尹保娜，薛文玲，毛曉紅，李瑞敏，安芳，張莉，呂小紅，李玉靜

焦作市婦幼保健院婦瘤科，河南 焦作 454000

子宮內(nèi)膜癌是婦科常見的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升，中晚期子宮內(nèi)膜癌因缺乏有效的綜合治療方法，整體治療效果不佳，因此，尋找有效的早期診斷和治療子宮內(nèi)膜癌的分子標志物有重要意義。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRC3）作為在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的關鍵分子，低表達是結直腸癌發(fā)生發(fā)展的危險因素，但關于NLRC3在子宮內(nèi)膜癌中的表達及作用機制的相關報道較少。本研究檢測NLRC3在子宮內(nèi)膜癌中的表達，分析其及與患者臨床特征和預后的關系，為子宮內(nèi)膜癌的診斷及分子免疫治療提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月至2015年10月在焦作市婦幼保健院接受手術治療且術后病理學檢查證實為子宮內(nèi)膜癌的患者。納入標準：①病歷資料真實完整；②術后病理學檢查證實為子宮內(nèi)膜癌；③術前未接受相關抗腫瘤治療；④無嚴重內(nèi)分泌、免疫及代謝疾病，無其他嚴重合并癥。排除標準：合并其他惡性腫瘤。依據(jù)納入和排除標準，本研究共納入45例子宮內(nèi)膜癌患者，﹤55歲18例，≥55歲27例；未絕經(jīng)11例，絕經(jīng)34例；肌層浸潤深度：≤1/2 36例，﹥1/2 9例；有淋巴結轉移1例，無淋巴結轉移44例；組織學分級：G級12例，G級33例；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期：Ⅰ～Ⅱ期39例，Ⅲ～Ⅳ期6例；遠處轉移1例，無遠處轉移44例。同期選取48例因子宮良性病變（子宮肌瘤23例、異常子宮出血25例）行子宮切除術的患者。

1.2 免疫組化法檢測NLRC 3的表達情況

取45例子宮內(nèi)膜癌患者的子宮內(nèi)膜癌組織及48例子宮良性病變患者的正常子宮內(nèi)膜組織，4%中性甲醛固定，石蠟包埋，3 μm連續(xù)切片，蘇木素-伊紅染色，60℃烤箱烘片4 h，然后脫蠟至梯度酒精水化。采用檸檬酸抗原修復液煮沸2 min進行抗原修復，動物血清封閉、孵育一抗（稀釋濃度為1∶200）、孵育二抗，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復染，封片。結果判定：NLRC3主要定位于細胞質(zhì)，細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒即為陽性，依據(jù)染色強度和陽性細胞所占比例進行評分。依據(jù)染色強度評分：無染色計0分，淺黃色染色計1分，棕黃色染色計2分，棕褐色染色計3分。依據(jù)陽性細胞所占比例評分：陽性細胞所占比例﹤25%計1分，≥25%且﹤50%計2分，≥50%且﹤75%計3分，75%～100%計4分。將染色強度評分和陽性細胞所占比例評分相加，1～3分為陰性、4～5分為弱陽性、6～7分為強陽性。同時，采用Image J軟件測算NLRC3在各子宮內(nèi)膜組織圖片中NLRC3蛋白表達的平均光密度值，即為NLRC3蛋白的相對表達量。

1.3 隨訪

通過電話及門診復查的方式進行隨訪，隨訪時間為患者手術當日至2020年10月，隨訪終點為患者死亡或達到隨訪截止時間，記錄生存情況。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 NLRC 3蛋白表達情況的比較

48例正常子宮內(nèi)膜組織中，NLRC3強陽性表達30例、弱陽性表達10例、陰性表達8例，陽性表達率為83.33%（40/48）；45例子宮內(nèi)膜癌組織中，NLRC3強陽性表達5例、弱陽性表達6例、陰性表達34例，陽性表達率為24.44%（11/45）；子宮內(nèi)膜癌組織中NLRC3蛋白的陽性表達率明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織，差異有統(tǒng)計學意義（χ=32.52，P﹤0.01）。通過Image J軟件分別計算每張圖片中NLRC3的平均光密度值，結果顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中NLRC3的平均光密度值為（159.72±10.32），明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織的（171.83±10.21），差異有統(tǒng)計學意義（t=5.586，P﹤0.01）。（圖1）

