何 璐 朱俐穎 李思琦 陳露萌 曹雅明 朱曉彤

(中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，沈陽 110122)

瘧疾是由媒介按蚊傳播的寄生原蟲感染性疾病。WHO瘧疾報告顯示：2019年全球有2.29億例瘧疾病例，40.9萬人死于瘧疾感染(WHO, 2020)。隨著蚊帳、殺蟲劑和抗瘧藥物的應(yīng)用，瘧疾的發(fā)病率和死亡率逐年下降，但無癥狀感染者對全球瘧疾防控仍具有極大威脅。阻斷瘧疾從宿主到蚊蟲的傳播，是消除瘧疾的一大挑戰(zhàn)(Arakawaetal., 2014)。傳播阻斷疫苗(transmission blocking vaccine, TBV)通過提高人群免疫力，產(chǎn)生特異性抗體，抑制瘧原蟲在蚊體內(nèi)發(fā)育過程，阻斷蚊媒傳播，形成對瘧疾傳播的控制。目前已發(fā)現(xiàn)多種具有傳播阻斷能力的瘧原蟲有性階段特異性抗原，如P48/45、P47、P230、P25/28、HAP2/GCS1、PbPH和PSOP25(Saxenaetal., 2007; Blagboroughetal., 2009; Caoetal., 2016; MacDonaldetal., 2016)。然而，上述傳播阻斷候選抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體均不能完全阻斷瘧原蟲傳播。因此，探索新型瘧疾傳播阻斷候選抗原對于瘧疾的防治仍具有重要意義。

裂殖子、動合子和子孢子發(fā)育階段的原蟲具有運(yùn)動能力。瘧原蟲的運(yùn)動與侵襲依賴頂復(fù)門生物獨(dú)特的滑行運(yùn)動(Dobrowolskietal., 1997)?；瑒芋wglideosome(Opitzetal., 2002))在滑行運(yùn)動中為瘧原蟲提供動力(Dobrowolskietal., 1997)。多項研究發(fā)現(xiàn)，滑動體由肌球蛋白 A(Myosin A，MyoA)、MyoA尾區(qū)相互作用蛋白(MyoA tail domain-interacting protein，MTIP)、滑行相關(guān)蛋白(gliding-associated protein, GAP)GAP40、GAP45、GAP50 等組成(Gaskinsetal., 2004; Baumetal., 2006; Frénaletal., 2010a)。MTIP蛋白通過N端與GAP45蛋白相互作用，并連接GAP40和GAP50蛋白，錨鏈MTIP-ELC-MyoA復(fù)合體至內(nèi)膜復(fù)合體(Inner membrane complex，IMC)(Bergman, 2003; Pazickyetal., 2020)。有性發(fā)育階段的動合子可通過滑行運(yùn)動穿越蚊胃壁形成卵囊，并發(fā)育成子孢子，隨蚊蟲叮咬進(jìn)入人體，導(dǎo)致瘧原蟲的傳播?；诨瑒芋w在動合子遷移和侵襲中的重要作用，滑動體相關(guān)蛋白可作為傳播阻斷疫苗研究的潛在靶點(diǎn)。在3種滑行相關(guān)蛋白中，GAP40和GAP45為原蟲紅內(nèi)期生長必需蛋白。而GAP40蛋白在有性發(fā)育階段中的功能作用尚無研究報道。

本研究利用生物信息學(xué)分析，選取伯氏瘧原蟲GAP40(PlasmoDB ID: PbANKA_1115300，PbGAP40)優(yōu)勢抗原表位片段(329～458 aa)構(gòu)建表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，制備鼠源性多克隆抗體免疫血清，并檢測血清中特異性抗體滴度及特異性。采用IFA檢測PbGAP40蛋白在動合子期原蟲中的亞細(xì)胞定位。同時，評估抗-PbGAP40免疫血清的傳播阻斷活性。本研究旨在為新型傳播阻斷疫苗的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

6～8周齡雌性BALB/c小鼠(北京華阜康公司)，PbANKA瘧原蟲株P(guān)lasmodiumberghei(日本愛媛大學(xué)惠贈)；EasyGeno單片段重組克隆試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、BabyBio Ni-NTA和增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒購自天根公司；限制性內(nèi)切酶Fast DigestBamHⅠ和Fast DigestNotⅠ、6×His-Tag單克隆抗體、Goat anti-Mouse IgG(H+L) Secondary Antibody、HRP、ProLongTMGold Antifade Mountant with DAPI、4×LDS Sample Buffer、Alexa FluorTM488 goat anti-mouse IgG(H+L)、Alexa FluorTM594 goat anti-mouse IgG(H+L)、1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購自ThermoFisher公司；氨芐青霉素、PVDF膜、LB Broth培養(yǎng)基、Tween-20和IPTG購自北京鼎國公司。

