孟亞軒，孫穎琦，趙心月，王鳳霞，甕巧云，劉穎慧

（河北北方學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院，河北 張家口 075000）

ASR（Abscisic acid-，stress-，ripening-induced protein）蛋白是植物特異的脅迫反應(yīng)關(guān)鍵調(diào)控因子[1]，在植物糖類代謝、果實(shí)成熟、激素響應(yīng)等過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[2]。ASR 蛋白屬固有無序蛋白質(zhì)，具有高親水性、熱穩(wěn)定性等特點(diǎn)[3]，可作為保護(hù)蛋白維持細(xì)胞離子平衡，也可入核作為調(diào)控蛋白參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、激活下游基因表達(dá)[4]。研究表明，ASR基因可提高植物對逆境的耐受能力[5-9]。二穗短柄草（Brachypodium distachyon）BdASR1-1基因通過誘導(dǎo)非酶抗氧化劑的產(chǎn)生提高二穗短柄草的抗旱能力[6]；海蓬子（Salicornia europaea）SbASR1-1基因可激活活性氧（ROS）清除相關(guān)基因表達(dá)，清除過量積累 的H2O2，抵 御 鹽 脅 迫 傷 害[7]；番 茄（Solanum lycopersicum）SlASR1 蛋白具有分子伴侶活性，能夠防止凍融引起的蛋白質(zhì)失活[8]；玉米（Zea mays）ZmASR3基因通過調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)以及降低胞內(nèi)離子外滲提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的干旱耐受性[9]。ASR 基因在果實(shí)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，過量表達(dá)草莓（Fragaria ananassa）FaASR1基因可促進(jìn)草莓花色苷積累，影響果實(shí)發(fā)育進(jìn)程[10]。

隨著基因組學(xué)的發(fā)展，利用分子生物學(xué)技術(shù)挖掘優(yōu)質(zhì)抗旱基因成為提高作物抗旱豐產(chǎn)能力的主要途徑之一。谷子（Setaria italica）、水稻（Oryza sativa）、高粱（Sorghum bicolor）、玉米、小麥（Triticum aestivum）是我國主要禾本科糧食作物，具有資源廣、產(chǎn)量高等特點(diǎn)，對其進(jìn)行比較基因組學(xué)研究是禾本科糧食作物品質(zhì)改良與分子育種的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[11]。目前，關(guān)于ASR 基因家族全基因組鑒定的研究主要集中于二穗短柄草[6]、草莓[10]上，尚未見關(guān)于上述5種禾本科作物ASR基因家族成員全基因組鑒定和表達(dá)的對比研究。為此，利用生物信息學(xué)方法對上述5 種禾本科作物ASR 基因家族成員進(jìn)行鑒定，并對其序列、系統(tǒng)進(jìn)化、結(jié)構(gòu)域、啟動子及表達(dá)模式進(jìn)行分析，以揭示ASR 家族成員序列特點(diǎn)和表達(dá)特性，為進(jìn)一步研究ASR蛋白功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 ASR家族基因鑒定和序列分析

利用ASR 隱馬模型（PF02496）對谷子、水稻、高粱、玉米、小麥進(jìn)行全基因組掃描，通過SMART 進(jìn)行篩選，去除冗余基因，確定候選ASR 家族成員[12]。使用在線軟件ExPASy、SOPMA 進(jìn)行ASR 蛋白序列解析[13]。利用BatchPrimer 進(jìn)行簡單重復(fù)序列（SSR）分析。

1.2 ASR蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建和共線性分析

利用Clustal 進(jìn)行多序列比對，模式植物煙草（Nicotiana tabacum）、蒺 藜 苜 蓿（Medicago truncatula）作為外類群組參與構(gòu)樹，使用MEGA 7.0軟件繪制ASR 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹（NJ 法，bootstrap 設(shè)置為1 000）[14]。利用DNAMAN 進(jìn)行氨基酸序列比對。使用Ensembl Plants 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行共線性分析，采用TBtools 軟件計算同源基因的非同義替換率與同義替換率的比值，即Ka/Ks。Ka/Ks 用來衡量每個基因?qū)Φ倪x擇壓力，Ka/Ks＜1 為純化選擇，Ka/Ks＞1為正選擇，Ka/Ks=1為中性選擇[15]。

