呂 園 邱 樊 張紅波 徐敬薇 沈 波**

(1.南京市第一醫(yī)院，南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，江蘇南京 210006；2.南京醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)系，江蘇南京 210000)

蚊是重要的醫(yī)學(xué)昆蟲，能傳播多種疾病，如瘧疾、登革熱、西尼羅河熱、絲蟲病、黃熱病、寨卡病毒病等，嚴重危害人類健康?；瘜W(xué)防制由于方便、高效和經(jīng)濟等特點，一直是蚊媒綜合治理策略中的重要方法(陸寶麟, 2002)。擬除蟲菊酯類殺蟲劑具有廣譜、高效、低毒和低殘留的特點，是目前蚊媒防制現(xiàn)場應(yīng)用最多的合成殺蟲劑(Sahuetal., 2020)。然而，殺蟲劑長期、大量的使用導(dǎo)致了抗藥性的發(fā)生和發(fā)展。據(jù)報告，自 1947 年首例蚊抗藥性報道以來，至今已有超過 125 種(亞種)蚊蟲對一種或多種殺蟲劑產(chǎn)生了抗性(CfD, 2010)。抗藥性已經(jīng)成為蚊媒和蚊媒病防制工作中的最大障礙(Inghametal., 2020)。

抗藥性是多個基因、多重機制參與的生物進化現(xiàn)象，沒有某一個基因或一類機制能夠完整闡明抗藥性(Ffrench-Constantetal., 2004)。全面系統(tǒng)地尋找蚊抗藥性基因和調(diào)控因子、探尋其參與抗藥性機制，一直是蚊媒防制研究中亟待解決的問題(Itokawaetal., 2019)。本課題組在前期工作中，利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序，從我國分布廣、種群密度高的重要家棲性淡色庫蚊Culexpipienspallens中鑒定出一些溴氰菊酯抗藥性相關(guān)基因，其中包括羧酸酯酶(CPIJ002786-RA，carboxylesterase)。根據(jù)高通量測序結(jié)果，其表達水平在實驗室抗性選育品系較敏感品系高表達2.71倍(P<0.05)，F(xiàn)DR(False Discovery Rate，假陽性率)<0.001。因此，我們預(yù)測淡色庫蚊羧酸酯酶基因(CPIJ002786-RA)可能與溴氰菊酯抗藥性相關(guān)，值得我們進一步探索。本研究采用熒光定量PCR方法檢測羧酸酯酶基因(CPIJ002786-RA)在實驗室抗性選育品系和敏感品系，及山東商河、山東孤島、山東惠民、江蘇江心洲現(xiàn)場抗性株和敏感株的表達水平，旨在探索羧酸酯酶基因(CPIJ002786-RA)作為蚊抗藥性現(xiàn)場檢測靶標的潛在應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 供試蚊采集與飼養(yǎng)

淡色庫蚊實驗室敏感品系為采集于山東省濟寧市唐口地區(qū)(35.12 N；116.50 E)的自然種群，長期飼養(yǎng)于本實驗室，未接觸任何殺蟲劑?？剐赃x育品系是以敏感品系為初始種群，以半數(shù)致死濃度(LC50)的溴氰菊酯經(jīng)多代篩選而成。淡色庫蚊現(xiàn)場種群采集于山東省濟南市商河鎮(zhèn)(37.31 N；117.16 E，Shanghe，SH)、山東省東營市孤島鎮(zhèn)(37.85 N；118.81 E，Gudao，GD)、山東省濱州市惠民鎮(zhèn)(37.49 N；117.51 E，Huimin，HM)和江蘇省南京市江心洲(32.02 N；118.70E，Jiangxinzhou，JXZ)。WHO成蚊接觸筒法(0.05%溴氰菊酯藥膜)區(qū)分現(xiàn)場種群敏感株和抗性株。所有供試蚊飼養(yǎng)于平均溫度 28 ℃， 平均相對濕度 75% 的房間內(nèi)，光照時間為 14 h/d。