1.2 生物信息學(xué)分析

本研究使用的PbGAP40(PlasmoDB ID: PbANKA_111530)基因組序列來自PlasmoDB(http://www.plasmodborg)。利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)，TMHMM v2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)，PRALINE(https://www.ibi.vu.nl/programs/pralinewww/)和SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de/0-Home.htm)分別對PbGAP40功能結(jié)構(gòu)域，蛋白相互作用組、跨膜結(jié)構(gòu)域、同源性以及表位進(jìn)行預(yù)測分析。蛋白同源性分析使用BioEdit7.0.9.0繪制，蛋白示意圖使用IBS 1.0.3軟件繪制。

1.3 pbgpa40基因的擴(kuò)增和原核表達(dá)載體構(gòu)建

以PbANKA原蟲gDNA為模板，使用特異性引物：pET32a-GAP40-BamHⅠ-F：5’-G C C A T G G C T G A T A T C G G A T C C T C T G A A G A T G A A A G A A A A A G A A A A C T GG-3’和pET32a-GAP40-NotⅠ-R:5’-T G G T G G T G C T C G A G T G C G G C C G C T G C T T G A G A A T C A A T A A C C T C C T GC-3’，經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增PbGAP40蛋白329～458 aa片段的編碼基因，獲得的目的片段純化后連接至pET32a(+)原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化。通過測序和酶切鑒定選取陽性克隆后進(jìn)行重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。

1.4 重組蛋白的表達(dá)、純化與實驗動物免疫

選取正確克隆的pET32a(+)-PbGAP40菌種，使用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，19 ℃搖菌過夜表達(dá)重組蛋白。次日收集菌液超聲裂解，收集裂解液，BabyBio Ni-NTA磁珠純化重組蛋白。將提純后的重組蛋白與4×LDS Sample Buffer混合均勻，100 ℃ 3 min煮樣后，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并通過考馬斯亮藍(lán)染色檢測重組蛋白純度。同時，SDS-PAGE分離后的重組蛋白，采用半干法轉(zhuǎn)膜：25 V 30 min至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，一抗6×His Tag 單克隆抗體(1∶2 000)4 ℃過夜孵育。采用Goat anti-Mouse IgG(H+L) Secondary Antibody(HRP)(1∶20 000)室溫孵育1 h。ECL發(fā)光方法檢測重組蛋白表達(dá)情況。

選取20只6～8周齡的雌性BALB/c小鼠，隨機(jī)分為2組：PBS對照組和PbGAP40-his重組蛋白免疫組。初次免疫采用完全弗氏佐劑與重組蛋白(或PBS)1∶1充分混合，50 μg/只，皮下注射。二免和三免為不完全弗氏佐劑和重組蛋白(或PBS)1∶1充分混合，每次免疫間隔14 d。三免后第10天收集小鼠血清，-80 ℃保存。

1.5 ELISA法檢測免疫血清效價

取10 μgPbGAP40重組蛋白加入96孔酶標(biāo)板，室溫過夜包被。每孔加入100 μL含1% BSA的PBS緩沖液封閉，37 ℃孵育l h。將待檢測免疫血清倍比稀釋后，每孔加入100 μL，37 ℃孵育 2 h。PBS-T洗板。加入 HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(1∶5 000)，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h。PBS-T洗板。底物鄰苯二胺和過氧化氫，顯色5 min，加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。采用Bio-Rad酶標(biāo)儀檢測450 nm處OD值。

1.6 伯氏瘧原蟲動合子體外培養(yǎng)

選取6～8周齡BALB/c小鼠，感染前2 d，小鼠腹腔注射6 mg/mL苯肼(200 μL/只)。第0天，采用1×107個PbANKA原蟲，腹腔感染BALB/c小鼠。感染后第3天，口服給予磺胺(20 mg/L)48 h后，殺鼠取血與動合子培養(yǎng)基(RPMI1640，100 mg/L新霉素，50 mg/L鏈霉素，50 mg/L青霉素，20% (V/V) 胎牛血清，pH 8.3)以1∶9比例混合，19 ℃體外培養(yǎng)24 h獲得動合子期原蟲。

