張雪玲，臧春華，郭汝悅，段毅超，王延剛，郭中信，張振中，任雪玲

（1. 鄭州大學 藥學院，河南 鄭州 450001；2. 山東京青農業(yè)科技有限公司，山東 濰坊 262512）

三七（Panax notoginseng）為五加科人參屬多年生草本植物，常以根莖入藥，是我國特有的傳統(tǒng)名貴中藥材[1]。近年來，隨著三七藥理活性研究的不斷深入，三七用途已由傳統(tǒng)中醫(yī)藥領域延伸至食品、化妝品等行業(yè)。有數(shù)據(jù)顯示，我國以三七為原料的相關生產企業(yè)超過1 500 家，生產總值超過700億元[2]。三七產業(yè)的快速發(fā)展必然帶動三七種植的規(guī)?；?。受生長環(huán)境限制，三七種植的適宜區(qū)域主要在高海拔的云南省文山州及廣西壯族自治區(qū)靖西市等地。三七種植過程中易誘發(fā)多種病害。其中，以根腐病為最嚴重，由其造成的損失達5%～20%，嚴重者在70%以上，甚至絕收[3]。更為嚴峻的是，三七連作障礙問題日益突出，不僅增加根腐病的發(fā)病率，三七道地產區(qū)種植面積也不斷減少，嚴重制約了三七的產量和品質[4]。雖然學者針對三七連作障礙開展了大量研究工作，并取得了一定進展，但仍未徹底解決該問題。

對于規(guī)?；N植而言，作物連作障礙問題不同程度地普遍存在，已成為限制農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素[5]。盡管連作障礙的產生是多種因素共同作用的結果，但越來越多的研究表明，土壤微生物在其中起著關鍵作用[6]。多項研究發(fā)現(xiàn)，隨著三七連作年限的增加，細菌群落的數(shù)量和多樣性均顯著下降，真菌數(shù)量相對增加，進而造成土壤微生物群落組成及功能失衡，這是造成三七產量下降、死亡率升高的主要原因[6-7]。針對連作障礙土壤進行修復和改良的研究表明，病原性真菌相對豐度增加是三七連作障礙的主要驅動因素，且在土壤中占絕對優(yōu)勢的細菌群落對于真菌的擴增有直接影響。例如，WANG 等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，生物炭可以通過改變土壤微生物群落組成，尤其是增加芽孢桿菌等生防類細菌的相對豐度來緩解三七—土壤的負反饋調節(jié)。因此，增加土壤中益生菌的相對豐度，重塑土壤微生態(tài)平衡是解決三七連作障礙的有效策略。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種在自然界中廣泛存在的革蘭氏陽性細菌，具有無致病性、無環(huán)境污染性、廣譜抗菌活性和極強的抗逆性等優(yōu)點，在農業(yè)領域，特別是肥料相關領域具有廣泛應用[9-11]。大量基礎研究和大田試驗表明，枯草芽孢桿菌可在土壤和植物根際表面大量繁殖，顯著增加土壤肥力，改善土壤結構，有效降低氮揮發(fā)，增加氨氧化細菌、溶桿菌等有益菌的豐度[12]。進一步研究證實，枯草芽孢桿菌生物制劑不僅可以在一定程度上緩解高粱等農作物的連作障礙[13]，而且有助于緩解三七等中藥材連作障礙問題，顯著降低三七病死率[14]。但其作用機制尚不清楚，特別是連作障礙修復后的土壤和首次種植三七的土壤的對比研究未見報道。因此，以2 年生三七為材料，借助Illumina MiSeq 高通量測序技術測定三七根際和根莖內細菌群落組成，探索枯草芽孢桿菌生物菌肥對三七連作障礙的影響，以期為土壤可持續(xù)利用和農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)建立提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 田間試驗設計