1.2 主要試劑和儀器

溴氰菊酯干粉和焦碳酸二乙酯(DEPC)購自美國 Sigma 公司，溴化乙錠(EB)購自中國 SunshineBio 公司，RNAiso Plus、DL2000 DNA Marker和PrimeScriptTM RT Master Mix (Perfect Real Time)購自日本Takara公司，Power SYBR?Green PCR Master Mix 購自美國 ABI 公司，0.05%溴氰菊酯藥膜由馬來西亞理科大學(xué)提供，丙酮、氯仿、異丙醇、乙醇、瓊脂糖等為國產(chǎn)分析純。

ABI Prism?7300型熒光定量 PCR 儀購自美國 ABI 公司，穩(wěn)壓電泳儀購自美國 Bio-Rad 公司，NanoDropTM2000/2000c分光光度計購自美國 Thermo Fisher Scientific 公司。

1.3 蚊幼蟲浸漬法

將溴氰菊酯原藥準確稱重(50 mg)，以丙酮(10 mL)作為溶劑配制成5 000 pmol/L(5 mg/mL)母液。實驗前將母液梯度稀釋至5個不同的濃度。以16 pmol/L為例，需將12.8 mL溴氰菊酯母液邊滴邊攪拌至4 L去離子水中；隨后再梯度稀釋至8、4、2、1 pmol/L。實驗時分別將50 只四齡幼蟲放入盛有200 mL 5個不同濃度溴氰菊酯稀釋液的實驗組瓷盆中處理24 h，同時設(shè)置無溴氰菊酯對照組。對照組和5個濃度的實驗組分別設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。24 h 后記錄幼蟲死亡數(shù)量(幼蟲不能逃避機械刺激則判定為死亡)，實驗按規(guī)定進行3次生物學(xué)重復(fù)。Abbott′s 方法校正死亡率后，通過 Probit 分析獲得半數(shù)致死濃度(50% larval lethal concentrations，LC50)。

1.4 WHO成蚊接觸筒法

將白紙卷貼于恢復(fù)筒內(nèi)，連接好裝置，用吸蚊管捕捉20～25只羽化3 d雌蚊，吹入筒內(nèi)，關(guān)閉隔板；將0.05%溴氰菊酯藥膜卷貼在接觸筒內(nèi)，然后與恢復(fù)筒連接；把隔板抽開，將恢復(fù)筒內(nèi)蚊輕吹入接觸筒，迅速關(guān)閉隔板，將筒豎直放置，開始計算接觸時間；接觸1 h后，再抽開隔板，將蚊吹回恢復(fù)筒，關(guān)閉隔板，取下接觸筒(WHO, 2013) 。以 1 h 內(nèi)擊倒蚊作為敏感株(deltamethrin susceptible，DS)，未擊倒蚊作為抗性株(deltamethrin resistant，DR)(WHO, 2013) 。

1.5 蚊總 RNA 提取及質(zhì)量檢測

收集實驗室和現(xiàn)場品系雌蚊，5只/管放入無RNA酶EP管中，每管加400 μL RNAiso Plus。加RNA研磨珠研磨，后補加RNAiso Plus到1 mL, 室溫靜置5 min。加200 μL氯仿，劇烈震蕩30 s致溶液出現(xiàn)乳白色，室溫靜置10 min。離心機4℃，12 000 r/min, 離心15 min，取新無RNA酶EP管加400 μL異丙醇待用。小心吸取上清(約400 μL)，移至新的EP管，管內(nèi)有等體積的400 μL預(yù)冷的異丙醇，上下顛倒10次，溫和充分混勻，室溫10 min。離上清，避免倒掉沉淀，盡量將上清吸干，沿管壁加入1 mL預(yù)冷75%乙醇(乙醇∶DEPC=3∶1)。離心機4℃，7 500 r/min，離心5 min，棄乙醇，不要觸及沉淀。將沉淀室溫干燥5～10 min，加20 μL RNase Free dH2O溶解，即為RNA樣本。

用NanoDropTM2000/2000c分光光度計測定 RNA 樣本濃度和純度(OD260 nm/OD280 nm)；同時取 1 μL RNA 樣本加入9 μL 0.1% DEPC 水中，混勻后用瓊脂糖凝膠電泳儀鑒定 RNA 完整性。