1.7 Western blot檢測免疫血清特異性

采用62%的Nycodenz純化收集體外培養(yǎng)的PbANKA蟲株動合子期原蟲，提取蛋白并測定濃度。將原蟲蛋白與4×LDS Sample Buffer混合，在100 ℃水浴鍋煮3 min變性后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離。25 V 30 min半干法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h。一抗：抗- PbGAP40免疫血清(1∶200稀釋)，4 ℃過夜孵育。二抗：HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(1∶20 000)， ECL發(fā)光方法檢測抗-PbGAP40免疫血清的特異性。

1.8 IFA檢測PbGAP40蛋白在動合子期的亞細(xì)胞定位

收集PbANKA動合子期原蟲，4%多聚甲醛/0.0075%的戊二醛室溫固定30 min。PBS洗滌3次后，使用0.1 mg/mL硼氫化鈉中和10 min。PBS洗滌3次后，采用0.1%Triton-100冰上透膜10 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。采用抗-PbGAP40抗體(1∶200)室溫孵育1 h。PBS洗滌5次。采用Alexa FluorTM488 goat anti-mouse IgG(H+L)(1∶500)避光室溫孵育樣本1 h。1 μg/mL DAPI染核10 min后封片。采用共聚焦顯微鏡檢測PbGAP40在動合子期原蟲的定位情況。

1.9 抗-PbGAP40免疫血清對瘧原蟲有性發(fā)育階段抑制效果的檢測

選取6～8周齡BALB/c小鼠，感染前2天，小鼠腹腔注射6 mg/mL苯肼(200 μL/只)。第0天，采用1×107個PbANKA原蟲，腹腔感染BALB/c小鼠。感染后第3天，口服給予磺胺(20 mg/L)48 h后，取10 μL小鼠尾血與90 μL動合子培養(yǎng)基，及1∶5稀釋的抗-PbGAP40免疫血清混合均勻，19 ℃ 24 h孵育后涂片，采用抗-Pbs21抗體(1∶500)染色后，計數(shù)動合子數(shù)目和動合子轉(zhuǎn)化率。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.01軟件進(jìn)行分析繪圖和統(tǒng)計學(xué)分析。血清抗體滴度、動合子數(shù)目和動合子轉(zhuǎn)化率采用Student′sttest進(jìn)行比較；P< 0.05提示組間差異顯著。

表1 PbGAP40相互作用蛋白預(yù)測結(jié)果Tab.1 Putative interactome of PbGAP40

2 結(jié)果

2.1 PbGAP40蛋白的生物信息學(xué)分析

通過SMART軟件預(yù)測繪制PbGAP40蛋白(PlasmoDB ID: PBANKA_1115300) 的模式圖(圖1-A)，并根據(jù)SYFPEITHI軟件分析結(jié)果，選取伯氏瘧原蟲GAP40優(yōu)勢抗原表位(329～458 aa) 構(gòu)建重組蛋白表達(dá)載體(圖1-A)。對GAP40蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹分析(圖1-C)，使用PRALINE對伯氏瘧原蟲GAP40蛋白、約氏瘧原蟲GAP40蛋白(PlasmoDB ID: PY17X_1116500) 和夏氏瘧原蟲GAP40蛋白(PlasmoDB ID: PCHAS_1114900) 進(jìn)行同源性分析(圖1-B)，3種蛋白具有高度同源性(全長同源性97%，329～458 aa同源性96%)。同時，通過STING軟件分析預(yù)測出PbGAP40與多種參與動合子滑行運(yùn)動的蛋白存在相互作用(表1)。

2.2 PbGAP40重組蛋白的表達(dá)和純化及抗-GAP40免疫血清抗體滴度檢測

本研究成功構(gòu)建pET32a(+)-PbGAP40329-458表達(dá)載體，并誘導(dǎo)PbGAP40重組蛋白的表達(dá)。蛋白經(jīng)BabyBio Ni-NTA磁珠純化后，對洗脫及透析后樣品進(jìn)行檢測?？捡R斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示：PbGAP40重組蛋白純度>95%(圖2-A)?？?his-tag抗體檢測顯示：重組蛋白大小約38 kDa(圖2-B)，符合預(yù)期目的蛋白分子量。

圖2 PbGAP40重組蛋白表達(dá)檢測Fig.2 Detection of the PbGAP40 recombinant protein expressionA. PbGAP40-his重組蛋白考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果; B. Western Blot檢測PbGAP40重組蛋白。A.The coomassie blue staining results of PbGAP40-his recombinant protein; B.Western blot detection of PbGAP40 recombinant protein.