以移栽大田1 a的2年生三七作為試驗材料，于云南省文山州苗鄉(xiāng)三七科技有限公司三七連作障礙試驗站（23°42′N、104°16′E）進行三七連作田間試驗。該試驗地屬亞熱帶氣候，冬無嚴寒，夏無酷暑。年均氣溫15～17 ℃，降雨量為1 100～1 319 mm，全年無霜期356 d。按照當?shù)胤N植慣例，在三七移栽前使用氯化苦對連作障礙土壤進行熏蒸。首次種植三七的新鮮土壤不做上述處理。2019 年1 月將三七苗移栽至試驗田中，于當年12 月收獲期采樣，期間進行三七田間常規(guī)種植管理。試驗設置為3 組：首次種植三七對照組（BP）、未施生物菌肥連作障礙對照組（CCO）、枯草芽孢桿菌生物菌肥處理組（MFP）。每個試驗組小區(qū)面積為64 m2，設置6 個重復。各組按當?shù)厣a習慣正常施肥外，MFP 組增施枯草芽孢桿菌生物菌肥（11.2 kg/hm2）。

1.2 三七土壤和三七根莖采集與處理

參照參考文獻[15]的方法采集土壤樣本（sBP、sCCO、sMFP）和三七根莖樣本（pBP、pMFP，CCO 組無三七存活）。采集樣本時，按S 形每組隨機采集6個樣本，除去覆蓋物及表面浮土，將三七根莖整個挖出，輕輕抖動以去除與根系表面松散結合的土壤，將與根系緊密結合的土壤刷下作為待測土壤樣本。每個土壤樣本分為2 份，一份置于-80 ℃冰箱保存，用于土壤細菌DNA 提取及高通量測序；另一份自然風干，用于土壤理化性質測定。采集土壤樣本后的三七根莖，先以流動的自來水快速沖洗，隨后依次用無菌水（30 s）和70%乙醇浸泡（2 min）洗滌；緊接著在含0.1% Tween 80 的2.5% NaClO 溶液中浸泡滅菌5 min；再用70%乙醇浸泡30 s；最后用無菌水洗滌3次以去除消毒劑。處理后的三七根莖組織經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃冰箱備用。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 細菌DNA 提取與PCR 擴增 使用DNA 抽提試劑盒（PowerSoil?DNA Isolation Kit，Mobio，USA）抽提三七根際土壤和根莖內微生物基因組DNA，利用NanoDrop 檢測DNA 的純度和濃度，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的完整性。為避免三七葉綠體和線粒體DNA 干擾，同時盡可能保證測序結果的一致性，根據(jù)參考文獻[16]選擇16S rDNA的V5—V7可變區(qū)序列設計引物，并進行聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）。擴增引物為799F（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′）和1193R（5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′）。PCR擴增程序：95 ℃3 min；95 ℃0.5 min，55 ℃0.5 min，72 ℃0.75 min，27 個循環(huán)；72 ℃10 min。擴增結束后，PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.3.2 高通量測序及數(shù)據(jù)處理 利用DNA 凝膠回收試劑盒回收PCR 擴增產物，經(jīng)NaOH 變性后構建DNA-Seq 文庫。利用Illumina MiSeq 平臺進行高通量測序。所得數(shù)據(jù)經(jīng)拼接和過濾優(yōu)化后進行分類操作單元（Operational taxonomic units，OTU）聚類分析，序列相似度為0.97?；赟ILVA 數(shù)據(jù)庫（silva138/16s_bacteria）進行序列比對；利用Mothur軟 件 計 算Alpha 多 樣 性 指 數(shù)（Chao、Simpson 及Coverage 指數(shù)）；基于Abund_jaccard 距離進行Beta多樣性分析中的主坐標分析（Principal coordinate analysis，PCoA）；利 用 方 差 膨 脹 因 子（Variance inflation factor，Vif）分析進行土壤理化因子的篩選，并利用相關性熱圖（Heatmap）分析土壤理化因子與細菌物種之間的相關性。

