孫浩月，吳洪斌，李 明，張 琦，韓毅強(qiáng)，杜吉到

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶163319）

蕓豆學(xué)名菜豆（Phaseoluse vulgarisL.），又稱四季豆，屬豆科菜豆屬1 年生草本植物。蕓豆是我國重要的出口小宗糧豆作物，同時(shí)也是黑龍江省種植面積最大的豆類作物之一[1]。蕓豆?fàn)I養(yǎng)豐富，具有良好的保健功能，深受大眾喜愛。

土壤鹽漬化是主要的非生物脅迫之一，NaCl 是土壤中最常見、分布最廣泛的鹽分[2]，同時(shí)鹽脅迫對不同的植物個(gè)體或個(gè)體的不同發(fā)育階段的影響效果不同，處于同一生長發(fā)育階段的個(gè)體對鹽脅迫作出的反應(yīng)也不盡相同[3-4]。鹽脅迫對植物生長的危害主要體現(xiàn)在抑制種子萌發(fā)和生長發(fā)育、影響開花周期、降低結(jié)實(shí)率等方面。此外，鹽脅迫還會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧來應(yīng)對脅迫，大量活性氧給植物帶來了更嚴(yán)重的傷害。為了使植物適應(yīng)鹽堿脅迫環(huán)境，在脅迫條件下更好地生長發(fā)育，一般采用種子處理、施用外源化合物和選育耐鹽品種3類方法來提高植物的鹽耐受能力。施用外源化合物通常是以浸種和種植后施用無機(jī)物或生長調(diào)節(jié)劑等2 種方式，提高植物體內(nèi)必需元素和微量元素的含量，以提高抗氧化酶活性，維持細(xì)胞膜透性和離子平衡，從而緩解鹽脅迫對植物的傷害，提高植物的耐鹽性。

植物生長調(diào)節(jié)劑能夠有效地“掌控”植物的生長和增強(qiáng)其抗逆性[5]。褪黑素是一種新興的調(diào)節(jié)劑，最初發(fā)現(xiàn)于維管植物中，具有多種功能，如可保護(hù)葉綠素、調(diào)節(jié)植物光周期，有類似于生長素（IAA）的結(jié)構(gòu)和功能[6]，具有在組織內(nèi)自由移動(dòng)、直接清除自由基、對光照敏感等特性[7-8]，可以影響多種代謝途徑進(jìn)而提高真菌和高等植物對環(huán)境的耐受性[7，9-11]。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素是一種在植物體內(nèi)含量微少并極其不穩(wěn)定的小分子物質(zhì)，卻在生理調(diào)節(jié)、增強(qiáng)植物抗逆性方面起著非常重要的作用[10-12]。有研究表明，外源褪黑素可有效緩解鹽脅迫所帶來的氧化損傷，其中可有效激活抗氧化酶系統(tǒng)，幫助植物抵御鹽脅迫逆境[13]。李紅杰[14]研究表明，外源褪黑素可有效緩解鹽脅迫對芹菜幼苗生長發(fā)育的影響。其類似的效應(yīng)還在棉花[15]、番茄[16]、苜蓿[17]等多種作物上有所體現(xiàn)。蕓豆耐鹽性較弱，土壤鹽化將對蕓豆的生產(chǎn)力及其營養(yǎng)品質(zhì)造成較大影響[18]，從而制約我國東北地區(qū)特別是黑龍江省和內(nèi)蒙古地區(qū)蕓豆播種面積和產(chǎn)量的進(jìn)一步提高，因此，選育耐鹽蕓豆品種并探究其響應(yīng)鹽脅迫的作用機(jī)制顯得尤為重要[19]。鑒于此，以ZX-YD-008 為供試品種，研究褪黑素浸種對鹽脅迫下蕓豆幼苗生長及生理特性的影響，為褪黑素應(yīng)用到蕓豆抗逆研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料和設(shè)計(jì)

供試材料為蕓豆ZX-YD-008，由國家雜糧工程技術(shù)研究中心提供，處理編號(hào)為R。試驗(yàn)用NaCl 和褪黑素均為分析純，購自Sigma 試劑公司。以預(yù)備試驗(yàn)確定NaCl 處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%，褪黑素處理濃度為0.1 mmol/L。

