吳治明 陰 琪 田 野 褚宏亮**

(1.江蘇省疾病預(yù)防控制中心，南京 210009；2.南京醫(yī)科大學(xué)，南京 211166)

三帶喙庫(kù)蚊Culextritaeniorhynchus是我國(guó)流行性乙型腦炎(Japanese B encephalitis，乙腦)的主要傳播媒介，其孳生地多為稻田，廣泛接觸農(nóng)業(yè)用殺蟲(chóng)劑，由于殺蟲(chóng)劑的連續(xù)大量使用，導(dǎo)致了三帶喙庫(kù)蚊抗藥性的發(fā)生和發(fā)展。目前，我國(guó)很多地區(qū)三帶喙庫(kù)蚊幼蟲(chóng)已經(jīng)對(duì)多種殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生了不同程度的抗性(周明浩等，2006；劉洪霞等，2008；王軍浩等，2010；孫養(yǎng)信等，2011；楊維芳等，2011；吳治明等，2013；蔡蓉等，2015；楊迎宇等，2016)。其中江蘇、廣東、海南、陜西、安徽、湖南等6個(gè)省份12個(gè)自然種群三帶喙庫(kù)蚊幼蟲(chóng)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的抗性倍數(shù)在1.70～103.93之間，對(duì)殘殺威的抗藥性倍數(shù)在51.32～108.83之間，對(duì)敵敵畏抗性倍數(shù)在291.85～530.89之間；山東省濟(jì)南市歷城區(qū)三帶喙庫(kù)蚊幼蟲(chóng)對(duì)雙硫磷的相對(duì)抗性倍數(shù)則高達(dá)7977.8倍。

表1 5個(gè)三帶喙庫(kù)蚊種群采集點(diǎn)信息Tab.1 Origins of five populations of Cx. tritaeniorhynchus

蚊蟲(chóng)抗藥性監(jiān)測(cè)是了解其抗藥性發(fā)生發(fā)展的重要手段，監(jiān)測(cè)結(jié)果為殺蟲(chóng)劑的合理使用和蚊蟲(chóng)的科學(xué)防制提供數(shù)據(jù)支撐。在我國(guó)蚊蟲(chóng)抗藥性的常規(guī)監(jiān)測(cè)中，生物學(xué)測(cè)定方法被廣泛推薦使用，具有結(jié)果直觀、方法容易掌握等優(yōu)點(diǎn)，但也存在諸如檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性較差、影響檢測(cè)結(jié)果的因素較多、所需實(shí)驗(yàn)蚊蟲(chóng)數(shù)量多、試驗(yàn)蚊蟲(chóng)飼養(yǎng)困難和生測(cè)過(guò)程工作強(qiáng)度大等缺點(diǎn)。因此，測(cè)試評(píng)價(jià)更加便捷實(shí)用的方法對(duì)于蚊蟲(chóng)抗藥性常規(guī)監(jiān)測(cè)極為必要。此外，隨著對(duì)蚊蟲(chóng)抗藥性分子機(jī)制的深入研究，已證實(shí)可以通過(guò)檢測(cè)蚊蟲(chóng)抗藥性靶標(biāo)基因頻率的方法來(lái)反映其對(duì)相關(guān)殺蟲(chóng)劑的抗性水平(Wuetal., 2016)，且該方法具有監(jiān)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單、蚊蟲(chóng)數(shù)量需求少等優(yōu)點(diǎn)。

本研究采集了我國(guó)東南沿海4個(gè)省份的5個(gè)自然種群三帶喙庫(kù)蚊成蚊，采用美國(guó)CDC生測(cè)瓶法(CDC，2010)測(cè)定其對(duì)2種擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的敏感性，并采用分子生物學(xué)方法檢測(cè)其與擊倒抗性(Knockdown resistance，kdr)相關(guān)的鈉離子通道等位基因頻率。以期了解我國(guó)東南沿海三帶喙庫(kù)蚊抗藥性水平，從而為三帶喙庫(kù)蚊的科學(xué)防制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蚊蟲(chóng)采集

2019年4—9月，在我國(guó)東南沿海的海南、福建、浙江和江蘇等4省共采集了5個(gè)三帶喙庫(kù)蚊野外種群，采集點(diǎn)信息見(jiàn)表1。