1.3.3 土壤理化性質測定 依照參考文獻[17]進行土壤堿解氮（Available N，AN）的測定；依照參考文獻[18]進行土壤有效磷（Available P，AP）的測定；依照參考文獻[19]進行速效鉀（Available K，AK）的測定；依照參考文獻[20]進行土壤pH 值的測定；依照參考文獻[21]進行土壤電導率（Total dissolved solids，TDS）的測定；依照參考文獻[22]進行土壤有機質（Organic matter，OM）的測定；依照參考文獻[23]進行土壤交換性鈣（Exchangeable calcium，E-Ca）和交換性鎂（Exchangeable magnesium，E-Mg）的測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 三七根際土壤和根莖內細菌物種注釋與評估

采用Illumina MiSeq 平臺對3 組土壤樣本（sBP、sCCO、sMFP）和2 組三七根莖樣本（pBP、pMFP）共30 個樣本進行高通量測序，數(shù)據(jù)經(jīng)過濾優(yōu)化后，共獲得2 002 484 條序列，平均序列長度為377 bp。如圖1 所示，基于Shannon 指數(shù)的稀釋曲線隨著樣本序列數(shù)的增加逐漸趨近平緩，表明無論土壤樣本還是三七根莖樣本的測序數(shù)據(jù)均接近飽和，已覆蓋樣本中的絕大多數(shù)物種，可以進行后續(xù)生物信息學分析。

將每個樣本的測序量按最小樣本序列數(shù)進行抽平，然后按照97%相似性進行聚類，共獲得3 529個細菌OTU。其中，土壤樣本和根莖樣本的OTU 數(shù)分別為2 865 個和1 789 個，各組樣本的覆蓋度均大于96%。基于OTU 水平進行Alpha 多樣性評估，結果見表1。對于土壤樣本而言，sMFP 組中反映細菌群落豐富度的Chao 指數(shù)顯著低于sCCO 組（P＜0.05），而與sBP 組相比則無顯著性差異。sMFP 組反映細菌群落多樣性的Simpson 指數(shù)與sCCO 組之間無顯著性差異，但較sBP 組顯著升高。三七根莖樣本pBP 與pMFP 組中Chao 指數(shù) 和Simpson 指數(shù) 均無顯著性差異，表明根莖內細菌群落的Alpha 多樣性無顯著差異。

表1 三七根際土壤與根莖細菌Alpha多樣性評估指數(shù)Tab.1 Alpha diversity evaluation index of rhizosphere soil and rhizome bacteria of Panax notoginseng

2.2 三七根際土壤和根莖內細菌群落物種組成分析

分析樣本中共有或獨有的細菌群落物種數(shù)目，可以考察樣本物種組成的相似性和差異情況?；贠TU 水平進行韋恩（Venn）分析的結果（圖2a）顯示，土壤樣本中sMFP 與sCCO 組共有OTU 數(shù)目為1 294個，2組獨有的OTU 總數(shù)為1 009 個。對sMFP 組與sBP 組進行分析發(fā)現(xiàn)，2 組共有OTU 數(shù)目以及獨有OTU之和分別為928、1 525個。上述結果表明，三七連作障礙土壤經(jīng)枯草芽孢桿菌生物菌肥處理后，細菌群落物種組成發(fā)生了改變。對三七根莖內細菌群落進行Venn 分析的結果（圖2b）顯示，pBP 和pMFP共有的OTU數(shù)目為629個。其中，pBP和pMFP獨有的OTU 數(shù)目分別為843、317 個。上述結果表明，種 植環(huán)境不同，三七根莖內細菌群落組成也不同。

基于門和屬水平對各組樣本的優(yōu)勢菌群進行分析，結果見圖3。在門水平上（圖3a），三七根際土壤和根莖內細菌群落相對豐度最高的3個物種均為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes），但各組樣本優(yōu)勢物種的相對豐度大小有所不同。

