沈文靜 張 莉 劉來盤 方志翔 劉 標

(生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所 南京 210042)

楊樹在我國廣泛栽培，楊樹天然林在我國18個省區(qū)均有分布。據(jù)第九次全國森林資源清查，楊樹人工林面積為757萬hm2，在人工林中排名第2位(曾偉生等， 2019)。楊樹人工林物種單一、生物多樣性低，病蟲害嚴重，經(jīng)濟損失巨大(吳秋芳等， 2015)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)抗蟲基因植物不僅能夠有效控制蟲害，還能夠減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，已成為植物抗蟲育種的重要手段。2002年，我國研發(fā)的轉(zhuǎn)cry1Ac基因歐洲黑楊(世紀楊)(Populusnigra)獲得原國家林業(yè)局良種審定和商品化許可，成為世界上第一個商品化栽培的轉(zhuǎn)基因林木樹種(丁莉萍等， 2016)。

與其他轉(zhuǎn)基因植物一樣，轉(zhuǎn)基因楊樹的生態(tài)安全受到廣泛關(guān)注，我國2個抗食葉害蟲轉(zhuǎn)基因楊樹已有一定規(guī)模種植，胡建軍等(2010)綜合相關(guān)研究認為轉(zhuǎn)抗蟲基因楊樹不僅可以有效控制靶標害蟲的種群數(shù)量, 同時還提高了昆蟲類群的多樣性, 有利于害蟲的綜合治理。目前針對轉(zhuǎn)基因楊樹生態(tài)安全方面研究主要集中在林間昆蟲群落的調(diào)查分析，對于室內(nèi)定量分析轉(zhuǎn)基因楊樹對非靶標生物，特別是對具有重要生態(tài)功能指示物種的影響還少有報道。蚯蚓在土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動起著重要作用，能夠促進有機質(zhì)的分解、改善土壤結(jié)構(gòu)和理化性狀，并能為土壤中其他生物提供易利用食物，是土壤質(zhì)量的指示物種(Thakuriaetal., 2009)。赤子愛勝蚓(Eiseniafoetida)在我國主要分布于長江以北，喜歡生活在富含腐殖質(zhì)和有機質(zhì)的環(huán)境中，黃初龍等(2003)報道赤子愛勝蚓是黑龍江帽兒山森林系統(tǒng)中蚯蚓優(yōu)勢種。由于赤子愛勝蚓易于培養(yǎng)，對毒物響應(yīng)較為穩(wěn)定，已成為轉(zhuǎn)基因植物殘體對蚯蚓影響研究首選的實驗動物。

本研究以轉(zhuǎn)基因楊樹葉片為材料，通過室內(nèi)飼喂赤子愛勝蚓，研究轉(zhuǎn)基因楊樹對赤子愛勝蚓生長和發(fā)育影響，分析赤子愛勝蚓體內(nèi)生物酶活性變化趨勢，為轉(zhuǎn)基因楊樹大規(guī)模應(yīng)用提供生態(tài)安全方面的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 楊樹材料

本試驗所用楊樹葉片采集于河北省任丘市天門口鄉(xiāng)尚書村村西轉(zhuǎn)基因楊樹實驗林，林地原為平坦農(nóng)耕地，楊樹種植于2004年，株行距5 m × 3 m，轉(zhuǎn)基因楊樹品種為轉(zhuǎn)cry1Ac基因歐洲黑楊(世紀楊)，對照楊樹品種為2025楊(P.deltoides‘Lux’×P.deltoides‘Shanhaiguanensis’)。2018年11月間，收集仍在枝頭的完整的枯黃楊樹葉片，自然晾干粉碎后備用。葉片基本理化性質(zhì)見表1，具體測定方法參照《現(xiàn)代植物生理學(xué)實驗指南》(中國科學(xué)院上海植物生理研究所， 1999)。

表1 楊樹葉片基本成分Tab.1 Characteristics of poplar leaf (mg·g-1DM)