圖1 NLRC 3在子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織中的表達情況（免疫組化染色，×200）

2.2 不同臨床特征子宮內(nèi)膜癌患者子宮內(nèi)膜癌組織中NLRC 3表達情況的比較

不同年齡、絕經(jīng)情況子宮內(nèi)膜癌患者子宮內(nèi)膜癌組織中NLRC3平均光密度值和陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）。組織學分級為G級、肌層浸潤深度≥1/2、有淋巴結轉移、有遠處轉移、FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期子宮內(nèi)膜癌患者子宮內(nèi)膜癌組織中NLRC3的平均光密度值分別低于組織學分級為G級、肌層浸潤深度﹤1/2、無淋巴結轉移、無遠處轉移、FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（t=3.75、4.75、6.87、7.54、5.87，P﹤0.05）。組織學分級為G級、肌層浸潤深度≥1/2、有淋巴結轉移、有遠處轉移、FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期子宮內(nèi)膜癌患者子宮內(nèi)膜癌組織中NLRC3陽性表達率分別低于組織學分級為G級、肌層浸潤深度﹤1/2、無淋巴結轉移、無遠處轉移、FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（χ=10.18、10.86、10.45、10.83、2.24，P﹤0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征子宮內(nèi)膜癌患者子宮內(nèi)膜癌組織中NLRC 3表達情況的比較（n=45）

2.3 NLRC 3表達水平對子宮內(nèi)膜癌的診斷價值

ROC曲線結果顯示，NLRC3水平診斷子宮內(nèi)膜癌的AUC為0.865，此時的靈敏度為83.3%、特異度為78.4%、陽性預測值為87.4%、陰性預測值為82.4%，約登指數(shù)為161。（圖2）

圖2 NLRC 3平均光密度值診斷子宮內(nèi)膜癌的ROC曲線

2.4 不同NLRC 3表達情況子宮內(nèi)膜癌患者預后的比較

以ROC曲線中NLRC3平均光密度值診斷子宮內(nèi)膜癌的閾值161為分界，將子宮內(nèi)膜癌患者分為NLRC3低表達組（n=32，NLRC3平均光密度值≤161）和高表達組（n=13，NLRC3平均光密度值﹥161），繪制 Kaplan-Meier曲線，結果顯示，NLRC3高表達組子宮內(nèi)膜癌患者5年生存率為92.31%（12/13），與低表達組患者的93.75%（30/32）比較，差異無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）；NLRC3高表達組子宮內(nèi)膜癌患者平均生存時間為（75.24±3.54）個月，與NLRC3低表達組患者的（77.03±2.31）個月比較，差異無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）。（圖3）

圖3 NLRC 3低表達組（n=32）和高表達組（n=13）子宮內(nèi)膜癌患者的生存曲線

3 討論

子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率僅次于宮頸癌，居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第二位。近年來，雖然子宮內(nèi)膜癌的診斷及治療均取得了一定進展，但因缺乏更有效的治療方案，患者的5年總生存率仍然較低。

作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，模式識別受體與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關。其中核苷酸結合寡聚化結構域樣受體（NOD-like receptor，NLR）在與內(nèi)外源性病原引起的或損傷相關分子模式引起的免疫和炎癥反應中發(fā)揮一定作用。根據(jù)生物學功能的不同，NLR可分為形成炎性小體NLR和非形成炎性小體NLR。其中NLRC3屬于非形成炎性小體，是由第16號染色體基因編碼的胞質(zhì)內(nèi)模式識別受體，是一個龐大的調(diào)節(jié)免疫功能和其他細胞功能的NLR蛋白家族的成員。