試驗(yàn)于2020 年在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院大創(chuàng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。將均勻一致的種子用10%次氯酸鈉消毒5 min 后，蒸餾水沖洗干凈，并用無菌濾紙吸干種子表面水分備用。將種子分為2 份，分別浸泡在蒸餾水和0.1 mmol/L 褪黑素溶液中進(jìn)行預(yù)處理，浸種時(shí)間為24 h，然后將種子擺放在裝有草炭土、蛭石（體積比3∶1）的盆缽中，按土壤干質(zhì)量配制成NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的模擬鹽土環(huán)境。播種前保持土壤潮濕，以手捏成團(tuán)、指尖不出漿、松手后不松散為宜，同時(shí)以蒸餾水拌土作為對照，每盆6 株。試驗(yàn)共設(shè)置4 個(gè)處理，分別是蒸餾水浸種+0.4%NaCl 拌土（SR）、褪黑素浸種+蒸餾水拌土（MWR）、褪黑素浸種+0.4% NaCl 拌土（MSR）、蒸餾水浸種+蒸餾水拌土（WR，對照組），3 次重復(fù)，每重復(fù)5 盆，隨機(jī)區(qū)組排列。為保證鹽濃度不變和水分正常供應(yīng)，根據(jù)土壤含水量始終保持田間持水量的80%，每天噴施0.1 mmol/L 褪黑素或者蒸餾水。植株初生真葉完全展開后5、10、15 d，進(jìn)行形態(tài)指標(biāo)、光合指標(biāo)及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定，并取樣保存于-80 ℃冰箱，用于后期生理指標(biāo)的測定。

1.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.1 生長指標(biāo)的測定 植株初生真葉完全展開后每5 d 測定一次，共測定3 次。每處理選取3 株長勢中等的幼苗，采用刻度尺測定株高，按部位將地上部和地下部分開，并用蒸餾水沖洗干凈，吸干表面水分，采用萬分之一天平稱取各部分鮮質(zhì)量，然后各部分于105 ℃殺青30 min，80 ℃烘干至恒定質(zhì)量，得出地上部及地下部干物質(zhì)質(zhì)量。

1.2.2 氣體交換參數(shù)的測定 于取樣當(dāng)天9:00—11：00 采 用 光 合 儀（Li-6400，Li-Cor，Huntington Beach，CA，USA）進(jìn)行測定，每處理取3 株。測定指標(biāo)包括植株葉片凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（Tr）、胞間CO2濃度（Ci）。測定時(shí)光強(qiáng)設(shè)為1 000 μmol/（m2·s），葉片溫度25 ℃，參比室CO2濃度400 μmol/mol。

1.2.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定 選取完全展開的葉片，采用多功能植物測量儀Multispe Q 測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)。包括PS Ⅱ的實(shí)際光合量子產(chǎn)量（ΦPSⅡ）、非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量（ΦNO）、調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量（ΦNPQ）、非光化學(xué)淬滅系數(shù)（NPQ），分別取3次數(shù)據(jù)的平均值進(jìn)行分析。

1.2.4 光合色素的測定 采用乙醇浸提法測定光合色素含量[20]，稱取0.1 g 新鮮葉片，剪碎，置于盛有10 mL 95%乙醇提取液的試管中，封口后置于室溫暗處浸提至葉片組織完全變白，利用分光光度計(jì)將浸提液在665、649、470 nm 的波長下進(jìn)行比色，并計(jì)算光合色素含量，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.5 抗氧化酶活性的測定 采用氮藍(lán)四唑（NBT）光化學(xué)還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性[21]，愈創(chuàng)木酚顯色法測定過氧化物酶（POD）活性[21]，H2O2氧化還原法測定過氧化氫酶（CAT）活性[22]。

1.2.6 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和膜脂過氧化水平的測定

采用酸性茚三酮比色法測定游離脯氨酸含量[23]，考馬斯亮藍(lán)比色法測定可溶性蛋白含量[24]，蒽酮比色法測定可溶性糖含量[25]，硫代巴比妥酸（TBA）法測定丙二醛（MDA）含量；參照張以順[26]的方法用電導(dǎo) 率 儀（DDS-309C，ARK Instruments，Chengdu，China）測量葉片相對電導(dǎo)率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行方差分析，采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素浸種對鹽脅迫下蕓豆葉片光合特性的影響

由圖1 可知，與對照相比，鹽脅迫降低了Pn、Gs、Tr，且隨脅迫時(shí)間的延長，Pn、Gs、Tr 呈不斷下降趨 勢，5～15 d 分 別 降 低17.5%～63.8%、13.6%～76.4%、47.5%～72.3%，而鹽脅迫下Ci 顯著增加且呈緩慢上升趨勢；MSR 處理較SR 處理可明顯提高葉片的Pn、Gs、Tr，分別為7.4%～11.5%、9.3%～20.0%、2.7%～31.3%，Ci 則降低2.4%～9.5%；與對照相比，MSR 處理顯著降低Pn、Gs、Tr，5～15 d 其分別降低11.4%～60.4%、5.6%～71.6%、41.0%～63.7%，而Ci 提高11.1%～53.7%。