1.2 實驗動物

供試赤子愛勝蚓種群由本實驗室長期養(yǎng)殖，選用1月齡以上、體質(zhì)量為0.15～0.18 g的健康赤子愛勝蚓作為試驗材料。

1.3 試驗設(shè)計

據(jù)報道溫帶楊樺林年平均凋落量為3.89 t·hm-2，按土層厚度20 cm，土壤密度1.15 g·cm-3計算，每公頃土壤總質(zhì)量為2 250 t，因此，自然土壤中蚯蚓可能接觸轉(zhuǎn)基因楊樹殘體的最高劑量為1.73 g凋落物/1 kg干土(武啟騫等， 2017)。本試驗中將赤子愛勝蚓暴露劑量定為40 g凋落葉片/960 g干土，超出其在實際環(huán)境中可能暴露劑量的20倍。土壤來自南京周邊林地表層土(5～20 cm)，自然風(fēng)干研磨后過1 mm孔徑篩，備用。

本試驗設(shè)3種處理： 1)轉(zhuǎn)基因楊樹組；2)非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諚顦浣M；3)發(fā)酵牛糞組。每個處理均設(shè)3個重復(fù)。發(fā)酵牛糞組中發(fā)酵牛糞為本實驗室利用新鮮牛糞堆制而成。按照40 g葉片/960 g干土配置凋落物，加入去離子水，使得土壤含水量為30%，攪拌均勻后按每瓶750 g基質(zhì)(1 L玻璃圓柱形敞口瓶)分裝。將蚯蚓隨機分組，按每組10條放入敞口瓶中，以紗布封口，放置于(22±2)℃、濕度為80%～85%的培養(yǎng)箱內(nèi)，持續(xù)適量光照(400～600 lx)。

1.4 赤子愛勝蚓生長和繁殖測定

試驗共計進行140天，每隔14天觀察每個處理赤子愛勝蚓生存狀態(tài)，記錄蚓繭數(shù)量，稱量赤子愛勝蚓體質(zhì)量。每次調(diào)查后將4 g新葉片或發(fā)酵牛糞添加入基質(zhì)中，混勻充分，再將蚯蚓重新放入敞口瓶中，觀察鉆洞行為，繼續(xù)試驗。

84天調(diào)查時，將檢獲的蚓繭隨同基質(zhì)放入玻璃培養(yǎng)皿(直徑9 cm)，每皿1枚蚓繭，每重復(fù)設(shè)置10個蚓繭，放入培養(yǎng)箱中，每日觀察孵化情況，直至30天。蚓繭孵化第7天，取出幼蚓，每重復(fù)取3條合并稱重，- 80 ℃保存，用于測定初孵幼蚓體內(nèi)酶活性。

1.5 外源蛋白和蚯蚓體內(nèi)生物酶活性測定

分別在試驗開始、14天、84天和140天時收集葉片土壤混合基質(zhì)，- 80 ℃保存。140天結(jié)束時，每處理每重復(fù)分別取3條成蚓，室溫過夜放置清腸后合并稱重，收集腸道排泄物； 將蚯蚓低溫研磨，加樣品提取液，旋轉(zhuǎn)混勻，離心3 min，取樣稀釋后待測體內(nèi)酶活性?；|(zhì)和蚯蚓組織保存、前處理方法參照Shu等(2015)。蚯蚓體內(nèi)總蛋白、乙酰膽堿酯酶(AchE)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和超氧化物歧化酶(SOD)活性使用Sigma公司相關(guān)試劑盒測定，外源Cry1Ac含量利用Envirologix公司Cry1Ab/c 蛋白ELISA試劑盒(AP003)測定，具體測定按照試劑盒說明書進行。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用SPSS17進行數(shù)據(jù)單因素方差分析，Student-Newman-Keuls檢驗比較差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因楊樹葉片對蚯蚓生存和生長影響