采集方法為棲息蚊捕捉法和牛帳誘法。其中QZNA、JHLH、TZPJ和LYGBP種群采用棲息蚊捕捉法采集，即在三帶喙庫(kù)蚊活動(dòng)的高峰時(shí)段(一般在日落前1 h至日落后1 h)，選擇在豬或奶牛的廄舍內(nèi)，手電筒照明，使用電動(dòng)吸蚊器在動(dòng)物廄舍內(nèi)捕獲棲息的蚊蟲(chóng)。HKML種群采用牛帳誘法采集，即在三帶喙庫(kù)蚊活動(dòng)的高峰時(shí)段，選擇在離動(dòng)物廄舍10～20 m的區(qū)域懸掛蚊帳，并將水牛用牛繩固定在帳內(nèi)活動(dòng)，蚊帳懸掛要求為上下四角撐開(kāi)并固定，使蚊帳下緣距地面25 cm 高，采集者手持電動(dòng)吸蚊器和手電筒捕捉蚊帳內(nèi)蚊蟲(chóng)。為減少對(duì)蚊蟲(chóng)的損傷，每次捕獲蚊蟲(chóng)數(shù)量達(dá)50只，便將捕獲的蚊蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至便攜式蚊籠中，將捕獲到的蚊蟲(chóng)帶回實(shí)驗(yàn)室正常飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

殺蟲(chóng)劑：溴氰菊酯，有效成分含量為98%；高效氯氰菊酯，有效成分含量為92%。兩種殺蟲(chóng)劑均由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心提供。實(shí)驗(yàn)試劑：丙酮，分析純；DNA提取試劑盒(DNeasy Blood & Tissue Kit，Cat.No.69506)，QIAGEN，德國(guó)；PCR擴(kuò)增試劑盒(DNA PCR Kit，Cat.No.R011)，TaKaRa，大連。蚊蟲(chóng)采集和抗性生測(cè)的主要器材：蚊帳(規(guī)格：帳頂和帳底均為250 cm×250 cm，頂角至下沿的垂直高度200 cm，帳底開(kāi)口距地面垂直距離25 cm)、電動(dòng)吸蚊器、玻璃吸蚊管、250 mL惠頓瓶(Wheaton bottles)。

1.3 成蚊對(duì)殺蟲(chóng)劑的敏感性測(cè)定

參照美國(guó)CDC生測(cè)瓶法(診斷劑量)，測(cè)定不同種群三帶喙庫(kù)蚊對(duì)溴氰菊酯和高效氯氰菊酯的敏感性，診斷劑量參考WHO推薦的藥膜接觸法中致倦庫(kù)蚊成蚊的診斷劑量，兩種殺蟲(chóng)劑的診斷劑量均為0.05%，接觸時(shí)間均為1 h。

1.3.1測(cè)試瓶藥膜制備 選擇250 mL惠頓瓶(Wheaton bottles)，溫肥皂水清洗后，再用清水沖洗干凈，并充分晾干。根據(jù)殺蟲(chóng)劑使用的診斷劑量，用丙酮配制相應(yīng)濃度的藥液，每個(gè)測(cè)試瓶中加入1 mL藥液，先蓋緊瓶蓋后晃動(dòng)瓶中藥液，使其均勻布滿(mǎn)瓶子內(nèi)壁，然后取下瓶蓋，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)瓶身直到看不到明顯藥液，瓶子完全干燥，在瓶身和瓶蓋上標(biāo)記藥膜濃度和配制時(shí)間，對(duì)照瓶中則只加1 mL丙酮。

1.3.2測(cè)試蚊蟲(chóng)生理狀態(tài)及數(shù)量要求 通過(guò)牛帳誘法或在牲畜廄舍中采集得到的三帶喙庫(kù)蚊可能處于不同的生理狀態(tài)，包括飽血和非飽血蚊。因此，需將蚊蟲(chóng)飼養(yǎng)1～2 d，待血液消化后再進(jìn)行生測(cè)。

1.3.3生測(cè)過(guò)程 使用吸蚊管吸取10～25只雌性三帶喙庫(kù)蚊放入測(cè)試瓶中，立即蓋上瓶蓋并開(kāi)始計(jì)時(shí)，在診斷時(shí)間范圍內(nèi)，每間隔一定時(shí)間，觀察記錄1次蚊蟲(chóng)的擊倒數(shù)。然后將蚊蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至清潔蚊籠中正常飼養(yǎng)，24 h后觀察記錄死亡情況。每個(gè)濃度殺蟲(chóng)劑測(cè)試重復(fù)4次，同時(shí)設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)，如對(duì)照瓶中蚊蟲(chóng)24 h死亡率≥3%時(shí)，重做實(shí)驗(yàn)。

1.4 自然種群kdr等位基因頻率檢測(cè)