表1 內(nèi)參及目的基因引物序列Tab.1 List of primers of the reference and target gene

1.6 蚊第1鏈 cDNA 合成

實驗按照 PrimeScriptTM RT Master Mix (Perfect Real Time)說明書操作。按照5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL+總RNA 500 ng，并補充RNase Free dH2O至10 μL配置反轉(zhuǎn)錄體系。輕柔混勻后按如下條件進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s。將獲得的反應(yīng)液稀釋 40 倍，用于后續(xù)熒光定量PCR 反應(yīng)。

1.7 熒光定量PCR

實驗按照 Power SYBR?Green PCR Master Mix 說明書操作。使用 Primer Express 3.0 軟件，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序提供的淡色庫蚊羧酸酯酶基因序列設(shè)計熒光定量PCR引物，引物由華大公司合成。引物序列見表 1。熒光定量PCR 反應(yīng)體系共20 μL：包含上游引物1 μL，下游引物1 μL，cDNA稀釋液8 μL，2×power SYBR Green Master Mix 10 μL。熒光定量PCR 反應(yīng)條件：步驟1：50℃，2 min，1個循環(huán)；步驟2：95℃，10 min，1個循環(huán)；步驟3：95℃，15 s，60℃，1 min，40個循環(huán)；步驟4：95℃，15 s，60℃，30 s，95℃，15 s，1個循環(huán)。

1.8 熒光定量PCR 數(shù)據(jù)分析

所有熒光定量PCR 反應(yīng)在 ABI PRISM 7300 PCR 儀上進行。在每輪熒光定量PCR反應(yīng)完成后，添加溶解曲線分析，判斷 PCR 擴增反應(yīng)的特異性。選擇β-actin作為內(nèi)參引物。使用 2-(ΔΔCt)的方法計算羧酸酯酶基因在敏感品系和抗性品系的相對表達量(Livaketal., 2001)。實驗包含 3 次技術(shù)重復(fù)及 3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.9 統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)用3次以上獨立實驗的平均值±標準差表示。組間比較采用Student′st-test分析。統(tǒng)計學(xué)顯著差異的標準是P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 淡色庫蚊實驗室抗性選育品系篩選

實驗室長期飼養(yǎng)的淡色庫蚊敏感品系，利用 WHO 推薦的蚊幼蟲浸漬法，測定其對溴氰菊酯殺蟲劑的半數(shù)致死濃度(LC50)為 0.03 mg/L，標記為“Lab-DS”(laboratory deltamethrin-susceptible)品系；抗性品系是以敏感品系為初始種群，以半數(shù)致死濃度(LC50)的溴氰菊酯經(jīng)多代篩選而成，測定其 LC50為 2.00 mg/L，標記為“Lab-DR”(laboratory deltamethrin-resistant)品系。

2.2 淡色庫蚊現(xiàn)場種群敏感株和抗性株區(qū)分

采集蚊幼蟲，在實驗室飼養(yǎng)至成蚊。選取羽化后3 d未吸血雌蚊，采用 WHO 成蚊接觸筒法(0.05%溴氰菊酯藥膜)區(qū)分敏感和抗性株?，F(xiàn)場種群的平均死亡率和敏感株平均擊倒時間見表2。

2.3 蚊總 RNA 提取及質(zhì)量檢測

2.3.1濃度與純度檢測:本研究分別提取淡色庫蚊實驗室Lab-DS/DR 品系及現(xiàn)場種群SH-DS/DR、GD-DS/DR、HM-DS/DR、JXZ-DS/DR品系羽化后3 d雌蚊的總 RNA，并對各樣本進行 RNA 濃度和純度的檢測。所有樣本總RNA濃度在700～1 500 ng/μL之間，OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0之間。

表2 現(xiàn)場種群平均死亡率和敏感株平均擊倒時間Tab.2 The average mortality and average knock-down time of susceptible strain in field populations