在研究的140天所做的10次調(diào)查中，轉(zhuǎn)基因楊樹組、非轉(zhuǎn)基因楊樹組和發(fā)酵牛糞組3個處理存活的赤子愛勝蚓的體征和行為表現(xiàn)正常(無瘦弱、對機械刺激反應(yīng)敏感)，鉆洞行為也未發(fā)現(xiàn)異常。在試驗進行第42天時，非轉(zhuǎn)基因楊樹處理組出現(xiàn)第1例死亡，轉(zhuǎn)基因楊樹和發(fā)酵牛糞處理組無死亡個體。隨著試驗的進行，各處理組均出現(xiàn)零星死亡情況，至試驗84天時3個處理組均出現(xiàn)死亡個例，隨著試驗時間增加，各處理組存活率均略有所下降，至試驗結(jié)束時(140天)轉(zhuǎn)基因楊樹組赤子愛勝蚓存活率為86.67%±4.36%，對照楊樹組存活率為86.67%±11.55%，兩者間無顯著性差異(P>0.05)。長期生活在轉(zhuǎn)基因楊樹葉片環(huán)境中的赤子愛勝蚓，相比對照非轉(zhuǎn)基因楊樹，存活情況未受影響。

表2 不同處理組赤子愛勝蚓的存活率Tab.2 Survival rates of E. foetida in different treatments %

每隔14天稱量各處理組蚯蚓體質(zhì)量(圖1)，在試驗0～84天，每處理組蚯蚓處在發(fā)育期，均快速生長，98天后處于平緩期，體質(zhì)量變化波動不大。10次測定中，轉(zhuǎn)基因楊樹和非轉(zhuǎn)基因處理組蚯蚓平均體質(zhì)量均無顯著性差異(P>0.05)。在試驗前期，發(fā)酵牛糞組蚯蚓體質(zhì)量增加最快，在42天時體質(zhì)量顯著高于2個楊樹處理組(P<0.05)，而隨著試驗時間的增加，3個處理組體質(zhì)量差異逐漸變小，到112天時，3個處理組體質(zhì)量基本相當(dāng)，表明2個楊樹處理組的營養(yǎng)能夠滿足蚯蚓生長所需。

圖1 不同處理組赤子愛勝蚓體質(zhì)量變化Fig. 1 Average weight of E. foetida in different treatments不同小寫字母表示同一調(diào)查點的不同處理在0.05水平上差異顯著。下同。Different small letters indicate significant difference at 0.05 level among the three treatments in the same time. The same below.

2.2 轉(zhuǎn)基因楊樹葉片對蚯蚓繁殖的影響

在本試驗的第28天，3個處理組赤子愛勝蚓均開始繁殖，在葉片土壤混合基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)蚓繭，在28～140天共計9次調(diào)查中，發(fā)酵牛糞組產(chǎn)繭數(shù)有7次高于轉(zhuǎn)基因楊樹和非轉(zhuǎn)基因組，其中56天時顯著高于2個楊樹處理組(P<0.05)(圖2)。轉(zhuǎn)基因楊樹組和非轉(zhuǎn)基因楊樹組在各調(diào)查期蚓繭數(shù)產(chǎn)量趨勢一致，在絕大部分時期數(shù)值接近且均無顯著性差異，僅在70天時非轉(zhuǎn)基因楊樹組蚓繭數(shù)顯著高于轉(zhuǎn)基因楊樹組，結(jié)合56天和84天轉(zhuǎn)基因楊樹組蚓繭數(shù)高于非轉(zhuǎn)基因楊樹組，推測是蚯蚓繁殖的生理波動。統(tǒng)計整個試驗期各處理總繁殖蚓繭數(shù)，發(fā)酵牛糞組為(104.33±6.60)個，轉(zhuǎn)基因楊樹組為(87±2.62)個，非轉(zhuǎn)基因楊樹組為(90.33±3.41)個，轉(zhuǎn)基因楊樹和非轉(zhuǎn)基因楊樹組無顯著性差異(P>0.05)。