在屬水平上（圖3b），各組樣本的優(yōu)勢物種及其相對豐度均存在一定差異。對于根際土壤樣本而言，sBP 組土壤樣本中相對豐度前三的優(yōu)勢菌屬分別為蓋勒氏菌屬（norank_f_norank_o_Gaiellales，8.74%±1.66%）、norank_f_JG30_KF_AS9（6.76%±2.12%）和Gaiella（6.75%±2.28%）；sCCO 組中相對豐度前三的優(yōu)勢菌屬為小單孢菌屬（Micromonospora，7.48%±2.14%）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas，7.12%±3.93%）和假節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter，4.91%±2.34%）；使用枯草芽孢桿菌生物菌肥的sMFP 組土壤樣本中相對豐度前三的優(yōu)勢菌屬分別為芽孢桿菌 屬（Bacillus，8.10%±6.20%）、節(jié) 桿 菌 屬（Arthrobacter，5.37%±2.96%）和假節(jié)桿菌屬（4.99%±0.80%）。與sCCO 組相比，sMFP 組土壤樣本中芽孢桿菌屬、節(jié)桿菌屬相對豐度分別提高了139.30%、37.35%，而且小單孢菌屬的相對豐度下降了75.52%。相對于根際土壤細菌群落而言，根莖內細菌群落組成雖有所不同，但2組之間有一定相似性，其中，pBP 組相對豐度前三的優(yōu)勢菌屬分別為假單胞菌屬（Pseudomonas，5.66%±12.05%）、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium（5.60%±4.34%）和貪食菌屬（Variovorax，5.24%±4.18%）；而pMFP 組樣本中相對豐度前三的優(yōu)勢菌屬依次為假單胞菌屬（11.18%±26.24%）、貪食菌屬（10.12%±7.64%）和Mycobacterium（9.35%±14.76%）。

2.3 三七根際土壤和根莖內細菌群落比較分析

Beta多樣性分析主要用來評估不同組或樣本間的物種組成相似性和差異性。3組土壤樣本中組內細菌群落在PC1 軸（73.32%）和PC2 軸（5.98%）可以較好地聚合，不同組樣本點之間距離相對較大，說明三七連作障礙土壤經(jīng)生物菌肥修復后，細菌群落組成發(fā)生了較大改變，但是與sBP 組的土壤細菌群落組成還是具有一定差異（圖4a）。在2組三七根莖樣本中，pMFP 組樣本的分布相對離散，樣本之間距離也較遠，而pBP 組各樣本之間的距離相對較近（圖4b）。表明三七連作障礙土壤經(jīng)枯草芽孢桿菌生物菌肥修復后，三七根莖內細菌群落結構發(fā)生了變化。

2.4 三七根際土壤和根莖內細菌群落物種差異分析

對三七土壤樣本和根莖樣本進行優(yōu)勢菌屬組間差異顯著性檢驗分析的結果見圖5。土壤樣本中（圖5a），相對豐度前十五的優(yōu)勢菌屬中有14個物種在3組之間具有顯著性差異。與sCCO 組相比，sMFP 組中芽單胞菌屬相對豐度顯著下降，小單孢菌屬相對豐度極顯著下降，而sMFP組與sBP組相比無顯著性差異。在相對豐度前十五的優(yōu)勢菌屬中，sMFP 組中芽孢桿菌屬、假節(jié)桿菌屬、節(jié)桿菌屬和貪食菌屬的相對豐度極顯著高于sBP 組。sBP 組中蓋勒氏菌屬、unclassified_f_Micromonosporaceae、康奈斯氏桿菌屬（Conexibacter）、Gaiella、norank_f_JG30_KF_AS9、norank_f_Gemmatimonadaceae菌屬的相對豐度極顯著高于sCCO 組和sMFP 組。與根際土壤微生物優(yōu)勢菌屬明顯改變不同，三七根莖內物種差異分析結果（圖5b）顯示，pBP 組和pMFP 組根莖內細菌群落中相對豐度前十五的優(yōu)勢菌屬均不具有顯著性差異。