1.4.1三帶喙庫(kù)蚊核酸提取，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4.2kdr基因擴(kuò)增 利用特異引物擴(kuò)增各種群三帶喙庫(kù)蚊鈉通道ⅡS4-ⅡS6 區(qū)段DNA 片段，該區(qū)段中的 L1014F突變位點(diǎn)是三帶喙庫(kù)蚊對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑抗性的分子標(biāo)記。上游引物 Tri5：5′-C T T C A C C G A C T T C A T G C A C TC-3′，下 游引物Tri6：5′-G A T T T T G G A C A A A A G C A A G GC-3′。

1.4.3PCR 反應(yīng)及測(cè)序 反應(yīng)總體積 50 μL，包括 Premix Taq(loading dye mix) 25 μL，模板 DNA 4.0 μL，上游引物(10 μmol/L)2.0 μL, 下游引物(10 μmol/L)2.0 μL，去離子水 17 μL。 反應(yīng)條件為 94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，60 ℃，30 s，72 ℃，1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃，7 min；4 ℃保存。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，電泳的條件為120 V，30 mA， 電泳的時(shí)間為25 min。陽(yáng)性結(jié)果直接送上海生工公司測(cè)序。

1.4.4kdr個(gè)體基因型的判讀kdr個(gè)體基因型可以根據(jù)測(cè)序結(jié)果峰圖進(jìn)行判讀。當(dāng)基因型為敏感純合子(SS)或抗性純合子(RR)時(shí)，突變位點(diǎn)峰圖為單峰；當(dāng)基因型為抗性雜合子(SR)時(shí)，突變位點(diǎn)峰圖為雙峰。再結(jié)合堿基序列即可確定kdr個(gè)體基因型。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

三帶喙庫(kù)蚊對(duì)殺蟲(chóng)劑的KT50值采用DPS (v15.10版)軟件計(jì)算，kdr等位基因頻率與KT50值之間的相關(guān)性采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 成蚊對(duì)殺蟲(chóng)劑的敏感性

采用美國(guó)CDC生測(cè)瓶法測(cè)定了5個(gè)種群三帶喙庫(kù)蚊成蚊對(duì)溴氰菊酯和高效氯氰菊酯的敏感性。結(jié)果顯示：5個(gè)三帶喙庫(kù)蚊種群對(duì)0.05%溴氰菊酯的KT50值在2.17～16.96 min之間；接觸1 h后的擊倒率除JHLH種群為98.39%以外，其余種群均為100%；24 h死亡率均為100%。對(duì)0.05%高效氯氰菊酯的 KT50值在3.90～16.23 min之間；接觸1 h后的擊倒率和24 h死亡率均為100%(表2，表3)。

表2 不同種群三帶喙庫(kù)蚊成蚊對(duì)0.05﹪溴氰菊酯的敏感性Tab.2 Sensitivity of the adult Cx.tritaeniorhynchus to permethrin (0.05﹪)

表3 不同種群三帶喙庫(kù)蚊成蚊對(duì)0.05﹪高效氯氰菊酯的敏感性Tab.3 Sensitivity of the adult Cx.tritaeniorhynchus to betacypermethrin (0.05﹪)

2.2 kdr等位基因頻率檢測(cè)結(jié)果

kdr等位基因頻率及個(gè)體基因型頻率的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。各種群三帶喙庫(kù)蚊kdr等位基因頻率在0～38.89%之間，QZNA種群未檢測(cè)到突變個(gè)體，HKML種群只檢測(cè)到1個(gè)RS個(gè)體。從基因型占比來(lái)看，抗性純合子(RR)在各種群中均較少，僅在LYGBP和JHLH種群中檢測(cè)到，兩個(gè)種群中RR個(gè)體在檢測(cè)樣本中所占比例分別僅為7.55%和11.11%；敏感純合子(SS)在各種群中所占比例較高，在55.56%～100%之間，其中QZNA種群所有檢測(cè)個(gè)體基因型均為SS型；雜合子(RS)在各種群中所占比例則為0～33.96%。

表4 5個(gè)野外種群三帶喙庫(kù)蚊 kdr 等位基因頻率Tab.4 Knockdown resistance (kdr) allele frequencies in five Cx.tritaeniorhynchus population