1.3 ASR家族蛋白基序（Motif）、結(jié)構(gòu)域分析和啟動子預(yù)測

利用MEME 在線工具分析ASR 氨基酸基序組成（最小寬度6，最大寬度60，基序檢索上限10）。利用Prosite 分析并繪制ASR 基因家族結(jié)構(gòu)域。使用GSDS 2.0 分析谷子、水稻、高粱、玉米、小麥基因組注釋文件（gff），分析ASR 家族基因結(jié)構(gòu)并進(jìn)行可視化處理[16]。使用Tbtools 軟件將ASR 蛋白進(jìn)化樹、基因結(jié)構(gòu)、基序分布進(jìn)行整合。將ASR 基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 500 bp 核苷酸序列提交至PlantCARE進(jìn)行順式作用元件預(yù)測[17]。

1.4 ASR蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測

使用WoLF PSORT Ⅱ進(jìn)行ASR 蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測，利用PSOET 分析核定位信號（Nuclear localization signal，NLS）類型[18]。

1.5 ASR家族基因表達(dá)模式分析

利用GEO 數(shù)據(jù)庫檢索水稻、高粱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。通過篩選，選擇水稻GSE21494 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得日本晴根、莖、葉、穗的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)；選擇高粱GSE48205 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得R16 盆栽控水干旱14 d、高溫50 ℃處理3 h、盆栽控水3 d 后50 ℃處理3 h 的干旱高溫復(fù)合處理的葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。小麥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來自WheatExp數(shù)據(jù)庫，獲得中國春幼苗20%PEG 干旱處理1 h 和6 h、40 ℃高溫處理1 h 和6 h、高溫干旱復(fù)合處理1 h 和6 h 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及根、莖、葉、穗的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。利用Phytozome 數(shù)據(jù)庫獲得谷子根在氨、尿素、干旱、硝酸鹽脅迫處理時的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。利用qTeller 數(shù)據(jù)庫，獲得玉米B73自交系幼苗冷、熱、鹽、紫外線（UV）脅迫處理的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。將檢索到的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理[19]，使用TBtools繪制熱圖。

為進(jìn)一步分析ZmASR 基因的表達(dá)模式，將B73玉米自交系種植于溫室（16 h 光/8 h 暗，輔以人工照明），溫 度 為 白 天25 ℃/黑 夜18 ℃。 參 考TROUVERIE等[20]的方法對玉米根系進(jìn)行100 μmol/L脫落酸（ABA）、20%PEG6000 處理，分別于0、6、12、18、24 h取根和葉片，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?。將材料研磨后提取總RNA，利用FastQuant RT Kit反轉(zhuǎn)錄為cDNA 用于實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測。使用DNAMAN 設(shè)計引物，選actin為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系參考LIANG等[9]的方法。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 ASR家族基因鑒定及序列分析

2.1.1 ASR 家族基因鑒定及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，谷子、水稻、高粱、玉米、小麥ASR 家族成員數(shù)量分別為7、6、8、9、29 個。ASR 家族基因在染色體上不均勻分布，同時存在成簇分布現(xiàn)象，如SiASR2、SiASR3、SiASR4在谷子5 號染色體中成簇存在。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果（表1）表明，ASR 蛋白分子質(zhì)量小，脂肪系數(shù)小，呈堿性，具有親水性、穩(wěn)定性等特征，二級結(jié)構(gòu)總體以α-螺旋為主，無規(guī)則卷曲次之，β-轉(zhuǎn)角及延伸鏈較少。谷子、水稻、高粱、玉米、小麥ASR 家族成員中，開放閱讀框最長的為SbASR1（2 570 bp），氨基酸最多的為TaASR2（279 aa），分 子 質(zhì) 量 最 大 的 為TaASR1（28.83 ku），理論等電點(diǎn)最高的為ZmASR4（10.56），不穩(wěn)定系數(shù)最高的為ZmASR4（69.65），脂肪系數(shù)最高的為OsASR4（56.95），親水性總均值最低的為TaASR2（-1.760）。

