常玉梅，楊彩英，楊 萌，薛香菊，呂 艷

（山東藥品食品職業(yè)學院，山東威海 264210）

食品微生物檢驗對評價食品衛(wèi)生質(zhì)量、監(jiān)督食品安全有著尤為重要的作用，其結(jié)果的準確性影響結(jié)果報告的判定。菌落總數(shù)定義為食品樣品經(jīng)過處理，在合理的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)后，每克或每毫升食品檢樣中所生長出來的的微生物菌落總數(shù)[1]。菌落總數(shù)是評價食品污染程度、儲存期以及安全性的衛(wèi)生指示菌[2]?！稒z測和校準實驗室能力認可準則》（ISO/IEC 17025：2017）中明確指出實驗室應(yīng)具備對測量結(jié)果進行不確定度評定的能力[3]?！稒z測和校準實驗室能力認可準則在微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用說明》（CNAS-CL01-A001）也指出在微生物檢測中需要對不確定度做出合理評估[4]。不確定度評定是評定結(jié)果可靠性的有效方法。研究按照《測量不確定度的要求》（CNAS-CL01-G003）[5]和 JJF1059.1—2012[6]、GB/T 27418—2017[7]對微生物檢驗中菌落總數(shù)的檢測結(jié)果作不確定度評定。對菌落總數(shù)測定結(jié)果進行不確定度評定是質(zhì)量控制的一部分，對于數(shù)據(jù)的可靠性、結(jié)果的符合性判定具有重要意義[8]。

1 材料與檢測方法

1.1 測試樣品

本測量不確定度評定實例為單一樣品的重復(fù)測量，測試樣品為月餅。《月餅》（GB/T 19855—2015）[9]對菌落總數(shù)做出的要求為符合《食品安全國家標準 糕點、面包》（GB 7099—2015）[10]，最高限量為104CFU/g，所以實驗稀釋度取10-1與10-2。

1.2 材料與設(shè)備

平板計數(shù)瓊脂（250 g，青島海博生物技術(shù)有限公司）；B級潔凈實驗室；高壓蒸汽滅菌器（MSL.N，山東威高集團）；凈化工作臺（SJ-CJ-2FD，蘇州蘇潔）；生化培養(yǎng)箱（SPX-250B-Z，上海博訊）。

1.3 實驗方法

1.3.1 檢測依據(jù)

《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》（GB 4789.2—2016）[1]。

1.3.2 檢測過程

（1）無菌操作稱取25 g月餅于均質(zhì)袋中，加入225 mL生理鹽水進行均質(zhì)，轉(zhuǎn)速8 000～10 000 r/min，時間2 min，制成10-1樣品勻液。

（2）吸取1 mL上述樣品勻液，沿試管壁加入1支無菌試管中（含9 mL生理鹽水），充分混勻，制成10-2樣品勻液。

（3）稀釋時在無菌平皿內(nèi)加入1 mL樣品勻液（2個平行），同時用無菌生理鹽水做空白對照。

（4）每皿傾注20 mL平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（46 ℃左右），轉(zhuǎn)動平皿，使培養(yǎng)基與樣液混合均勻。

（5）平板凝固后，倒置培養(yǎng)，溫度（36±1）℃，時間（48±2）h。

（6）結(jié)果觀察并計算。菌落計數(shù)范圍30～300 CFU/g。

2 數(shù)學模型

（1）只有一個稀釋度（10-3）的菌落在可計數(shù)范圍，則，，例d=10-3。

（2）2個連續(xù)稀釋度（如10-2、10-3）的菌落在可計數(shù)范圍，則為：

式中：N檢樣中菌落總數(shù)，CFU/g；∑C平板菌落總數(shù)的和，CFU/g；n1低稀釋倍數(shù)平板個數(shù)；n2高稀釋倍數(shù)平板個數(shù)；d-稀釋因子（第一稀釋度），例d=10-2。