2.5 三七根際土壤和根莖內細菌群落組成與土壤理化性質的冗余（PDA）分析

不同組土壤的各項理化性質不同，具體見表2。與sCCO 組相比，sMFP 組AP、E-Ca 和E-Mg 含量以及TDS呈顯著上升趨勢（P＜0.05），AK含量顯著下降（P＜0.05），而OM、AN 含量與pH 值無顯著性變化。與sBP 組相比發(fā)現(xiàn)，sMFP 組AN、AK、OM 和E-Mg 顯著下降（P＜0.05），AP 和TDS 顯著增加（P＜0.05），而pH值和E-Ca則無明顯變化。

表2 三七根際土壤理化性質Tab.2 Rhizosphere soil physicochemical properties of Panax notoginseng

在土壤理化性質與土壤細菌群落關聯(lián)性分析中，首先通過Vif 進行不同理化因子之間共線性分析，發(fā)現(xiàn)E-Mg 與其他因子之間具有較強的共線性（Vif＞10）。因此，將其去除后再進行后續(xù)RDA 分析，結果見圖6a。其中，土壤中的AK、AN、OM 和E-Ca 與sBP 組土壤細菌群落呈正相關，而TDS 和AP 則與sMFP 組樣本細菌群落呈正相關。相比于其他因素，E-Ca 和pH 值對各組樣本的影響相對較小。

在土壤理化性質與三七根莖細菌群落關聯(lián)性分析中，首先通過Vif 進行不同理化因子之間共線性分析，發(fā)現(xiàn)AN 和E-Mg與其他因子之間具有較強的共線性（Vif＞10）。因此，將其去除后再進行后續(xù)RDA 分析，結果見圖6b。其中，土壤中AK、OM、TDS 和AP 顯著影響三七根莖內細菌群落組成，pBP中大多數(shù)樣本點在AK、OM 上的正方向，而pMFP 樣本點則分布較離散。

2.6 三七根際土壤與根莖內細菌群落的關聯(lián)分析

采用Spearman 相關性系數(shù)將三七根際土壤細菌群落中具有顯著性差異且排名前十的優(yōu)勢菌屬與三七根莖內細菌群落中相對豐度前二十的優(yōu)勢菌屬進行相關性分析，結果見圖7。土壤中芽孢桿菌屬與三七根莖內貪食菌屬呈顯著正相關，而與鞘脂菌屬（Sphingobium）、普雷沃菌屬（Prevotella）呈顯著負相關。此外，根莖內細菌群落中芽孢桿菌屬也與根際土壤細菌群落中的節(jié)桿菌屬和貪食菌屬呈顯著正相關。

3 結論與討論

3.1 枯草芽孢桿菌生物菌肥對土壤理化性質的影響

在農業(yè)可持續(xù)發(fā)展背景下，有效的措施之一就是將某種或幾種有益菌作為微生物肥料用于作物種植。這些微生物肥料除與作物發(fā)生相互作用之外，更直接的作用是影響土壤養(yǎng)分、pH 值、TDS等土壤理化性質，而這些非生物因素同時也會反饋作用于微生物以及作物。在棉花方面的研究也有類似結論，土壤pH 值、有效氮磷比、礦物質元素等與土壤細菌群落多樣性、相對豐度等直接相關[24]。

氮（N）、磷（P）、鉀（K）是提高作物產量，改善作物品質的最主要營養(yǎng)元素，也是目前肥料，尤其是化肥的主要組分。在不同的三七連作研究中，上述營養(yǎng)元素的變化規(guī)律不太一致，這可能與施用肥料的種類有關。本研究中，三七連作障礙土壤經(jīng)枯草芽孢桿菌生物菌肥處理后，P 含量顯著升高，K 含量顯著降低，這與ZHANG 等[25]的在三七種植第1 年，土壤N 含量基本維持不變，P 含量顯著增加，而K 含量明顯減少的結論相似。與sBP 組相比，枯草芽孢桿菌生物菌肥處理后的連作土壤有相對較低的N含量，這或許有望解決連作問題。因為有數(shù)據(jù)顯示，N元素過量會顯著抑制三七光合效率，降低三七皂苷等有效成分的合成[26-27]。