2.3 kdr等位基因頻率與KT50值之間的相關(guān)性分析

將不同種群三帶喙庫(kù)蚊成蚊kdr等位基因頻率與其對(duì)兩種擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的KT50值作相關(guān)性分析。結(jié)果顯示三帶喙庫(kù)蚊成蚊kdr等位基因頻率與其對(duì)溴氰菊酯和高效氯氰菊酯的KT50值之間相關(guān)性顯著，且均為正相關(guān)關(guān)系，即三帶喙庫(kù)蚊成蚊kdr等位基因頻率越高，其對(duì)溴氰菊酯和高效氯氰菊酯的KT50值均越大。其中，kdr等位基因頻率與其對(duì)溴氰菊酯KT50值的相關(guān)系數(shù)為0.892，回歸方程為：y=5.378+30.451x，(P=0.042) (圖1)；kdr基因頻率與其對(duì)高效氯氰菊酯KT50值的相關(guān)系數(shù)為0.903，回歸方程為：y=5.480+27.573x(P=0.013)(圖2)。

圖1 三帶喙庫(kù)蚊 kdr 等位基因頻率與其對(duì)溴氰菊酯半數(shù)擊倒時(shí)間(KT50)之間的回歸曲線(P=0.042)Fig.1 Liner regression between kdr alleles frequency of Cx. tritaeniorhynchus strains and the KT50 value of deltamethrin (P= 0.042)

圖2 三帶喙庫(kù)蚊 kdr 等位基因頻率與其對(duì)高效氯氰菊酯半數(shù)擊倒時(shí)間(KT50)之間的回歸曲線(P =0.013)Fig.2 Liner regression between kdr alleles frequency of Cx. tritaeniorhynchus strains and the KT50 value of betacypermethrin (P = 0.013)

3 討論

目前，在我國(guó)開(kāi)展的三帶喙庫(kù)蚊抗藥性水平的調(diào)查研究中，調(diào)查對(duì)象主要為幼蟲(chóng)，為數(shù)不多的針對(duì)成蚊的調(diào)查研究結(jié)果顯示，各地三帶喙庫(kù)蚊成蚊對(duì)不同種類(lèi)殺蟲(chóng)劑也產(chǎn)生了不同程度的抗藥性。例如山東省歷城區(qū)三帶喙庫(kù)蚊成蚊對(duì)0.05%溴氰菊酯(1 h)和0.05%高效氯氰菊酯(1 h)的24 h死亡率分別為85.0%和74.6%(陳云等，2012)；遼寧省東港市三帶喙庫(kù)蚊成蚊對(duì)0.05%溴氰菊酯(1 h)、0.25%氯菊酯(3 h)、1%殺螟硫磷(1 h)的24 h死亡率分別為15.9%、27.7%和8.2%(靳建超等，2012)。云南省昭陽(yáng)、芒市、江城、孟連和元江等地的三帶喙庫(kù)蚊成蚊對(duì)0.05%溴氰菊酯(1 h)和4.00%DDT(1 h)的24 h死亡率分別在3.31%～59.22%和4.61%～86.76%之間(姜進(jìn)勇等，2015)；江蘇省南京市、湖南省懷化市、廣東省清遠(yuǎn)市、安徽省濉溪市三帶喙庫(kù)蚊成蚊對(duì)0.025%溴氰菊酯(1 h)的24 h死亡率在5.17%～75.25%之間(吳治明，2013)。

本次調(diào)查生測(cè)結(jié)果顯示海口美蘭(HKML)等5個(gè)種群三帶喙庫(kù)蚊成蚊對(duì)0.05%溴氰菊酯和0.05%高效氯氰菊酯的24 h死亡率均為100%。如果按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 26347—2010)(中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部等，2011)的判別標(biāo)準(zhǔn)，即24 h死亡率在98%～100%為敏感種群、在80%～97%表明其為可能抗性種群，<80%為抗性種群的，5個(gè)種群三帶喙庫(kù)蚊均可以判定為對(duì)溴氰菊酯和高效氯氰菊酯敏感。但是從kdr等位基因頻率來(lái)看，除泉州南安種群(kdr等位基因頻率為0)可能對(duì)兩種殺蟲(chóng)劑敏感外，其余5個(gè)種群(kdr等位基因頻率在2.00%～38.89%之間)對(duì)溴氰菊酯和高效氯氰菊酯是具有一定抗性的。