3 不確定度的評定

菌落總數(shù)檢測的特點是數(shù)據(jù)結(jié)果的發(fā)散性很大，不是正態(tài)分布，而屬于偏態(tài)分布，因此直接通過結(jié)果平均值的計算，得到標準偏差的方法顯得不太合理[11]。所以通常的做法是將結(jié)果取對數(shù)后，再用常規(guī)的貝塞爾方法進行計算[12-13]。

不確定度測量除各種系統(tǒng)因素的影響外，還包括隨機因素的影響[14]。微生物檢測不確定度一般來源于培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、計量器具校準及操作人員技能等[15]。本研究對B類不確定度（樣品處理、稀釋、加樣體積）及A類不確定度（重復(fù)操作）進行分析，見表1。

表1 不確定度匯總表

3.1 標準不確定度估算

3.1.1 樣品處理相對標準不確定度（urel（制備））

制備10-1樣品勻液，主要涉及稱取樣品時電子秤（使用1次）的相對標準不確定度和量取生理鹽水時量筒（使用1次）的相對標準不確定度。

根據(jù)天平制造商的說明書，該天平的分辨力d=0.1 g，區(qū)間半寬度為0.05 g，按矩形分布，按照樣品稱量取25.0 g；根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[16]得知250 mL量筒容量允許誤差為±2.0 mL，取矩形分布[17]。則樣品稱量引入的相對標準不確定度分量為：

3.1.2 遞增稀釋相對標準不確定度（urel（稀釋））

在制備樣品勻液時，主要由1 mL和10 mL移液器引入的不確定度，1 000 μL和10 000 μL移液器的容量允許誤差[18]分別為 ±10 μL 和 ±60 μL，其中10 mL和1 mL移液器各用了1次。

3.1.3 加樣體積相對標準不確定度（urel（加樣））

吸取1 mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，做2個平行，使用1 000 μL移液器2次。加樣時相對標準不確定度為：

3.1.4 A類重復(fù)測量引起的不確定度（urel（A））

按照試驗方法對樣品平行測定10次，檢測數(shù)據(jù)見表2。具體計算如下。

表2 單一樣品重復(fù)測量的計算過程

（1）每次測量結(jié)果均值xi。

（2）取對數(shù)lgxi，計算平均值

（4）數(shù)據(jù)結(jié)果為10次重復(fù)操作的平均值，則為：

3.2 相對合成標準不確定度及擴展不確定度

引起不確定度分量都是相對獨立的，則合成不確定度為：

依據(jù)標準《化學分析測量不確定度評定 》（JJF 1135—2005）[19]， 由 于 置 信 概率p=95%，自由度v=10-1=9，由t分布表可得

3.3 取反對數(shù)，由lgx坐標回到x坐標

由于lgx與x的非線性關(guān)系，不能直接求擴展不確定度U的反對數(shù)[20]，只能給出微生物含量的可能區(qū)間。因此確定lgx的取值范圍為：lgx=3.542 3±0.149 2，即lgx的取值為3.393 1～3.691 5，再取反對數(shù)后可得2.5×103CFU/g≤x≤4.9×103CFU/g。

4 僅A類重復(fù)測量引起的不確定度

在評定不確定度時，不考慮B類各種隨機影響引入的不確定度分量。10次重復(fù)測量的平均值的標準不確定度為：

由于置信概率p=95%，自由度v=10-1=9，由t分布表可得k=2。于是為：

u95=2urel(A)=0.148 4

5 結(jié)論

從不確定度計算結(jié)果可以看出，4種因素對測量結(jié)果均有影響，經(jīng)計算得出，這些分量可以忽略不計。B類不確定度分量對合成不確定度影響較小，A類重復(fù)測量帶來的不確定度分量最大，所以主要考慮重復(fù)操作引起的不確定度，即統(tǒng)計的A類評定測量不確定度是可行的。按照此方法進行菌落總數(shù)的不確定度評定，可減少誤差，提高結(jié)果精確度，對測量指標合格與否提供理論依據(jù)和指導。