有研究認為，土壤中N 含量增加，會導致TDS增加[28]。但本研究中，經(jīng)枯草芽孢桿菌生物菌肥處理后連作土壤表現(xiàn)出相對較低N 含量的同時，表現(xiàn)出較高的TDS，這可能與菌肥組分有關。除此之外，有研究顯示，隨著三七種植時間的推延，土壤pH 值會明顯下降，而pH 值是影響三七連作微生物群落的主要因素[29]。本研究中，連作土壤經(jīng)枯草芽孢桿菌生物菌肥處理前后pH 值沒有發(fā)生明顯變化，且對根際土壤微生物的影響相較于其他因素而言較弱，這可能與枯草芽孢桿菌生物菌肥具有一定pH值緩沖效應有關。

鈣和鎂不僅是三七生長必不可少的中微量元素，也是影響三七品質的重要因素。例如，鈣可以增加根莖中三七皂苷等活性成分的含量[30]，鎂可以通過增強三七根莖中硝酸還原酶的作用減輕有害金屬鎘的脅迫[31]。鈣、鎂可以被土壤膠體吸附，并通過一定交換劑交換出來后被植物所利用。因此，E-Ca、E-Mg含量是表征土壤供鈣、鎂狀況的主要指標[32]。本研究中，sMFP組土壤中E-Ca與E-Mg的含量較sCCO 組土壤均顯著提高，這有助于三七生長以及有效成分的積累。綜上，連作障礙土壤經(jīng)枯草芽孢桿菌生物菌肥處理后，土壤理化性質發(fā)生了較大改變，這可能是生物菌肥緩解三七連作障礙的作用機制，為進一步優(yōu)化生物菌肥，特別是組分平衡提供了研究方向。

3.2 枯草芽孢桿菌生物菌肥對土壤細菌群落的影響

土壤微生物，尤其是根際土壤微生物對于包括中藥三七在內的所有作物的生長都非常重要，不僅直接影響土壤結構和成分組成，更重要的是促進土壤與作物之間的物質循環(huán)與能量流動[33]。土壤微生物失衡或異常已成為影響作物生長，引發(fā)連作障礙的主要原因[6，34]。TAN 等[35]的研究發(fā)現(xiàn)，三七連作后，根際土壤細菌數(shù)量明顯減少，而且健康三七根際土壤細菌多樣性明顯高于患病三七。因此，有研究者認為額外補充益生菌，通過重塑土壤微生態(tài)可能是解決三七連作障礙的有效策略[36]。

本研究中，與sCCO 組相比，施用益生菌枯草芽孢桿菌后，連作障礙土壤中的芽孢桿菌屬、節(jié)桿菌屬相對豐度分別提高了139.30%、37.35%，而且小單孢菌屬的相對豐度下降了75.52%。這些微生物相對豐度的改變與文獻報道三七根際土壤變化趨勢一致[37]。芽孢桿菌屬、節(jié)桿菌屬等屬于根際土壤促生細菌，不僅能夠改善土壤環(huán)境，促進三七生長，而且能夠產生抗菌物質，抑制在植物根際土壤定殖的病原菌，降低三七病害發(fā)生概率[37-39]。小單孢菌屬等是植物根際常見的病原菌，對于植物根際促生細菌具有明顯的拮抗和抑制作用[40]。有研究表明，在健康三七根際土壤中，益生菌是主要的優(yōu)勢菌群，但是隨著三七連作年限的增加，益生菌數(shù)量及豐度明顯降低，而有害菌逐漸成為優(yōu)勢菌群，最終造成連作障礙的形成[41]。本研究結果表明，枯草芽孢桿菌生物菌肥不僅能夠提高有益菌的相對豐度，而且顯著抑制有害菌的增殖，重塑三七根際土壤微生態(tài)平衡，這可能是其緩解三七連作障礙的主要作用機制之一。