表1 ASR家族成員信息Tab.1 Information about ASR gene family members

續(xù)表1 ASR家族成員信息Tab.1（Continued） Information about ASR gene family members

續(xù)表1 ASR家族成員信息Tab.1（Continued） Information about ASR gene family members

續(xù)表1 ASR家族成員信息Tab.1（Continued） Information about ASR gene family members

2.1.2 ASR 家族基因SSR 分析 SSR 分子標(biāo)記因其多樣性和穩(wěn)定性，廣泛應(yīng)用于基因挖掘、分子育種等領(lǐng)域?；诖耍狙芯坷肂atchPrimer 對鑒定到的ASR 家族成員進(jìn)行SSR 位點(diǎn)挖掘。結(jié)果顯示，ASR 家族成員中有16 個成員鑒定到SSR（表2）。其中，SbASR3基因具有二核苷酸重復(fù)、三核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)3種SSR類型，ZmASR8基因鑒定到二核苷酸重復(fù)、三核苷酸重復(fù)2種SSR 類型，其余成員具有二核苷酸重復(fù)或三核苷酸重復(fù)1種SSR類型。

表2 ASR家族基因SSR分析Tab.2 SSR analysis of ASR family genes

2.2 ASR蛋白進(jìn)化分析

2.2.1 ASR 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建及氨基酸序列分析 為明確ASR 蛋白進(jìn)化模式，選用模式植物煙草、蒺藜苜蓿作為外類群組參與進(jìn)化樹構(gòu)建（圖1）。根據(jù)進(jìn)化樹拓?fù)淝闆r，ASR 蛋白可分為Ⅰ-1、Ⅰ-2、Ⅱ-1、Ⅱ-2 四個亞組，分別占43%、9%、17%、31%。其中，煙草、蒺藜苜蓿ASR 家族成員聚類到Ⅰ-2 亞組，禾本科作物ASR 家族成員聚類到其他亞組。相比煙草、蒺藜苜蓿，禾本科ASR 家族成員關(guān)系更密切，說明ASR 蛋白在進(jìn)化過程中具有種屬特異性特點(diǎn)。

為進(jìn)一步了解ASR 蛋白亞組之間的差異，利用DNAMAN 對ASR 氨基酸序列進(jìn)行比對。由圖2A 可知，Ⅰ、Ⅱ亞組ASR 蛋白氨基酸序列具有較高一致性，均含有1 個ABA/WDS 結(jié)構(gòu)域（a）和1 個C-末端核靶向信號位點(diǎn)（b）。外類群聚類成的Ⅰ-2亞組與其他亞組相比并未出現(xiàn)明顯差異，但Ⅱ亞組中ZmASR2、OsASR5 蛋白發(fā)生了氨基酸位點(diǎn)缺失現(xiàn)象。氨基酸位點(diǎn)保守性分析結(jié)果（圖2B）表明，Ⅰ、Ⅱ亞組ASR 蛋白氨基酸位點(diǎn)具有一定保守性。綜上所述，ASR 蛋白在進(jìn)化過程中具有保守性的同時也存在變異現(xiàn)象。

2.2.2 ASR 家族蛋白基序及結(jié)構(gòu)域分析 由圖3A可知，ASR 基因含有1～3 個外顯子，與目前發(fā)現(xiàn)的其他植物ASR 基因擁有相似的剪切方式?；蚍治鼋Y(jié)果顯示，親緣關(guān)系較近的成員具有相似的基序組合方式，但也存在基序缺失現(xiàn)象，如Ⅰ-1 亞組SbASR1 缺 失 蛋 白 質(zhì) 保 守 基 序2（Motif 2）、CDS（Coding sequence）保守基序3（Motif 3）；Ⅱ-2亞組成員TaASR15 缺失蛋白質(zhì)保守基序4（Motif 4）、CDS保守基序6（Motif 6）。與其他亞組相比，Ⅰ-1 亞組成員蛋白質(zhì)保守基序和CDS 保守基序相似度較高，說明Ⅰ-1 亞組成員進(jìn)化較保守。外類群聚類成的Ⅰ-2 亞組與禾本科作物ASR 家族成員相比并無明顯差異，說明ASR 家族成員在不同物種間的進(jìn)化軌跡具有一致性。ASR 家族蛋白4 個亞組中，Ⅰ-1、Ⅰ-2、Ⅱ-1 亞組的基序組成及分布具有較高一致性，Ⅱ-2亞組相較于其他亞組差異明顯。結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，ASR 家族成員均只含有ABA/WDS 結(jié)構(gòu)域,位于C-末端（圖3B）。