2.2 褪黑素浸種對鹽脅迫下蕓豆葉片葉綠素?zé)晒獾挠绊?/h3>

由圖2 可知，與對照相比，鹽脅迫降低ΦPSⅡ和ΦNPQ，5～15 d 其分別降低9.9%～16.6%、2.2%～7.7%，而ΦNO、NPQ 分別提高30.8%～49.1%、4.0%～83.2%；MWR處理與對照相比，ΦPSⅡ隨脅迫時(shí)間延長呈下降趨勢，但10 d 時(shí)ΦPSⅡ高于對照但無明顯差異，而ΦNO、NPQ、ΦNPQ呈緩慢上升趨勢，但其中15 d 的ΦNO以及10 d 的ΦNPQ均低于對照；與SR 處理相比，MSR處理下ΦPSⅡ、ΦNPQ在5～15 d 分別提高2.7%～11.7%、1.6%～3.8%，而ΦNO降低8.9%～15.0%，NPQ 在5、10 d分別降低20.4%、29.2%，而15 d 時(shí)提高13.3%；與對照相比，MSR 處理下ΦPSⅡ、ΦNPQ在5～15 d 分別降低6.8%～11.6%、4.2%～5.0%，ΦNO、NPQ 分別提高7.7%～16.7%、16.5%～54.9%。

2.3 褪黑素浸種對鹽脅迫下蕓豆葉片光合色素含量的影響

由圖3可知，與對照相比，鹽脅迫下光合色素含量均有所降低，葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b 含量在5～15 d 分別減少8.4%～18.7%、1.0%～9.1%、7.8%～16.0%，但葉綠素a/b 值無顯著變化；MWR 處理的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b 含量在5 d 時(shí)均高于對照，在10、15 d時(shí)，除葉綠素b含量外，葉綠素a、葉綠素a+b含量均低于對照；MSR 處理較SR處理提高葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b 含量，分別增加5.9%～7.8%、0.9%～2.7%、4.4%～6.3%，而葉綠素a/b 值增加3.6%～5.1%；與對照相比，MSR處理抑制葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b 含量的增長，其在5～15 d 分別降低2.5%～13.3%、0.2%～6.7%、3.2%～10.7%，而葉綠素a/b值在10、15 d分別降低4.9%、5.9%。

2.4 褪黑素浸種對鹽脅迫下蕓豆葉片抗氧化酶活性的影響

由圖4 可知，與對照相比，鹽脅迫增加SOD、POD、CAT 活性，在5～15 d 分別增加37.0%～84.0%、13.1%～90.4%、26.6%～62.0%；MWR 處理其活性均有不同程度的增加，但其中SOD、POD 活性在15 d時(shí)略低于對照，分別降低4.6%、16.1%；MSR 處理的蕓豆葉片SOD、POD、CAT活性在整個(gè)處理階段均高于SR 處理，在5～15 d 分別增加7.1%～15.3%、2.1%～206.5%、14.4%～27.1%；MSR 處理與對照相比，SOD、POD、CAT 活性分別增加46.8%～112.2%、15.4%～259.4%、57.1%～105.9%。

2.5 褪黑素浸種對鹽脅迫下蕓豆葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和膜脂過氧化的影響

由圖5 可知，與對照相比，鹽脅迫增加了脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量，但其中可溶性蛋白含量在15 d 較對照顯著降低25.1%，而脯氨酸和可溶性糖含量在5～15 d 分別提高32.8%～158.5%、24.2%～112.8%；與對照相比，除15 d 可溶性蛋白含量外，MWR 處理的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量均高于對照；MSR 處理的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量在5～15 d 均高于SR 處理，其中脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量分別提高4.3%～14.4%、8.0%～89.4%、8.9%～30.7%。