作為細胞內(nèi)三大主要信號轉導通路之一，磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy ki-nase，PI3K）/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信號通路在細胞生長、分化、凋亡等方面均發(fā)揮著重要作用，對腫瘤發(fā)生發(fā)展發(fā)揮促進作用，通常在腫瘤發(fā)生發(fā)展的早期即開始啟動。NLRC3對PI3K/MTOR通路有一定的抑制作用，扮演“剎車”角色，該通路下游的MTOR是關鍵激酶，在調(diào)節(jié)腫瘤細胞的存活、生長、增殖和血管生成等生物學作用中發(fā)揮關鍵作用，被認為是腫瘤復發(fā)和轉移的重要因素。而NLRC3通過阻斷PI3K/MTOR信號通路，可抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)及淋巴結轉移等過程，有利于改善預后。

本研究結果顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中NLRC3的平均光密度值明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織，提示在子宮內(nèi)膜細胞增殖的過程中，NLRC3可能發(fā)揮抑癌基因的功能，Ma等通過小干擾RNA技術敲低NLRC3的表達，結果顯示，與對照組細胞相比，人肝癌細胞HepG2和Hep3B的增殖能力均明顯增強。提示NLRC3的正常表達對維持肝細胞穩(wěn)態(tài)增殖從而防止腫瘤發(fā)生有重要作用。本研究結果顯示，NLRC3在有淋巴結轉移、肌層浸潤深度﹥1/2、組織學分級為G級、有遠處轉移、FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期的子宮內(nèi)膜癌患者子宮內(nèi)膜癌組織中的表達水平較低，提示NLRC3低表達可能加速了子宮內(nèi)膜癌細胞對周圍組織的浸潤、淋巴結轉移和遠處轉移，其可能通過靶向調(diào)節(jié)PI3K/MTOR信號通路發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖、轉移的作用。

此外，本研究對NLRC3表達與子宮內(nèi)膜癌患者預后的關系進行分析，結果顯示，NLRC3高表達與低表達子宮內(nèi)膜癌患者的術后5年總生存率無明顯差異，但本研究為樣本量較小的回顧性研究，且納入患者的FIGO分期以Ⅰ～Ⅱ期居多，本身就具有較高的5年生存率，一定程度上可導致患者的5年生存率無明顯差異，因此，本研究的結論尚需更多的前瞻性研究證實。Ma等為進一步推測NLRC3與腫瘤患者生存、預后的關系，對肝細胞癌患者進行研究后發(fā)現(xiàn)，NLRC3高表達患者和低表達患者的5年生存率分別為60.7%和32.8%，表明NLRC3低表達患者的預后較差。已有研究證實，腫瘤的分期與患者的預后密切相關，隨著腫瘤分期的增加，NLRC3的表達水平逐漸降低，分期越晚則患者的預后越差，NLRC3的表達水平與腫瘤的分期相關，因此可以推測NLRC3的表達水平與患者的預后直接相關。近年來，隨著液體活檢技術的推廣及發(fā)展，有望僅通過檢測血液NLRC3的表達水平來對子宮內(nèi)膜癌患者的預后進行預測，使分子免疫治療子宮內(nèi)膜癌成為可能。

本研究結果顯示，NLRC3表達水平達到閾值（平均光密度值為161）時，AUC較高，為0.865，提示NLRC3水平可為子宮內(nèi)膜癌的診斷提供參考，且其診斷的靈敏度和特異度均較好（靈敏度為83.3%、特異度為78.4%）。但本研究納入的樣本量較小，后期尚需更多的大樣本研究來進一步驗證。

綜上所述，NLRC3在子宮內(nèi)膜癌組織中呈低表達，且其低表達預示著患者發(fā)生肌層浸潤、淋巴結轉移和遠處轉移的可能性較大，提示NLRC3低表達在一定程度上加速了子宮內(nèi)膜癌形成和惡性進展。雖然本研究結論未提示5年生存率間的差異，但也提示NLRC3可能作為子宮內(nèi)膜癌患者預后評估的潛在標志物。本研究為非隨機單中心的回顧性研究，研究本身存在各種局限，且納入的樣本量較小，因此，NLRC3與子宮內(nèi)膜癌間的關系還需要大樣本隨機對照研究來進一步證實。