR缺失后，細(xì)菌抗全血?dú)芰︼@著下降。

圖6 生物被膜形成能力檢測(cè)Fig.6 Biofilm formation test

圖7 抗全血?dú)芰z測(cè)Fig.7 Capacity of anti-whole blood killing assay

2.4 雙組分系統(tǒng)EnvZ/OmpR在嗜水氣單胞菌感染過(guò)程中的作用

斑馬魚攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腹腔注射感染方式下，ΔenvZ/ompR的LD50相較野生型增長(zhǎng)了1.80倍，而在創(chuàng)傷感染方式下，ΔenvZ/ompR的LD50相較野生型增長(zhǎng)了4.80倍(表2)。進(jìn)一步檢測(cè)野生株與ΔenvZ/ompR感染后分別在草魚內(nèi)臟組織載菌量上的差異，結(jié)果顯示：在脾臟中，ΔenvZ/ompR的載菌量?jī)H為野生株的5.5%；在體腎組織中，ΔenvZ/ompR的載菌量?jī)H為野生株的11.3%；在頭腎組織中，野生載菌量為103CFU/g，而ΔenvZ/ompR的載菌量為0(圖8)。

表2 斑馬魚攻毒結(jié)果 Table 2 Zebrafish challenge results

圖8 草魚組織載菌量Fig.8 Bacterial loads in grass carp tissues

2.5 雙組分系統(tǒng)EnvZ/OmpR對(duì)于促炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響

野生株感染草魚后脾臟中TNF-α和IL-6的轉(zhuǎn)錄水平分別上調(diào)了154.6倍和84.5倍，而ΔenvZ/ompR感染組脾臟中，上述促炎細(xì)胞因子也上調(diào)表達(dá)，上調(diào)倍數(shù)分別為107.8倍和5.6倍；在肝臟中野生株感染后TNF-α和IL-6的轉(zhuǎn)錄水平分別上調(diào)了115.6倍和102.0倍，而缺失株感染組僅為52.6倍和24.6倍(圖9)。上述結(jié)果說(shuō)明野生株感染后能夠引起草魚強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，而envZ/ompR基因缺失后降低了炎癥反應(yīng)程度。

A：脾臟； B：腎臟； C：肝臟。A:Spleen; B:Kidney; C:Liver.圖9 草魚促炎細(xì)胞免疫因子的相對(duì)表達(dá)量Fig.9 Relative expression of pro-inflammatory cytokine of grass carp

3 討 論

自20世紀(jì)80年代起，嗜水氣單胞菌的流行病給全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[13]。嗜水氣單胞菌的致病機(jī)制一直以來(lái)都是業(yè)內(nèi)研究熱點(diǎn)。本研究通過(guò)同源比對(duì)，將ZYAH72(NZ_CP016989.1)菌株BFW97_22565/ BFW97_22560基因命名為envZ/ompR，成功構(gòu)建了基因缺失株ΔenvZ/ompR，并初步分析了該基因的功能。

根據(jù)功能域分析推測(cè)雙組分系統(tǒng)EnvZ/OmpR可能和滲透脅迫有關(guān)，然而，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示缺失株滲透脅迫能力變化并不顯著。在基因功能預(yù)測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)ZYAH72基因組中共有4對(duì)雙組分基因和滲透脅迫有關(guān)，推測(cè)envZ/ompR基因失活后其他雙組分系統(tǒng)代償了EnvZ/OmpR滲透脅迫的功能。為了驗(yàn)證這個(gè)猜想，用qRT-PCR的方法檢測(cè)了下游滲透調(diào)控相關(guān)因子的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，低滲條件下，外膜孔蛋白基因ompF受雙組分系統(tǒng)EnvZ/OmpR調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，而高滲條件下外膜孔蛋白基因ompC受雙組分系統(tǒng)EnvZ/OmpR調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)。上述結(jié)果與大腸桿菌中雙組分系統(tǒng)EnvZ/OmpR對(duì)于下游蛋白的調(diào)控結(jié)果一致[14]，表明嗜水氣單胞菌中EnvZ/OmpR與滲透脅迫響應(yīng)相關(guān)，但因?yàn)樵赯YAH72菌株中還存在其他功能類似的雙組分系統(tǒng)，這些雙組分系統(tǒng)如何協(xié)調(diào)互作，具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

生物被膜與細(xì)菌抗生素抗性和致病性密切相關(guān)，生物被膜還可以作為細(xì)菌對(duì)外的屏障，有效抵御宿主殺傷[15-17]。之前的研究發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌QseB/C雙組分系統(tǒng)正向調(diào)節(jié)泳動(dòng)及涌動(dòng)、溶血活性和負(fù)向調(diào)節(jié)生物膜的形成，影響細(xì)菌毒力[10]。本研究發(fā)現(xiàn)雙組分系統(tǒng)EnvZ/OmpR正調(diào)控嗜水氣單胞菌生物被膜的形成和抗血液殺傷能力。

研究表明，鮑曼不動(dòng)桿菌EnvZ/OmpR雙組分系統(tǒng)調(diào)控細(xì)菌的滲透壓和毒力[9]。此外，大腸桿菌雙組分系統(tǒng)下游基因ompF和ompC也被發(fā)現(xiàn)和細(xì)菌的定植、黏附能力及毒力有關(guān)[10]。本研究測(cè)算了ΔenvZ/ompR的斑馬魚LD50，發(fā)現(xiàn)腹腔感染后缺失株毒力和野生株毒力差異并不明顯。然而刮傷感染結(jié)果顯示ΔenvZ/ompR毒力有明顯下降，提示EnvZ/OmpR在嗜水氣單胞菌由皮膚創(chuàng)口向全身系統(tǒng)擴(kuò)散過(guò)程發(fā)揮作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)論，用草魚構(gòu)建感染模型檢測(cè)了組織載菌量，ΔenvZ/ompR感染草魚后各臟器的載菌量相比于野生株顯著降低，表明EnvZ/OmpR促進(jìn)細(xì)菌的全身侵襲能力。在實(shí)際生產(chǎn)中，魚體體表傷口也是嗜水氣單胞菌感染的途徑之一。最后我們還發(fā)現(xiàn)，ΔenvZ/ompR感染引起的宿主促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6表達(dá)量減少，過(guò)多的炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致組織損傷、器官衰竭甚至最終死亡。因此，上述結(jié)果也與ΔenvZ/ompR致病力的結(jié)果相一致。

綜上，本研究初步探究了嗜水氣單胞菌雙組分系統(tǒng)EnvZ/OmpR的功能，發(fā)現(xiàn)其參與響應(yīng)滲透脅迫，參與調(diào)控生物被膜形成，且在致病過(guò)程尤其是宿主體內(nèi)系統(tǒng)擴(kuò)散過(guò)程發(fā)揮重要作用，這一結(jié)果可為嗜水氣單胞菌致病調(diào)控機(jī)制的研究提供科學(xué)依據(jù)。