與對照相比，SR、MWR 和MSR 處理均提高了MDA 含量和相對電導(dǎo)率，但其增長幅度不同，且MWR 處理的相對電導(dǎo)率在15 d 時(shí)與對照相比無顯著變化。5 d 的MDA 含量在SR、MWR、MSR 處理中分別提高106.5%、54.2%、75.8%，10 d 分別提高123.9%、41.1%、75.9%，15 d 分 別 提 高173.7%、52.6%、56.4%；而5 d 的相對電導(dǎo)率在SR、MWR、MSR 處理中分別提高54.7%、19.3%、27.8%，10 d 分別 提 高123.1%、40.0%、65.6%，15 d 分 別 提 高23.6%、0.4%、17.0%。MSR 處理與SR 處理相比，顯著降低MDA 含量和相對電導(dǎo)率，但仍均高于對照，其 中MDA 含 量 在5、10、15 d 分 別 降 低14.9%、21.4%、42.8%，相對電導(dǎo)率分別降低17.4%、25.8%、5.3%。

2.6 褪黑素浸種對鹽脅迫下蕓豆植株生物量的影響

由表1 可知，鹽脅迫抑制了蕓豆幼苗的正常生長，其株高顯著低于對照，且隨脅迫時(shí)間延長抑制作用明顯。MWR 處理與對照相比，株高略低但變化不大；與SR 處理相比，MSR 處理的株高在5～15 d增加3.1%～8.1%，而MSR 處理與對照相比降低10.5%～11.8%。

表1 不同處理的蕓豆生長和干物質(zhì)積累情況Tab.1 Growth and dry matter accumulation of kidney bean with different treatments

與對照相比，鹽脅迫降低了蕓豆幼苗的地上部和地下部的鮮質(zhì)量與干質(zhì)量，且隨脅迫時(shí)間延長抑制作用明顯，其中地上部和地下部鮮質(zhì)量在5～15 d分別降低23.8%～35.5%、32.9%～37.5%，地上部和地下部干質(zhì)量分別降低19.4%～23.5%、25.0%～28.8%；褪黑素浸種可以有效緩解鹽脅迫對蕓豆幼苗生長的影響，與SR 處理相比，MSR 處理的地上部、地下部鮮質(zhì)量在5～15 d 分別提高6.3%～13.9%、9.1%～18.8%，地上部、地下部干質(zhì)量分別提高8.1%～9.7%、11.9%～16.7%，而MSR 處理與對照相比，蕓豆幼苗的地上部、地下部鮮質(zhì)量分別降低15.8%～26.6%、25.8%～26.8%，地上部、地下部干質(zhì)量分別降低13.0%～16.0%、12.5%～20.3%。

3 結(jié)論與討論

鹽害是限制農(nóng)作物產(chǎn)量的主要環(huán)境因子[27-29]。株高和生物量是衡量逆境脅迫下植物生長發(fā)育的關(guān)鍵指標(biāo)。前人研究表明，褪黑素可以明顯緩解鹽脅迫對棉花[15]、番茄[16]、大豆[30]、水稻[8]等危害，促進(jìn)植株生長。本研究結(jié)果表明，褪黑素浸種明顯提高了株高、地上部及地下部干鮮質(zhì)量，與前人研究結(jié)果一致。其原因可能是褪黑素浸種提高了鹽脅迫下蕓豆葉片的同化力和光合速率，從而提高水分利用率，利于蕓豆幼苗的生長和生物量的積累。