圖2 不同處理組單條蚯蚓平均產(chǎn)繭數(shù)Fig. 2 Average cocoon numbers in different treatments(per earthworm)

由于蚓繭孵化周期較長，每隔14天將蚓繭移除試驗體系，因此在140天式驗中，未在混合基質(zhì)中檢獲到新生幼蚓，利用84天檢獲的蚓繭，調(diào)查了3個處理組蚓繭孵化率和平均每繭新生蚓數(shù)量，結(jié)果顯示蚓繭孵化率和每繭新生幼蚓數(shù)量均為發(fā)酵牛糞處理組最高，但蚓繭孵化率和每繭新生幼蚓數(shù)量在3個處理組間均無顯著差異(表3)。和非轉(zhuǎn)基因楊樹相比，轉(zhuǎn)基因楊樹未對赤子愛勝蚓蚓繭內(nèi)受精個體數(shù)量和蚓繭孵化率產(chǎn)生不利影響。

表3 不同處理組蚓繭孵化的情況①Tab.3 Cocoon hatchability in different treatments

2.3 轉(zhuǎn)基因楊樹葉片處理下赤子愛勝蚓解毒抗氧化酶等生化酶活性變化

在成熟蚯蚓140天試驗結(jié)束后，各處理組赤子愛勝蚓的體內(nèi)總蛋白、SOD、GST和AchE酶活性均無顯著差異。剛孵化7天幼蚓體內(nèi)總蛋白、GST和AchE活性在3個處理組間無顯著性變化，但轉(zhuǎn)基因楊樹組和非轉(zhuǎn)基因楊樹組SOD酶活性顯著高于牛糞組(P<0.05)(表4)。

表4 各處理組蚯蚓體內(nèi)總蛋白和生化酶活性變化Tab.4 The total protein content， and activities of AchE, GST and SOD in earthworms in different treatments

2.4 葉片土壤混合基質(zhì)中和赤子愛勝蚓體內(nèi)外源Cry1Ac蛋白含量

在0、14、84和140天測定轉(zhuǎn)基因楊樹處理組葉片土壤混合基質(zhì)中外源Cry1Ac蛋白的含量。表5表明Cry1Ac蛋白在混合基質(zhì)中快速降解，14天含量僅為初始含量61.92%，84天和140天混合基質(zhì)中外源Cry1Ac蛋白含量分別為試驗開始劑量的43.32%和35.94%，同時140天時蚯蚓腸道排泄物也檢測出Cry1Ac蛋白。因此每次調(diào)查后繼續(xù)向試驗體系中添加新的基質(zhì)(葉片碎片和發(fā)酵牛糞)是必要的，保證了受試赤子愛勝蚓處在轉(zhuǎn)基因楊樹葉片和外源蛋白環(huán)境中，同時又是蚯蚓物質(zhì)能量來源。試驗結(jié)束后，赤子愛勝蚓全組織勻漿液中未檢測到外源蛋白的存在，可以認為長時間暴露在高含量轉(zhuǎn)基因楊樹葉片的環(huán)境中，外源Cry1Ac蛋白不會在赤子愛勝蚓體內(nèi)蓄積。

表5 轉(zhuǎn)基因楊樹葉片處理組中不同材料外源Cry1Ac蛋白含量Tab.5 Amounts of exogenous Cry1Ac protein in different samples in treatments of transgenic poplar leaves