2.2.3 ASR 家族基因共線性分析及進(jìn)化選擇壓力分析 為進(jìn)一步闡述ASR 基因的進(jìn)化起源關(guān)系，對ASR 家族基因進(jìn)行共線性分析，并計算Ka/Ks，部分結(jié)果見表3。進(jìn)化選擇壓力分析結(jié)果表明，大部分ASR 共線基因?qū)a/Ks＜1，說明ASR 基因在進(jìn)化過程中主要受純化選擇。

表3 ASR家族基因進(jìn)化選擇壓力Tab.3 Evolutionary selection pressure of ASR family genes

2.3 ASR家族蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測

蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位與其參與的生化過程密切相關(guān)，為進(jìn)一步研究ASR 蛋白功能，利用WoLF PSORT Ⅱ進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，利用PSOET 進(jìn)行NLS 預(yù)測，部分結(jié)果見表4。鑒定到的59 個ASR 家族成員中，有68%ASR 蛋白定位到細(xì)胞核，32%定位到線粒體，說明大部分ASR 成員為轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控下游基因表達(dá)。鑒定到的ASR 家族成員中46%的成員沒有任何NLS，其余成員只含有1 種或2種NLS。

表4 ASR蛋白亞細(xì)胞定位及NLS預(yù)測Tab.4 Subcellular location and NLS prediction of ASR protein

續(xù)表4 ASR蛋白亞細(xì)胞定位及NLS預(yù)測Tab.4（Continued） Subcellular location and NLS prediction of ASR protein

2.4 ASR基因啟動子分析

利用PlantCARE 在線軟件分析ASR 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 500 bp 核苷酸序列。結(jié)果（圖4）顯示，ASR 基因啟動子區(qū)域含有多種順式作用元件，包括組織特異性元件（如胚乳特異性表達(dá)元件、種子特異性調(diào)控元件）、應(yīng)激響應(yīng)元件（如光響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件）、激素響應(yīng)元件（如ABA 響應(yīng)元件、茉莉酸響應(yīng)元件），暗示ASR 基因參與了植株建成和激素、應(yīng)激等響應(yīng)過程。同時，不同物種ASR 家族成員具有相似的順式作用元件分布情況，如響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)元件、光響應(yīng)元件、茉莉酸響應(yīng)元件在ASR 家族成員中均具有較高的分布。另外，一部分同源基因之間，如TaASR1、TaASR3基因具有類似的順式作用元件；不同亞組基因差異較大，如SbASR1基因較SiASR1基因擁有更多的順式作用元件。

2.5 ASR基因表達(dá)模式分析

不同物種ASR 基因在植株建成過程中表達(dá)差異較大（圖5A—B），水稻ASR 家族成員在葉和根中表達(dá)量較高，小麥ASR 家族成員在葉中表達(dá)量較高。此外，發(fā)現(xiàn)同亞組中部分旁系同源基因具有相似表達(dá)模式，如Ⅱ-2 亞組中TaASR13基因和TaASR20基因。由圖5C可知，玉米ASR家族成員在遭遇不同脅迫時具有不同的表達(dá)模式和響應(yīng)程度。如在遭遇低溫、鹽脅迫時大部分成員上調(diào)表達(dá)，在遭遇高溫、UV 脅迫時大部分成員下調(diào)表達(dá)。同時存在部分特殊基因，如ZmASR3基因在不同脅迫條件下表達(dá)量均較低。在谷子受到氨、干旱等不同脅迫時，ASR基因同樣存在差異表達(dá)現(xiàn)象（圖5D）。由圖5E—F 可知，經(jīng)高溫、干旱及二者復(fù)合脅迫處理后高粱、小麥ASR 家族成員差異表達(dá)，且表達(dá)模式在一定程度上具有相似性。高粱、小麥部分ASR 家族成員在遭遇高溫脅迫時表達(dá)量下調(diào)，在遭遇干旱、干旱和高溫復(fù)合脅迫時表達(dá)量上調(diào)。