圖1 淡色庫蚊總RNA 樣本電泳圖Fig.1 Total RNA electrophoretogram of Culex pipiens pallensM：DL2000 DNA Marker；1-3：實驗室敏感株(Lab-DS)；4-6：實驗室抗性株(Lab-DR)；7-9：商河敏感株(SH-DS)；10-12：商河抗性株(SH-DR)；13-15：孤島敏感株(GD-DS)；16-18：孤島抗性株(GD-DR)；19-21：惠民敏感株(HM-DS)；22-24：惠民抗性株(HM-DR)；25-27：江心洲敏感株(JXZ-DS)；28-30：江心洲抗性株(JXZ-DR)。M: DL2000 DNA marker; 1-3: Laboratory deltamethrin-susceptible (Lab-DS); 4-6: Laboratory deltamethrin-resistant (Lab-DR); 7-9: Shanghe deltamethrin-susceptible (SH-DS); 10-12: Shanghe deltamethrin-resistant (SH-DR); 13-15: Gudao deltamethrin-susceptible (GD-DS); 16-18: Gudao deltamethrin-resistant(GD-DR); 19-21: Huimin deltamethrin-susceptible (HM-DS); 22-24: Huimin deltamethrin-resistant (HM-DR); 25-27: Jiangxinzhou deltamethrin-susceptible(JXZ-DS); 28-30: Jiangxinzhou deltamethrin-resistant(JXZ-DR).

2.3.2電泳鑒定：利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定所提取樣本總RNA 的完整性。結(jié)果如圖 1 所示，RNA 條帶清晰，邊緣銳利，未發(fā)生明顯降解。

2.4 熒光定量PCR結(jié)果

實驗室采用熒光定量PCR方法檢測羧酸酯酶基因(CPIJ002786-RA)在淡色庫蚊實驗室品系和現(xiàn)場種群中的表達水平。結(jié)果顯示羧酸酯酶基因(CPIJ002786-RA)在Lab-DR品系的表達水平是Lab-DS品系的2.77倍(P<0.01，圖2)。在現(xiàn)場種群中(圖3)，羧酸酯酶基因(CPIJ002786-RA)在SH-DR株的表達水平是SH-DS株的3.63倍(P<0.05)，在GD-DR株的表達水平是GD-DS株的5.67倍(P<0.05)，在HM-DR株的表達水平是HM-DS株的2.75倍(P<0.01)，而在JXZ-DR株的表達水平是JXZ-DS株的0.80倍(P>0.05)。以上結(jié)果提示淡色庫蚊羧酸酯酶基因(CPIJ002786-RA)可能與溴氰菊酯抗藥性密切相關(guān)，具有作為蚊抗藥性現(xiàn)場檢測靶標的潛在應(yīng)用價值。

圖2 羧酸酯酶基因(CPIJ002786-RA)在實驗室敏感和抗性品系中的相對表達水平Fig.2 The relative expression level of carboxylesterase (CPIJ002786-RA) in laboratory deltamethrin-susceptible (Lab-DS) and -resistant (Lab-DR) strains

圖3 羧酸酯酶基因(CPIJ002786-RA)在現(xiàn)場種群中的相對表達水平Fig.3 The relative expression level of carboxylesterase (CPIJ002786-RA) in field populationsDS: 敏感株; DR: 抗性株。SH: 商河; GD: 孤島; HM: 惠民; JXZ: 江心洲。DS: Deltamethrin-susceptible strain; DR: Deltamethrin-resistant strain. SH: Shanghe; GD: Gudao; HM: Huimin; JXZ: Jiangxinzhou.

3 討論

昆蟲對殺蟲劑抗藥性機制一般分為代謝抗性、靶標抗性和表皮抗性(吳有剛等, 2019)。通常代謝抗性主要通過改變體內(nèi)蛋白水平或增強解毒酶活性發(fā)揮作用，如細胞色素P450解毒酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)等(Zengetal., 2021)；靶標抗性通過昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)靶標位點的突變發(fā)揮作用，如鈉離子通道突變(VGSC)等(Kareemietal., 2021)；表皮抗性通過導(dǎo)致昆蟲生理結(jié)構(gòu)的改變，如表皮增厚，從而減少殺蟲劑的吸收和滲透(Sohetal., 2021)。