圖3 ELISA方法檢測抗-PbGAP40重組蛋白免疫情況和三免后的血清抗體滴度Fig.3 The immunity of PbGAP40 recombinant protein and antibody titer after immunizationdetected by ELISA analysisA. 抗-PbGAP40重組蛋白免疫情況; B. 三免后的抗-PbGAP40免疫血清抗體滴度。A. The immunity of PbGAP40 recombinant protein; B. The antibody titer of anti-PbGAP40 sera post third immunization. *:P < 0.05;**:P < 0.01; ***:P < 0.001; ****:P< 0.0001.

2.3 抗-GAP40免疫血清中特異性IgG抗體的ELISA檢測

BALB/c小鼠經(jīng)PbGAP40-his重組蛋白3次免疫后，與對照組(PBS)相比，血清中特異性抗體水平顯著升高(P<0. 001，圖3-A)，且ELISA結(jié)果顯示，抗-PbGAP40免疫血清的抗體滴度為1∶51200(圖3-B)。

2.4 PbGAP40蛋白在伯氏瘧原蟲動合子期的表達(dá)和亞細(xì)胞定位檢測

Western blot實驗結(jié)果顯示，抗-PbGAP40免疫血清能檢測出動合子期內(nèi)源性GAP40蛋白，具有良好的免疫反應(yīng)性。蛋白大小約為52 kDa， 符合預(yù)期大小上(圖4-A)。IFA結(jié)果顯示：GAP40蛋白熒光信號在伯氏瘧原蟲的合子、retort和成熟的動合子階段均有表達(dá)，且GAP40蛋白的熒光信號定位在原蟲質(zhì)膜(圖4-B)。

2.5 抗-PbGAP40免疫血清對伯氏瘧原蟲動合子發(fā)育的抑制情況

使用含有抗-PbGAP40免疫血清(1∶5倍稀釋，GAP40組)的動合子培養(yǎng)基進(jìn)行伯氏瘧原蟲體外動合子培養(yǎng)24 h后，與PBS免疫血清處理組(PBS組)相比，動合子形成數(shù)減少了36.5%(P<0.05，圖5-A)，動合子轉(zhuǎn)化率下降8.5%(P<0.05，圖5-B)。GAP40處理組中，“retort”發(fā)育階段(未成熟動合子)原蟲的比例占61.2%，成熟動合子比率僅占27.18%(圖5-C)。上述結(jié)果提示，抗-PbGAP40免疫血清可在體外抑制動合子的形成和轉(zhuǎn)化。

圖4 PbGAP40蛋白在動合子期原蟲的表達(dá)和亞細(xì)胞定位Fig.4 The subcellular localization of PbGAP40 protein in ookinetesA. Western blot檢測動合子期PbGAP40蛋白的表達(dá)；B. IFA檢測PbGAP40蛋白在動合子期的亞細(xì)胞定位。Zygote: 合子；Ookinete: 動合子。A. Western blot detection of PbGAP40 in ookinetes; B. IFA detection of the subcellular localization of PbGAP40 protein in ookinetes.

圖5 抗-PbGAP40免疫血清動合子發(fā)育的影響Fig.5 Effect of anti-PbGAP40 serum on ookinete developmentA. 抗-PbGAP40免疫血清對動合子形成數(shù)的影響; B.抗-PbGAP40免疫血清對動合子轉(zhuǎn)化率的影響; C. 抗-PbGAP40免疫血清對合子、retort和動合子占比的影響。A. The effect of anti-PbGAP40 serum on ookinete number; B. The effect of anti-PbGAP40 serum on ookinete conversion rate; C.The Effects of anti -PbGAP40 immune serum on the proportion of zygote, retort and ookinete. PBS: PBS immunized group; GAP40: Recombinant Plasmodium bergheiGAP40 protein immunized group.