枯草芽孢桿菌處理的MFP 組根際土壤與首次種植的BP 組根際土壤對比結果顯示，2 組根際土壤中的細菌群落也存在一定差異。其中，在相對豐度前十五的優(yōu)勢菌屬中，sMFP 組中芽孢桿菌屬、假節(jié)桿菌屬、節(jié)桿菌屬和貪食菌屬的相對豐度極顯著高于sBP 組，而蓋勒氏菌屬、康奈斯氏桿菌屬、Gaiella、norank_f_JG30_KF_AS9、unclassified_f_Micromonosporaceae和norank_f_Gemmatimonadaceae的相對豐度極顯著低于sBP組。表明經(jīng)枯草芽孢桿菌生物菌肥修復的連作土壤與BP 組土壤之間仍存在一定差異性，但這為土壤修復的進一步優(yōu)化提供了方向。

3.3 枯草芽孢桿菌生物菌肥對三七根莖內細菌群落的影響

植物生長不僅與土壤微生物密切相關，也受植物內生菌組成及數(shù)量的影響。植物內生菌不僅可以作為植物生長調節(jié)劑，參與細胞分裂、固定和轉化營養(yǎng)元素，也會賦予作物特定功能，包括對有毒物質的生物降解，功能性次生代謝產物的轉化等等。不僅如此，在特定條件下，土壤微生物會侵襲植物，甚至轉化為內生菌駐留在植物體內，而受侵襲的植物也可能會通過發(fā)育重編程產生新的代謝通路應答入侵微生物[42]?？莶菅挎邨U菌不僅廣泛存在于土壤，也是植物體內常見的一種內生菌[43]，其生防作用機制不僅包括干預抗生素生物合成通路的直接作用，也包括促進有益微生物增殖的間接機制[44]。本研究不僅從土壤微生態(tài)角度解釋枯草芽孢桿菌緩解三七連作障礙的機制，也從植物內生菌的角度解析枯草芽孢桿菌緩解三七連作障礙的作用機制。

三七植物體內含有大量微生物[45-49]，其群落組成雖受環(huán)境影響，但保持相對穩(wěn)定[50]。本研究得出相似結論，pMFP 組與pBP 組根莖內細菌群落具有較大相似性，其中，Alpha 多樣性以及相對豐度前十五的優(yōu)勢菌屬等均沒有顯著性差異。將根際土壤與根莖內細菌群落進行相關性分析發(fā)現(xiàn)，根莖內細菌群落組成受根際土壤細菌群落的影響，枯草芽孢桿菌生物菌肥的施用會顯著促進根莖內貪食菌屬的增殖。最新研究表明，貪食菌屬在植物—微生物—微生物互作網(wǎng)絡中具有關鍵作用，不僅可以通過調控植物生長激素的分泌維持植物健康，而且還可以逆轉有害微生物群落對植物生長的抑制作用[51]。因此，枯草芽孢桿菌生物菌肥的施用也在一定程度上影響了植物根莖內細菌群落組成的變化以及植物的生長。

綜合以上微生物多樣性分析發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌生物菌肥能夠顯著改變三七根際土壤細菌群落多樣性，促進土壤中節(jié)桿菌屬等益生菌豐度增加，降低小單孢菌屬等有害菌相對豐度，這有助于優(yōu)化土壤微生態(tài)平衡。通過土壤理化因子與細菌群落關聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌生物菌肥處理導致連作障礙土壤理化性質發(fā)生了較大改變。AK、AN、OM、E-Ca 與sBP 組的土壤細菌群落呈正相關，而TDS 和AP 則與sMFP 組樣本呈正相關。除此之外，pMFP 組和pBP 組的根莖內細菌群落比較結果顯示，根莖內細菌群落多樣性無顯著性差異，細菌群落組成具有較好的相似性。這為進一步優(yōu)化生物菌肥配方，以及解決三七連作障礙問題提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。