3 討論

我國轉(zhuǎn)基因林木育種一直走在世界前列，已有2個轉(zhuǎn)Bt基因楊樹品系獲得商品化生產(chǎn)許可，并已推廣一定面積(胡建軍等， 2010)。轉(zhuǎn)基因林木一般為多年生樹木，種植環(huán)境和管理措施與轉(zhuǎn)基因作物截然不同，可以預(yù)見，進入土壤生態(tài)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因林木凋落物總量和影響時間將遠遠大于轉(zhuǎn)基因作物。轉(zhuǎn)基因植物對蚯蚓等土壤生物影響已成為轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全評價的重要方面，轉(zhuǎn)基因作物對蚯蚓影響已有較多的報道，大部分報道顯示不論是以Bt蛋白還是以轉(zhuǎn)基因作物殘體飼喂蚯蚓，對成蚓生長、繁殖均無顯著不利影響(肖能文等, 2005; Clarketal., 2006； Schraderetal., 2008； 劉凱等, 2015)。Zeilinger等 (2004)調(diào)查了長期種植轉(zhuǎn)基因玉米(Zeamays)的美國西部農(nóng)田中蚯蚓種群，發(fā)現(xiàn)蚯蚓種類、密度和年齡結(jié)構(gòu)并未受到不利影響。但并不是所有研究均表明轉(zhuǎn)基因植物對蚯蚓無不利影響，van der Merwe等(2012)報道轉(zhuǎn)基因玉米對蚯蚓的繁殖無顯著影響，但成蚓體質(zhì)量顯著降低。Li等(2019)報道從幼蚓階段就飼喂轉(zhuǎn)Bt水稻(Oryzasativa)秸稈對赤子愛勝蚓生長、繁殖無影響，幼蚓的性成熟期縮短； 但發(fā)育成熟赤子愛勝蚓再暴露在轉(zhuǎn)Bt水稻秸稈中對其體質(zhì)量和產(chǎn)繭量均有不利影響。有研究發(fā)現(xiàn)，赤子愛勝蚓長時間多代暴露在轉(zhuǎn)Bt基因玉米秸稈中，各世代受到影響不同且變化巨大，第1代為不利影響，第2代無影響，第3代變?yōu)橛欣绊?Shuetal., 2015)。這些結(jié)果說明外源基因類似的不同轉(zhuǎn)化事件對蚯蚓影響具有多樣性，應(yīng)該根據(jù)個案評價原則進行具體研究。本研究中設(shè)置較高含量楊樹葉片，約為年進入土壤量的20倍，在如此高濃度下，相對非轉(zhuǎn)基因楊樹，飼喂轉(zhuǎn)cry1Ac基因楊樹葉片的赤子愛勝蚓在生長和繁殖方面無顯著差異，說明轉(zhuǎn)cry1Ac基因楊樹對赤子愛勝蚓的生長繁殖無不利影響。

蚯蚓幼蚓生長迅速、代謝旺盛，對環(huán)境中不利因素高度敏感，但因蚓繭孵化時間不一、手檢時易損傷等原因，轉(zhuǎn)基因植物對初孵幼蚓的影響還無深入研究，目前研究方法主要為調(diào)查某一處理階段幼蚓總數(shù)，或待初孵幼蚓生長發(fā)育一段時期后再研究后續(xù)生長發(fā)育影響(Rickettsetal., 2004; Vercesietal., 2006)。本研究通過單繭孵化的方法，研究了轉(zhuǎn)cry1Ac基因楊樹處理下蚓繭孵化率，并對幼蚓(孵化7天)體內(nèi)解毒抗氧化酶活性進行測定，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因楊樹與非轉(zhuǎn)基因楊樹處理在這些指標上均無顯著差異。但幼蚓7天暴露中2個楊樹處理組SOD活性顯著高于發(fā)酵牛糞組，而140天成蚓體內(nèi)SOD酶活性在3個處理組間無顯著差異。劉海濤等(2010)提取了與本研究相同材料的轉(zhuǎn)基因楊樹和非轉(zhuǎn)基因楊樹葉片浸提物，發(fā)現(xiàn)在高濃度條件下2種楊樹提取物對胡蘿卜(Daucuscarota)和白菜(Brassicachinensisvar.communis)幼苗生長均有一定抑制作用?；形镔|(zhì)進入土壤后會直接毒害及抑制土壤動物活動，如巨桉(Eucalyptusgrandis)人工林凋落物浸提液對赤子愛勝蚓生長和生理指標均有顯著不利影響(Zhuetal., 2011; 余俊里等, 2017)。筆者推測是楊樹葉片中化感物質(zhì)影響幼蚓SOD活性，成蚓長時間暴露后逐漸適應(yīng)而未顯示出差異。先前研究轉(zhuǎn)基因棉花(Gossypium)對赤子愛勝蚓SOD酶活性影響時也表明轉(zhuǎn)基因棉花和親本棉花處理組SOD活性顯著高于發(fā)酵牛糞處理組，但兩者間無顯著性差異(Liuetal., 2009; 丁帥等, 2012)。