蚊蟲(chóng)抗性生物測(cè)定結(jié)果受到測(cè)定方法、試蟲(chóng)狀態(tài)和測(cè)試環(huán)境等諸多因素的影響。本研究采用美國(guó)CDC生測(cè)瓶法進(jìn)行蚊蟲(chóng)抗性生物測(cè)定，其診斷劑量是參考WHO推薦的藥膜接觸法中致倦庫(kù)蚊成蚊的診斷劑量。兩種方法最大的區(qū)別在于藥劑附著的表面不同，WHO推薦的藥膜接觸法中的藥劑浸潤(rùn)于濾紙中，濾紙相當(dāng)于吸收表面，而美國(guó)CDC生測(cè)瓶法中的藥劑附著于玻璃瓶?jī)?nèi)壁，玻璃內(nèi)壁相當(dāng)于不吸收面，因此，在診斷劑量相同的情況下，美國(guó)CDC生測(cè)瓶法中蚊蟲(chóng)在單位面積接觸到的有效藥量可能要比WHO推薦的接觸法中要高很多，蚊蟲(chóng)死亡率就會(huì)偏高，診斷劑量抗性診斷作用失效，最終導(dǎo)致生物測(cè)定的結(jié)果與抗性基因檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)了不相匹配的情況。但是，從半數(shù)擊倒時(shí)間(KT50值)的角度進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不同種群三帶喙庫(kù)蚊成蚊kdr等位基因頻率與其對(duì)兩種擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的KT50值均呈正相關(guān)關(guān)系，即三帶喙庫(kù)蚊成蚊kdr等位基因頻率越高，其對(duì)溴氰菊酯和高效氯氰菊酯的KT50值均越大。因此，我們認(rèn)為在使用美國(guó)CDC生測(cè)瓶法對(duì)三帶喙庫(kù)蚊成蚊進(jìn)行抗性檢測(cè)時(shí)，0.05%溴氰菊酯(1 h)、0.05%高效氯氰菊酯(1 h)的診斷劑量偏高；此外，在死亡率判定失效的時(shí)候，可以通過(guò)比較KT50值的大小來(lái)比較不同種群之間抗性水平的差異。

參考以往關(guān)于三帶喙庫(kù)蚊幼蟲(chóng)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑抗性水平與kdr等位基因頻率之間關(guān)系的研究結(jié)果，在生物測(cè)定抗性倍數(shù)為1.70～54.70之間時(shí)，其對(duì)應(yīng)的kdr等位基因頻率在1.32～29.55之間(姜進(jìn)勇，2015；Wuetal.，2016)。對(duì)本次研究中生物測(cè)定和抗性分子檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合分析，推測(cè)出泉州南安(QZNA)種群三帶喙庫(kù)蚊對(duì)溴氰菊酯和高效氯氰菊酯還處于相對(duì)敏感階段，?？诿捞m(HKML)種群已經(jīng)產(chǎn)生了部分抗性，臺(tái)州浦江(TZPJ)、連云港板鋪(LYGBP)和金華臨海(JHLH)種群的抗性程度相對(duì)較高。

由于三帶喙庫(kù)蚊極難飼養(yǎng)，其敏感品系成蚊對(duì)殺蟲(chóng)劑的敏感基線或診斷劑量未見(jiàn)報(bào)道，以往的研究通常參考淡色庫(kù)蚊或致倦庫(kù)蚊成蚊的診斷劑量來(lái)對(duì)三帶喙庫(kù)蚊進(jìn)行測(cè)試。由于診斷劑量會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生直接影響，因此，在使用不同的檢測(cè)方法時(shí)應(yīng)先通過(guò)預(yù)試驗(yàn)來(lái)確定一個(gè)相對(duì)合適的診斷劑量。在抗性檢測(cè)的方法中，生物測(cè)定法、生化法和分子生物學(xué)方法各具優(yōu)勢(shì)，互相補(bǔ)充，測(cè)試評(píng)價(jià)簡(jiǎn)單、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的測(cè)試方法極為必要。本研究中兩種抗性檢測(cè)方法均有值得推薦之處，其中分子生物學(xué)方法具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，它不僅可以了解蚊蟲(chóng)抗藥性水平及其動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，還能預(yù)測(cè)蚊蟲(chóng)的抗藥性發(fā)展過(guò)程。美國(guó)CDC生測(cè)瓶法則具有操作簡(jiǎn)單、所需蚊蟲(chóng)數(shù)量相對(duì)較少、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)(Galardoetal.，2015)。

本研究雖涉及到的殺蟲(chóng)劑種類(lèi)較少，還需要開(kāi)展三帶喙庫(kù)蚊成蚊對(duì)其他種類(lèi)殺蟲(chóng)劑的抗性監(jiān)測(cè)研究，但研究結(jié)果同樣可以為上述地區(qū)的三帶喙庫(kù)蚊成蚊防制和農(nóng)藥使用策略提供科學(xué)依據(jù)。在抗性水平較高地區(qū)，當(dāng)有流行性乙型腦炎疫情或三帶喙庫(kù)蚊密度高時(shí)，應(yīng)盡量減少溴氰菊酯和高效氯氰菊酯等擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的大量使用，可以選擇與其他殺蟲(chóng)機(jī)制的殺蟲(chóng)劑輪換使用。