為明確ZmASR 基因在不同脅迫條件下的表達(dá)模式，挑選6 個ZmASR 基因進(jìn)行qRT-PCR 分析，結(jié)果（圖6）顯示，ZmASR 基因均受ABA、干旱誘導(dǎo)表達(dá)，但具有表達(dá)特異性。其中，ZmASR7、ZmASR8基因在葉中受到干旱、ABA 誘導(dǎo)時均具有較高表達(dá)量；ZmASR2基因在根中受到ABA 誘導(dǎo)時具有較高表達(dá)量，18 h 達(dá)到峰值；ZmASR3基因在根中受ABA誘導(dǎo)表達(dá)，18 h 達(dá)到峰值；ZmASR1、ZmASR9基因相比其他成員則表達(dá)量較低。說明玉米ASR 家族成員在參與植物響應(yīng)干旱、ABA 脅迫過程中具有不同的表達(dá)策略，且表達(dá)具有組織特異性，存在一定功能分化。

3 結(jié)論與討論

利用生物信息學(xué)方法，在谷子、水稻、高粱、玉米、小麥基因組中分別鑒定到7、6、8、9、29個ASR家族基因，對比鷹嘴豆（10個）、草莓（4個）、蘋果（5個）ASR 家族成員[21]，推測ASR 基因在進(jìn)化過程中發(fā)生了全基因組加倍、串聯(lián)復(fù)制現(xiàn)象[22]。通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，不同物種ASR 基因聚類為不同分支，說明ASR 基因在進(jìn)化過程中不同物種間存在分歧，具有種屬特異性特點(diǎn)。染色體定位結(jié)果顯示，ASR基因存在成簇分布現(xiàn)象，在草莓[10]、蘋果[21]中也出現(xiàn)了此類現(xiàn)象。基因結(jié)構(gòu)是研究基因演變的重要依據(jù)，基因結(jié)構(gòu)的多樣性在進(jìn)化過程中扮演重要角色[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，ASR基因結(jié)構(gòu)具有多樣性，說明這些基因在演變過程中具有不同進(jìn)化軌跡。保守基序分析結(jié)果表明，Ⅰ-1、Ⅰ-2、Ⅱ-1亞組成員的氨基酸基序組成及分布具有較高一致性，Ⅱ-2亞組成員相較于其他亞組成員差異明顯，結(jié)合其基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，說明這2類基因具有相對獨(dú)立的進(jìn)化史，這與LIANG 等[9]、ZAN等[5]相關(guān)研究結(jié)果一致。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，ASR 蛋白大多定位在細(xì)胞核中，但部分ASR 蛋白無NLS，說明ASR 蛋白在沒有NLS的情況下也可通過擴(kuò)散作用進(jìn)入細(xì)胞核作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，ASR 基因分布在不同器官中，在不同物種中具有不同的表達(dá)模式，如TaASR 基因在葉中高表達(dá)，OsASR 基因在葉、根中高表達(dá)，說明ASR 家族成員廣泛參與植物的發(fā)育過程，不同物種間具有特異性，這與LI 等[2]、SACHDEVA 等[1]研究結(jié)果一致。在植物遭遇逆境脅迫時，大部分ASR 基因可被檢測到表達(dá)差異，但響應(yīng)程度不同。如遭遇干旱、高鹽、低溫脅迫時上調(diào)表達(dá)，遭遇UV、高溫脅迫時下調(diào)表達(dá)，但也存在部分基因特異響應(yīng)某種脅迫的情況（如ZmASR5基因在低溫脅迫條件下高表達(dá)，在遭遇其他脅迫時表達(dá)量較低）。qRT-PCR 結(jié)果同樣證明ASR 基因存在表達(dá)差異。植物在響應(yīng)干旱、高鹽等滲透脅迫因子刺激時，內(nèi)源ABA 與PYL（Pyrabactin resistance 1-like）相互作用并激活PP2C（Type 2C protein phosphatases），形 成PYL-ABAPP2C，通過釋放SnRK2（Sucrose non-fermenting 1-related protein kinase 2）誘導(dǎo)下游脅迫響應(yīng)基因表達(dá)[24]。啟動子分析結(jié)果顯示，ASR 基因具有大量ABA 響應(yīng)元件，結(jié)合其在不同植物中受脅迫誘導(dǎo)后表達(dá)模式的相似性，推測ASR蛋白通過響應(yīng)ABA信號改變基因表達(dá)模式參與植物對逆境脅迫的響應(yīng)。