實質(zhì)等同性原則是轉(zhuǎn)基因生物安全評價的基石，這要求在試驗設(shè)計時要設(shè)置轉(zhuǎn)基因植物的親本或者同類對照，對照親本材料作用是排除植物自身等干擾因素，保證結(jié)果的準確性，本研究中推測楊樹葉片中的化感物質(zhì)會對蚯蚓體內(nèi)SOD產(chǎn)生影響，如果非轉(zhuǎn)基因楊樹材料在酚類化感物質(zhì)上與轉(zhuǎn)基因楊樹差異較大，就會影響試驗結(jié)果，因此轉(zhuǎn)基因植物對環(huán)境安全影響監(jiān)測特別是對非靶標生物毒性研究需考慮轉(zhuǎn)基因組和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M兩者遺傳和性狀背景一致性。目前轉(zhuǎn)基因生物對非靶標生物影響的研究中均設(shè)置了非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M，但部分研究未設(shè)置正常試驗飼養(yǎng)條件下常規(guī)組。與化學(xué)品等有毒性物質(zhì)不同，轉(zhuǎn)基因植物對非靶標生物影響程度低，可能需要長期多代觀察，這要求在試驗設(shè)計時必須考慮在滿足暴露劑量的條件下受試生物的營養(yǎng)需求和環(huán)境條件，全面豐富的營養(yǎng)、適合環(huán)境是受試生物正常生長繁育的關(guān)鍵。當(dāng)營養(yǎng)和環(huán)境需求不能夠滿足時，轉(zhuǎn)基因組和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M正常生理代謝活動特別是生長和繁殖指標均會受到脅迫，會掩蓋轉(zhuǎn)基因植物對非靶標生物可能影響。本研究中設(shè)置了發(fā)酵牛糞常規(guī)對照組，發(fā)酵牛糞的營養(yǎng)成分和可利用率好于楊樹葉片，發(fā)酵牛糞組赤子愛勝蚓的體質(zhì)量和產(chǎn)繭數(shù)均要高于2個楊樹處理組，140天時轉(zhuǎn)cry1Ac基因楊樹組和非轉(zhuǎn)基因楊樹組體質(zhì)量為發(fā)酵牛糞組的91.16%和93.69%，整個試驗期轉(zhuǎn)基因楊樹組和非轉(zhuǎn)基因楊樹組總繁殖蚓繭數(shù)為發(fā)酵牛糞組的83.65%和86.85%。本研究中的試驗體系基本滿足蚯蚓正常生長和繁殖需求。為了避免營養(yǎng)和環(huán)境需求不能夠得到滿足而導(dǎo)致的試驗誤差，建議在轉(zhuǎn)基因植物對非靶標生物影響評價過程中均應(yīng)設(shè)置常規(guī)對照組。

4 結(jié)論

經(jīng)過140天的飼喂試驗初步表明，相對非轉(zhuǎn)基因楊樹，轉(zhuǎn)cry1Ac基因歐洲黑楊(世紀楊)對赤子愛勝蚓的存活、生長(體質(zhì)量變化)、繁殖(產(chǎn)繭量和孵化情況)、體內(nèi)生化酶活性(AchE、SOD和GST)無顯著影響。赤子愛勝蚓長時間取食轉(zhuǎn)基因楊樹葉片，沒有發(fā)現(xiàn)外源Cry1Ac蛋白在蚯蚓體內(nèi)蓄積，表明轉(zhuǎn)cry1Ac基因歐洲黑楊對蚯蚓是安全的。