光合作用是植物利用光能驅(qū)動(dòng)有機(jī)化合物合成的物理化學(xué)過程，是植物生產(chǎn)的基礎(chǔ)[31]。植物葉片光系統(tǒng)平衡光能吸收和CO2同化[32]，鹽脅迫影響類囊體膜的電子傳遞、碳的同化和水氣交換等光合過程。前人研究表明，褪黑素的抗氧化能力能防止葉綠素降解，提高光系統(tǒng)Ⅱ的效率[33]。在本試驗(yàn)中，褪黑素浸種提高了光合色素含量，同時(shí)提高了葉片的葉綠素a/b 值，提高了光能利用率，表明褪黑素浸種能夠改善葉片的光能分配，使更多的光能用于碳固定[33-34]。植物在鹽脅迫中的一個(gè)重要響應(yīng)是通過關(guān)閉氣孔以減少水分的流失，同時(shí)伴隨著Pn、Tr、Gs下調(diào)。與此同時(shí)，在本試驗(yàn)中，褪黑素浸種可以緩解鹽脅迫下Pn、Tr、Gs 的下降，同時(shí)降低了Ci，說明鹽脅迫已損傷了光合系統(tǒng)，而褪黑素浸種對鹽脅迫的光合活性下降具有緩解作用，能夠提高鹽脅迫下植物葉肉細(xì)胞的光合能力。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化反映植物葉綠體PSⅠ和PSⅡ（主要是PSⅡ）的光能吸收利用、傳遞及耗散等諸多情況的靈敏探針[35]，逆境條件下引起卡爾文循環(huán)運(yùn)行受阻時(shí)，會(huì)降低光化學(xué)反應(yīng)對葉綠素吸收光能的利用，導(dǎo)致過剩激發(fā)能增加，而引起PSⅡ光抑制[36-37]，ΦPSⅡ、ΦNO、ΦNPQ、NPQ是反映植物葉片PSⅡ活性的重要指標(biāo)，其ΦPSⅡ、ΦNO、ΦNPQ三者總和等于1[38-39]。本研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素浸種可以有效緩解蕓豆葉片ΦPSⅡ和ΦNPQ下降，與之相反，褪黑素浸種降低了ΦNO，說明蕓豆幼苗通過自身保護(hù)性調(diào)控機(jī)制消耗掉過剩的光能而使PSⅡ反應(yīng)中心受傷害的程度降至最低，實(shí)現(xiàn)植株的自我保護(hù)。這可能是通過褪黑素浸種緩解了蕓豆幼苗PSⅡ受到的破壞程度，通過葉黃素循環(huán)、熒光發(fā)射、光呼吸等熱耗散途徑來消耗過剩光能從而緩解鹽脅迫對光抑制的現(xiàn)象[40]。NPQ 表示PSⅡ天然色素吸收的光能中不能用于光合電子傳遞而以熱的形式耗散的部分，是植物的一種自我保護(hù)機(jī)制，對光合機(jī)構(gòu)起一定的保護(hù)作用[41-42]。在本試驗(yàn)中，褪黑素浸種緩解了鹽脅迫下NPQ的升高，從而減少光損傷并提高光能利用率。

當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí)，植物體內(nèi)會(huì)積累大量的活性氧，活性氧產(chǎn)生與清除機(jī)制的失衡會(huì)破損膜組織[43]，而使膜脂過氧化作用加劇。前人研究表明，鹽脅迫提高了蘆葦幼苗的SOD、POD、CAT 活性，噴施外源褪黑素后，SOD、POD、CAT 活性進(jìn)一步顯著升高[44]。王芳等[35]研究表明，與單獨(dú)鹽脅迫處理相比，添加褪黑素處理能夠顯著促進(jìn)玉米幼苗的生長，其幼苗SOD、POD、CAT 活性分別增加13.45%、55.40%、295.86%。本試驗(yàn)研究表明，鹽脅迫明顯提高了蕓豆葉片的活性，褪黑素浸種后鹽脅迫下蕓豆葉片的SOD、POD、CAT活性進(jìn)一步明顯提高。褪黑素通過提高抗氧化酶活性來降低非生物脅迫造成的活性氧積累，從而增強(qiáng)植物的抗逆能力[45]。與此同時(shí)，本試驗(yàn)表明，褪黑素浸種隨著鹽脅迫時(shí)間的延長蕓豆葉片的SOD、POD 活性呈現(xiàn)緩慢升高的趨勢，而CAT 活性呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，表明當(dāng)植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除處于一個(gè)植物自身可修復(fù)的范圍時(shí)，就會(huì)誘導(dǎo)自身酶活性升高，而通過自身保護(hù)性酶系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控，從而減輕植物損傷的程度。

當(dāng)經(jīng)受鹽脅迫，植物體內(nèi)會(huì)積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來降低細(xì)胞的水勢，加強(qiáng)植物保持水的能力，有效地減少因鹽脅迫造成的損害[46]。前人研究表明，褪黑素會(huì)有效增加鹽脅迫下大豆[4]、玉米[35]、菊花[47]、番茄[48]中的脯氨酸和可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，降低MDA含量和相對電導(dǎo)率。在本試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，與鹽脅迫相比，褪黑素浸種增加了蕓豆幼苗脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，MDA 含量和相對電導(dǎo)率明顯下降。說明褪黑素能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢，增強(qiáng)細(xì)胞代謝水平和滲透調(diào)節(jié)能力，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而減輕鹽脅迫對蕓豆幼苗的傷害。

綜上所述，褪黑素浸種緩解了鹽脅迫對蕓豆幼苗的抑制作用，褪黑素通過提高光合色素含量和PSⅡ的光化學(xué)效率以及減緩光合器官的氧化損傷，進(jìn)而緩解由鹽脅迫造成的生物量降低。本試驗(yàn)結(jié)果表明，褪黑素浸種可以有效地增強(qiáng)蕓豆幼苗在鹽脅迫下的光合能力和抗氧化能力，本結(jié)果可以為提高植物耐鹽性和鹽堿地利用效率提供一定的參考和科學(xué)依據(jù)。