在前期高通量轉(zhuǎn)錄組測序的研究中，我們發(fā)現(xiàn)羧酸酯酶基因(CPIJ002786-RA)在淡色庫蚊溴氰菊酯抗性品系較敏感品系顯著高表達(P<0.05)。許多昆蟲羧酸酯酶被認為在催化有機磷、氨基甲酸酯類或擬除蟲菊酯類殺蟲劑降解過程中發(fā)揮重要作用。對3個新的羧酸酯酶基因進行分子和功能鑒定，發(fā)現(xiàn)其在致倦庫蚊對氯菊酯抗藥性過程中，通過轉(zhuǎn)錄過表達、代謝增強和解毒過程發(fā)揮作用。通過對兩個羧酸酯酶基因CarE001A和CarE001H的功能鑒定，包括重組蛋白表達、代謝分析和同源建模與分子對接分析等，發(fā)現(xiàn)其在棉鈴蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的解毒過程中發(fā)揮重要作用(Lietal., 2020)。多個羧酸酯酶基因在氯菊酯抗性品系家蠅中顯著高表達，同樣利用同源建模與對接發(fā)現(xiàn)氯菊酯配體與羧酸酯酶蛋白的相互作用，進一步證實了羧酸酯酶在家蠅中的代謝功能(Fengetal., 2020)。結(jié)合本研究結(jié)果，我們預(yù)測淡色庫蚊羧酸酯酶基因(CPIJ002786-RA)，可能通過代謝增強參與溴氰菊酯抗藥性。

前期蚊抗藥性現(xiàn)場檢測的主要方法是生物測試法。這需要從現(xiàn)場采集大量蚊蟲樣本帶到實驗室飼養(yǎng)，不僅操作復(fù)雜，且在繁殖子代進行測定時，難以控制各方面影響因素，可能降低檢測結(jié)果的準確性。研究提示，CYP6AA9(Wangetal., 2015)、miRNA-278-3P(Leietal., 2015)等多個基因或調(diào)控因子可能作為蚊抗藥性現(xiàn)場檢測靶標，應(yīng)用于蚊媒防治現(xiàn)場。

本研究證實了羧酸酯酶基因(CPIJ002786-RA)在實驗室抗性選育品系較敏感品系顯著高表達(P<0.01)。羧酸酯酶基因(CPIJ002786-RA)將作為潛在分子靶標，應(yīng)用于蚊抗藥性現(xiàn)場檢測。在實踐中，本研究發(fā)現(xiàn)羧酸酯酶基因(CPIJ002786-RA)在山東省商河鎮(zhèn)、孤島鎮(zhèn)和惠民鎮(zhèn)的抗性株較敏感株顯著高表達(P<0.05)，而在江蘇省江心洲抗性株和敏感株無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。

不同遺傳背景的蚊蟲，在抗藥性產(chǎn)生過程可能演變出不同機制，如代謝解毒基因或靶標位點突變的差異(Zhong, 2011)。由于各個國家、地區(qū)優(yōu)勢蚊種和使用殺蟲劑種類的差別，蚊媒抗藥性的產(chǎn)生和發(fā)展呈現(xiàn)不同水平，在分子水平則表現(xiàn)為不同抗藥性相關(guān)基因的差異表達(Bonizzonietal., 2012)。本實驗室篩選的實驗室品系來源于山東唐口鎮(zhèn)，與商河鎮(zhèn)、孤島鎮(zhèn)和惠民鎮(zhèn)同屬于山東省，地理位置上相距較近，因此羧酸酯酶基因(CPIJ002786-RA)的表達趨勢較為一致，即抗性株較敏感株顯著高表達(P<0.05)，而在江蘇省江心洲無顯著統(tǒng)計學(xué)差異，可能是抗藥性機制不同所致，江蘇省江心洲與上述4個地點地理位置上相距較遠，蚊蟲遺傳背景差異較大，使用的殺蟲劑種類差別也較大等因素，羧酸酯酶基因(CPIJ002786-RA)可能不是其主要的調(diào)控因素。

綜上所述，淡色庫蚊羧酸酯酶基因(CPIJ002786-RA)可能與溴氰菊酯抗藥性密切相關(guān)，具有作為蚊抗藥性現(xiàn)場檢測靶標的潛在應(yīng)用價值，但同時也受到不同地區(qū)蚊蟲遺傳背景差異的影響，需要綜合考量。