3 討論

頂復(fù)門原蟲特殊的滑行運(yùn)動由滑動體提供動力，使原蟲能夠完成遷移、入侵以及逸出感染紅細(xì)胞等多種運(yùn)動模式?；瑒芋w相關(guān)蛋白GAP40、GAP45和GAP50與肌球蛋白MyoA-MTIP復(fù)合體相連，錨定于內(nèi)膜復(fù)合體(inner membrane complex，IMC)膜，組成滑動體(Bergman, 2003)。GAP45橫跨原蟲質(zhì)膜和IMC，其N端經(jīng)肉豆蔻?；妥貦磅；髢A向于定位在質(zhì)膜(Greenetal., 2008; Wrightetal., 2014)，C端特定位點(diǎn)的磷酸化則輔助其定位于IMC膜(Gilketal., 2009)。GAP50通過 C端的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)與IMC結(jié)合，并通過C端6個氨基酸殘基與其他滑動體相關(guān)蛋白產(chǎn)生相互作用(Boschetal., 2012)。GAP40是近年發(fā)現(xiàn)的滑動體相關(guān)蛋白，可與MyoA-MTIP/MLC1-GAP45/50復(fù)合體共同純化(Frénaletal., 2010b)。弓形蟲GAP40蛋白擁有9個跨膜結(jié)構(gòu)域，廣泛地分布在IMC膜，并在IMC的形成和維持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用(Leungetal., 2014)，但GAP40蛋白在瘧原蟲中的作用尚不明確。

本研究中，我們采用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)并純化PbGAP40重組蛋白，通過免疫小鼠獲取抗-GAP40蛋白特異性免疫血清。ELISA實驗結(jié)果提示PbGAP40重組蛋白具有良好的免疫原性，而Western blot結(jié)果顯示抗-PbGAP40免疫血清可特異性結(jié)合內(nèi)源性PbGAP40蛋白。IFA結(jié)果提示PbGAP40蛋白定位于動合子期原蟲的表面。多項研究顯示，動合子表面蛋白為TBV良好的作用靶位，如：抗PSOP25和PSOP28的抗體均可有效降低蚊胃內(nèi)卵囊的形成數(shù)目(Sattabongkotetal., 2003)；抗PSOP12蛋白的免疫血清可減少卵囊密度，且其抑制作用與抗體滴度呈正相關(guān)(Salaetal., 2015)；已進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗的Pvs25疫苗可減少 80%的卵囊形成，降低蚊感染率20%～30%(Malkinetal., 2005)，然而，上述TBV候選抗原均因免疫原性較差，難以在人體免疫后達(dá)到理想的抗體滴度(Duffyetal., 2020)。本研究中，伯氏瘧原蟲GAP40蛋白在鼠瘧模型中顯示出良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性，而其動合子表面定位特點(diǎn)提示PbGAP40可作為傳播阻斷疫苗篩選的潛在靶位。

近年研究發(fā)現(xiàn)，條件性敲除滑動體組成蛋白可影響瘧原蟲紅內(nèi)期生長發(fā)育，如：岡地弓形蟲GAP40和GAP50蛋白敲減可導(dǎo)致IMC缺失，弓形蟲增殖被抑制(Hardingetal., 2016)。條件性敲除惡性瘧原蟲GAP45蛋白后，瘧原蟲喪失侵襲宿主紅細(xì)胞能力，紅內(nèi)期發(fā)育被阻斷(Perrinetal., 2018)。上述結(jié)果均提示滑動體蛋白可作為抗瘧治療的靶點(diǎn)。然而，滑動體蛋白在瘧原蟲有性發(fā)育過程中是否可作為治療靶位尚未明確。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)抗-PbGAP40免疫血清的傳播阻斷效果雖不如PbPSOP25(動合子轉(zhuǎn)化率減少62.5%)等部分已在鼠瘧中研究的TBV候選抗原(Zhengetal., 2017)，但其免疫血清仍可顯著抑制動合子形成數(shù)目和轉(zhuǎn)化率?？梢?，抗-PbGAP40免疫血清對動合子成熟具有顯著的抑制作用。該結(jié)果為開發(fā)GAP40蛋白作為抗瘧治療靶點(diǎn)提供了必要的理論依據(jù)。

綜上所述，本研究成功制備了抗-PbGAP40免疫血清，對PbGAP40在瘧原蟲動合子期原蟲的定位進(jìn)行分析，并對抗-PbGAP40免疫血清的傳播阻斷效應(yīng)進(jìn)行了評估。結(jié)果表明：PbGAP40重組蛋白具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性。抗-PbGAP40 免疫血清具有顯著的傳播阻斷效果，為后續(xù)實驗中深入探討抗-PbGAP40免疫血清對蚊體內(nèi)卵囊和子孢子形成的影響提供了技術(shù)基礎(chǔ)。也為以滑動體蛋白為靶點(diǎn)開發(fā)傳播阻斷疫苗提供了前期實驗基礎(chǔ)。